材料和试剂

31 G针（BD，货号：08290-3284-18）
0.45 μ 米聚醚砜膜（VWR，目录号：28145 - 505）
BICA板：96孔低位连接板（Corning，目录号：3474）
骨钳（FST，目录号：16025-14 ）
pwpt -GFP（Addgene ，目录号：12255）
pMD2.G（Addgene ，目录号：12259）
psPAX2（Addgene ，目录号：12260）
合格的胎牛血清，美国（Gibco，目录号：26140079）
带有GlutaMAX TM 补充包1的DMEM / F-12 （Gibco，目录号：10565018）
E thanol（KOPTEC，目录号：64-17-5）
胰蛋白酶化（用胰蛋白酶0.25％溶液; HyClone公司，目录号：SH30042.01）
盐水（Teknova ，目录号：S5815）
10x萤光素酶底物D-萤光素（Goldbio ，目录号：LUCNA-1G）
文化媒体（请参阅食谱）

设备

微解剖剪刀（Roboz ，目录号：RS-5912）
微解剖钳（Roboz ，目录号：RS-5135）
IVIS Lumina II 体内成像系统（PerkinElmer ）
解剖显微镜（带KL200 LED光源的Leica S6E立体显微镜）
CO 2 孵化器（热小号系统求解，FORMA系列II水套）
流式细胞仪

软件

实时影像软件-IVIS Lumina系列（PerkinElmer，v4.2 ）

程序

腔内动脉注射（IIA）
细胞准备
根据研究目的，IIA注射可以使用不同来源和癌症类型的不同癌细胞系进行。我们通常使用萤火虫荧光素酶标记的癌细胞，其进程可以通过生物发光信号进行监测。荧光素标记的肿瘤细胞的制备在我们以前的ST被描述乌德（王等人，2017年）。简而言之，用Fluc -GFP融合基因替换pwpt -GFP（Addgene ＃12255）的GFP域。转染的293T细胞用5微克pwpt - Fluc的-GFP矢量，与1.75微克pMD2.G沿（Addgene公司＃12259）和3μgpsPAX2（Addgene公司＃12260）在一个10厘米细胞培养皿到包慢病毒。48小时后，过滤上清液通过0.45 μ 米聚醚砜膜（VWR），其将作为慢病毒股票。用Fluc -GFP慢病毒和4 mg / ml聚丙烯处理癌细胞8小时。培养72小时后，通过FACS 分离GFP阳性细胞。通过遵循其相应的培养方案来维持细胞。

收获后，用胰蛋白酶消化（用胰蛋白酶0.25％溶液），洗涤癌细胞并将其重悬于冰冷的无菌生理盐水（Teknova ）中，使其浓度为5 x 10 6 细胞/ ml 。
将细胞悬浮液置于冰上。
小鼠准备
根据进行研究的目的，选择适当性别和年龄的小鼠。值得注意的是，不同物种（例如，人类和小鼠）或染色剂之间的免疫排斥反应不会在离体培养中得以保留。因此，研究人员可以在determin更宽容的选择在克小鼠品系使用。

麻醉和无菌程序应遵循研究机构IACUC批准的标准操作程序。

IIA注射程序
在此步骤中，我们通过外部ilia 动脉选择性注入癌细胞，从而将癌细胞加载到小鼠的后肢中。在这里，我们简要介绍IIA的主要步骤，将其作为BICA样品制备的基础工作。这个过程的细节都在我们以前的出版物精心描述（王等人，2015年;玉等人。，2016），这是本研究的主要范围了。

抑制二对麻醉小鼠一每或塑料板。
在右下腹部的第4和第5乳头之间切1.5厘米的皮肤切口。
在解剖显微镜下进行钝器解剖以分离肌肉并暴露总动脉。
用31 G针将0.1 ml细胞悬液注入the动脉。
通过用棉签按压注射的动脉来止血（约10分钟）。此步骤可能需要5-10分钟。
在麻醉和无菌条件下，将鼠标放在温暖的加热垫上30分钟，使癌细胞归巢到合适的位置。

图1. IIA注射示意图。荧光素酶标记的癌细胞被接种到小鼠的外动脉中，可通过生物发光成像进行追踪。

BICA样品的制备
为了减少的机会就微生物- 污染，这一步应该在无菌环境中，如层流室中进行。

博NE集合
接受-内注射后30分钟，按照研究机构IACUC批准的标准操作程序对小鼠实施安乐死。
SPR 一个y中的小鼠身上，特别是腿接收IIA注射用70％乙醇消毒。
延长用于IIA注射的切口，并剥离后肢皮肤。
用剪刀小心地除去肌肉和腱。
用消毒的纱布擦拭骨头，清除残留的非骨组织，从而充分暴露股骨和胫骨。
骨修剪
在无菌的6 cm细胞培养皿中，切掉股骨的远端骨epi和干meta端以及胫骨的近端骨physi和干meta端。这些部分是大部分富集定殖癌细胞的骨组织。
用消毒的骨钳（FST）压碎骨组织，用解剖剪刀（Roboz ）将骨碎片修剪成均匀的大小（直径0.5-1.5 毫米）。
注意：由于癌细胞与骨基质之间已经形成紧密的相互作用，因此在此期间癌细胞被限制在骨碎片中。但是，请勿将样品暴露在空气中5分钟以上。

快速骨碎片转移到预装低附件96孔板用200 μ 升培养基（每孔一张）。如有必要，将来自不同小鼠的骨骼碎片随机分成不同的组设置。

（Ô ptional）基线强度的通过生物发光成像观察
缺乏经验的研究人员可能会相应地在碎片大小和癌症负荷方面造成较大偏差。在该S Ç enario，生物发光强度数据中观察到更高版本可以在被划分d AY 0（或d 着y 1）相同的片的信号强度，以产生归一化值，这将有助于减少组内偏差。

生物发光成像
使用多配板将10x萤光素酶底物D-萤光素添加到样品孔中。
图像板的IVIS Lumina的II机。视场= D; 装箱=中; F / Stop =曝光时间可以根据癌细胞的生物发光强度进行调整（增加或减少）。
更换含有D-萤光素的培养基
残留的底物可能耗尽癌细胞表达的萤光素酶，因此会干扰将来的测量。因此，每次成像后，我们都需要更换介质以去除残留的基材。

使用多管移液器去除孔壁上的培养基。避免碎片抽吸。
冲洗每个孔用200 μ 灭菌PBS升。
使用多吸管沿孔壁除去PBS。避免碎片抽吸。
加入200 μ L淡水培养基中，以每孔。

离体培养和成像
培养的持续时间和成像频率取决于BICA样品中所装载细胞的特性。通常，鼠类癌细胞的发展要快于人类细胞。乳腺癌细胞的发展要快于前列腺癌细胞。两者与它们在体内的生长动力学一致。

BICA文化
在含5％CO 2 的37 °C培养箱中培养BICA样品。在低氧条件下监测癌症生物学的研究中，可以使用缺氧室代替细胞培养箱。
每隔3 -4天或当介质变为橙黄色时，请更换介质。
每周至少一次通过生物发光成像测量BICA板。
骨残余细胞的特征可以维持长达2个月。
生物发光成像
骨殖民化的癌细胞通常紧密地锚定在骨基质中。漂浮的癌细胞非常罕见，不会中断生物发光强度的测量。

使用多移液器将10x萤光素酶底物D-萤光素添加到样品孔中。
用IVIS Lumina II机器成像板。视场= D; 装箱= 中; F / Stop = 1。可以根据癌细胞的生物发光强度来调整（增加或减少）暴露时间。
更换含有D-萤光素的培养基：
使用多管移液器去除孔壁上的培养基。避免碎片抽吸。
冲洗每个孔用200 μ 灭菌PBS升。
使用多吸管沿孔壁除去PBS。避免碎片抽吸。
加入200 μ L淡水培养基中，以每孔。
免疫组织化学（IHC）和免疫荧光（IF）成像
IHC / IF染色是BICA的扩展应用之一。如果需要，将BICA组织用4％多聚甲醛固定过夜，并用14％EDTA脱钙五天。石蜡包埋了用于微切片的样品。ALP和CTSK可以分别用作成骨细胞和破骨细胞的标志物。更多的细节可以在我们以前的研究发现（王等人，2015年，2017年和2018年）。

数据分析

以后观察到的生物发光强度数据可以用原始强度或标准化强度来解释。在后者的情况下，划分生物发光强度由所述同一块的信号强度上的0天（或第1天），这可有助于减少组内偏差（图2 ）。

图2.通过原始读数（左）或归一化强度（右）对从前列腺癌细胞系22rv1的BICA样品中获得的生物发光信号进行定量。SD ＝平均值的0.38倍（左）。SD =平均值的0.32倍（右）。

菜谱

文化传媒
具有人癌细胞系的BICA样品：DMEM / F12 + 2％FBS

具有小鼠癌细胞系的BICA样品：DMEM / F12 + 0.5％FBS

致谢

我们感谢张实验室成员的有益帮助。XH-FZ得到了美国国防部DAMD W81XWH-16-1-0073，NCI CA183878，乳腺癌研究基金会和麦克奈尔医学研究所的支持。硬件得到美国国防部DAMD W81XWH-13-1-029 6。

该协议是有关Wang 等人的详细技术摘要。（2018 ）Cancer Cell 34（5）：823-839和Wang 等。（2017 ）Nat Commun 8：15045 。

利益争夺

作者声明没有竞争的经济利益。

伦理

所有动物工作均按照贝勒医学院的动物保健指南进行。

参考文献

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