材料和试剂

96 - 瓦特ELL平底平板（Millipore公司Sigma公司，目录号：CLS3997）
96 - 瓦特ELL孔圆底板（Millipore公司Sigma公司，目录号：CLS3999）
8孔显微镜微片，经组织培养处理（ibidi ，目录号：80826-90）
Steritop 真空过滤器灭菌器，0.22 µm，GP Millipore Express Plus膜，150 ml漏斗，颈部尺寸为45 mm（Millipore，目录号：SCGPT01RE）
Amicon Ultra-4离心过滤器单元，10 kDa （Millipore，目录号：UFC801096），用于缓冲液交换
移液器吸头（USA Scientific TipOne ，目录号：1111-0006）
1.5 ml Eppendorf管
3 ml超速离心管
100％绵羊红细胞（在2-8 °C下保存长达一个月，创新研究，IC100-0210-26568）
人上皮MCF-7乳腺癌细胞（ATCC，目录号：HTB-22）
70％乙醇
脑心浸液（BHI）培养液（GIBCO，Fisher Scientific公司，目录号：211059）和琼脂（Fisher Scientific公司，Ç atalog号：B11065）
Vegitone 输液肉汤（Millipore，默克，目录号：41960-500G-F）
Optiprep 密度梯度介质（Sigma，目录号：D1556-250 ML ）
BODIPY TM FL C12（4,4-二氟-5,7-二甲基-4-硼3a，4a-二氮杂-s-茚并-3-十二烷酸）（分子探针，赛默飞世尔科技，目录号：D-3822 ）
牛血清白蛋白（BSA）级分V，pH为7.0（小号撕毁在2-8 ℃下，MP Biomedicals公司，目录号：810034）
二硫苏糖醇（DTT），ü SE股票稀释液保持在-20 ℃下不超过几个月（小号撕毁在-20 °C，Invitrogen公司，目录号：15508-013）
重组LLO（rLLO ）（小号在-20撕℃下以小等分试样，以避免FREEZ -thaw周期，Abcam公司，目录号：ab83345）
胰蛋白酶-EDTA（0.05％），苯酚红（可在-20 °C下干燥2年，使用前解冻并保持在2-8 °C下，Gibco，Thermo Fischer Scientific，目录号：25300054）
Dulbecco改良型Eagle培养基（DMEM;康宁，目录号：10-013-CV），补充有10％FBS（Millipore Sigma，目录号：TMS-016-B），GlutaMAX （Thermo Fisher Scientific，目录号：35050061），非必需氨基酸（Thermo Fisher Scientific，目录号：11140076）和Gibco抗生素-抗真菌药（Thermo Fisher Scientific，目录号：15240096）
不含酚红（Thermo Fisher Scientific，目录号：11054020 ）和10％FBS（Millipore Sigma，目录号：TMS-016-B），GlutaMAX （Thermo Fisher Scientific，目录号：35050061）和非必需氨基酸的DMEM （Thermo Fisher Scientific，目录号：11140076）
Hoechst 33342（1 µg / ml； Thermo Fisher Scientific，目录号：H3570）
TrypLE （Thermo Fisher Scientific，目录号12604013）
磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4，细胞培养等级（Corning，目录号：21-031-CV）
4％多聚甲醛（PFA;电子显微镜科学，目录号：15710）
庆大霉素（Thermo Fisher Scientific，目录号：1571064 ）
0.02％叠氮化钠（Sigma，目录号：S2002-5G）
H Cl （Fisher Scientific，目录号：A144-212）
HEPES（Sigma，目录号：H3375）
NaCl （Fisher Scientific，目录号：S271）
DMSO（Sigma，目录号：D2650）
RBC裂解缓冲液（请参见食谱）

设备

带有SW Ti 55转子的超速离心机（Beckman，型号：Optima-XL ）
Sorvall 离心机（Sorvall RC 5C Pl us）
Sorvall GSA定角转子
聚碳酸酯超速离心管，3 ml（贝克曼库尔特公司，目录号：355635）
超清晰管，25 x 89mm，38.5 ml（Beckman Coulter，货号：344058）
多角度粒度分析仪（布鲁克哈芬仪器公司，90Plus / BI-MAS）
微生物摇动培养箱，热水浴
对于大体积的培养物，超滤或离心德维克的EV隔离ES [ 的Amicon 搅拌池模型8200，将200ml（带有N 2 源的Ultracel 100 kDa 超滤盘（Millipore，目录号：WW-29968-16）（Millipore，目录号：PLHK07610）]
Nalgene 250毫升离心瓶（Thermo Fischer Scientific，目录号：3120-0250）
多道移液器（BrandTech 小号系统求解公司。，Transferpette 小号-12多道移液器，目录号：703730）
斑点印迹装置（如生物点® 微量过滤系统（BIO - - [R 广告，目录号：1703938）或手动应用样品膜）
配备以下功能的DeltaVision Elite高分辨率反褶积显微镜（GE Healthcare）：
甲科学CMOS照相机（芯片尺寸：2560×2160个像素）
甲Ñ ULTR aFast 固态照明
一个用于活细胞成像的环境实验室
甲60X（NA 1.42）油浸objectiv ë
UltimateFocus 模块

软件

SoftWoRx（Applied Precision，www.gelifesciences.com）
ImageJ / FIJI（http://fiji.sc/）

程序

使用协议A隔离EV，并将其放在保留其稳定性的缓冲区中。根据我们的经验，我们可以将EV保持4天的1-2天 °C且不损失收率，但我们努力尽快使用它们。如果下游分析允许，我们可以在超滤设备的浓缩步骤中添加0.02％叠氮化物，以防止微生物生长。可以通过超速离心或用10-50 KDa 膜透析来进行缓冲液交换。

对于单核细胞增生李斯特菌电动车，我们使用pH 5.5的PBS来最大化LLO蛋白的活性。对于任何其他用途，适当的生理相关缓冲液（例如PBS pH 7.4）是合适的。对于保护测定和活性，请考虑执行缓冲液交换以最大程度提高酶活性的需求。

从单核细胞增生李斯特菌培养物制备细胞外囊泡（图1）
接种过夜（16 ħ ）的培养李斯特菌株，野生型和Δ hly启动琼脂平板在1L BHI肉汤中，从BHI 一个4升烧瓶中，在37℃，同时以180rpm振摇。
第二天（约16-18小时后），倾从4升烧瓶加到250ml的Nalgene瓶离心培养物，并且离心培养物以10,000 RPM（8 ，800 ×g下用于SORVALL GSA固定角转子），在30分钟4 °C 。
从瓶中倒出上清液，小心不要破坏沉淀。倾superna TA 通过0.22μm的NTS Steritop 真空过滤到无菌瓶，并保持他们在冰上。无需保持完全无菌，但我们尽可能使用无菌材料来减少污染。
如果下游应用允许，则将最终浓度为0.02％的叠氮化钠添加到每个过滤的上清液中，以防止细菌滋生。
通过用蒸馏水彻底漂洗清洁系统超滤（aprox的。1/4系统的体积），随后漂洗，用乙醇70％（aprox的。该系统的体积的1/8），以尽量减少交叉污染和细菌生长。
一次（用N 2 流）将上清液每次倒入300 ml Amicon 超滤系统中，直到所有上清液都通过100 kDa 截止过滤器。
当大约3-9毫升“富含囊泡”的上清液未通过过滤器时，请关闭Amicon 过滤系统。
轻轻移液并将其浸入过滤器顶部以重悬细胞外囊泡，然后将富集囊泡的上清液转移至3 ml超速离心管中。任何未完全充满的试管应在顶部用PBS pH 5.5（1x PBS用HCl调节至pH 5.5）填充。离心前确保试管平衡，并按照说明进行操作，以防止离心过程中试管塌陷。
超速离心机的制剂在100 ，000 X 克用于贝克曼SW 1个小时的Ti 在4℃下与制动设定为低55转子（慢制动提高EV收率）。
以平稳连续的方式倾倒上清液，注意不要让上清液倒流并干扰EV沉淀。
通过将沉淀重新悬浮在pH 5.5的PBS中，重复超速离心。然后用PBS pH 5.5（1x PBS用HCl调节至pH 5.5）将试管填充到顶部。离心前确保管平衡。超速离心机的制剂在100 ，000 X 克用于贝克曼SW 1个小时的Ti 在4℃下与制动设定为低55转子。
轻轻地连续倒出PBS，再次注意不要让上清液倒流。
将100-500 µl pH 5.5 PBS（或其他生理缓冲液）加到EV沉淀中，轻轻重悬沉淀并转移到1.5 ml Eppendorf中。尽快使用。

D：\ Reformatting \ 2019-12-23 \ 1902711--1264 Carolina Coelho 734818 \ Figs jpg \ Fig1.jpg

图1. 细胞外囊泡（EV）隔离图

使用密度梯度Optiprep （图URE 2）
对于密度梯度，请在10 mM HEPES和0.85％NaCl中制备Optiprep 溶液，其浓度分别为60％，35％，30％，25％，20％，15％和10％。
将75 µl EV与225 µl 60％Optiprep混合至终浓度为45％Optiprep，并置于3 ml超速离心管的底部。通过逐滴移入管壁，以逐步梯度的方式将Optiprep 溶液分层：450 µl 35％，450 µl 30％，450 µl 25％，450 µl 20％，300 µl 15％和300微升10％。
在Beckman SW Ti 55转子中在4°C下以180,000 xg的转速离心3 h 并缓慢破碎。
收集10个等体积e的馏分，大约270 µl（从试管顶部开始）。
对于电子显微镜（或需要去除Optiprep的应用），请通过洗涤样品去除Optiprep 。将PBS pH 5.5添加到新的Ultracen 离心管中，然后以120,000 x g 离心45分钟。重复次是洗。将样品重悬于PBS中，以进行进一步分析（通常约为200 µl）。对于某些应用程序，请使用仅Optiprep的样本（例如，成像背景），以丢弃任何伪影。
通过将它们直接应用于斑点印迹仪（无需去除Optiprep 进行斑点印迹）来估计每个级分中的LLO含量（或其他可通过免疫印迹检测的蛋白质）（Coelho 等人，2019）。

D：\ Reformatting \ 2019-12-23 \ 1902711--1264 Carolina Coelho 734818 \ Figs jpg \ Fig2.jpg

图2.细胞外血管（EV）的密度梯度分离图和后续分析

保护测定（图3）
在pH 5.5 PBS缓冲液中制备500 mg / L胰蛋白酶
使用10 kDa 截止中心轴滤器将Gibco细胞培养级胰蛋白酶（0.05％胰蛋白酶（500 mg / L））的缓冲液与PBS pH 5.5 交换。将离心机在4°C下离心30分钟。根据本方案中所述的体积，对照和技术重复，该试验的每个重复均需要大约70 µl胰蛋白酶。
在过滤器顶部添加更多pH 5.5的PBS，然后再次离心。继续用pH 5.5 PBS进行缓冲液交换，直到粉红色溶液变为无色（指示已去除细胞培养缓冲液），然后将浓缩的胰蛋白酶重悬于原始体积的细胞培养胰蛋白酶中。
添加22.5微升胰蛋白酶与300μl的野生型EV的和Δ hly启动EV制剂。对于未消化的对照，将22.5 µl pH 5.5 PBS代替胰蛋白酶添加到200 µl每种EV制剂中。通过组合制备两种另外的对照Δ hly启动- 电动汽车用重组rLLO 到13的终浓度nM的用和未加胰蛋白酶LLO的。这些添加了rLLO的样品是未保护/未囊泡封装的LLO的阳性对照，因此很容易发生蛋白水解降解。在添加了胰蛋白酶的样品中，胰蛋白酶将消化所有囊外rLLO，而仅PBS的样品中的囊外rLLO 应保持溶血活性。
准备所有样品的技术重复样品（或三份样品）。相同的比例和浓度适用于较大的体积，因此最终的胰蛋白酶浓度约为35 mg / ml，或者可以将75 µl的0.05％胰蛋白酶添加到1,000 µl的囊泡或上清液制剂中。

在定轨摇床上（或任何其他形式的轻柔搅拌）在37°C下孵育样品30分钟至一个小时。孵化与胰蛋白酶超过1 他不推荐，因为电动车的稳定性可能会被延长胰蛋白酶暴露受到损害。
在消化过程中，准备红细胞（RBC）和RBC裂解缓冲液用于活性测定。
准备RBC裂解缓冲液（配方1），并在不使用时保持冷藏。如果无菌，将在4°C下保持几个月。
通过将100 µl 100％羊RBC添加到10 ml缓冲液中并在4°C下以500 xg离心10分钟，在pH 5.5 PBS + 0.1％BSA中洗涤RBC 。
重悬于10 ml RBC裂解缓冲液中，制成1％RBC溶液。加入DDT使其浓度为5 mM（LLO的最大活性），以使裂解过程中的最终浓度为2.5 mM DTT。
孵育后，在96圆底平板中的RBC裂解缓冲液中按1：3顺序稀释样品。在第一行中加入150 µl样品，然后在第二行中吸取50 µl样品（含100 µl缓冲液）。每个孔中的最终体积应为100 µl稀释样品。不要继续稀释到最下面一行，并将其留作RBC裂解缓冲液的空白。圆形底板可更好地分离RBC沉淀物，以用于后续步骤。
向每个孔中加入100 µl 1％RBC溶液，并在37°C的轨道摇床上温育一小时，以进行裂解。
离心机96 - 孔板在500 5分钟XG 沉积物未裂解的红细胞。
从每个孔转移100μl的上清液到新的96 - 孔平底板，同时小心不破坏红细胞沉淀。
读取板在492 nm和562 nm处的吸光度。在这些波长下的高吸光度对应于上清液中血红蛋白的存在。存在的血红蛋白越多，LLO样品的溶血活性越高。受保护免于蛋白酶降解的样品（即在EV囊泡内），即使与胰蛋白酶一起孵育，也将保持其溶血活性。细胞外LLO将被降解，因此较低的血红蛋白将被释放。

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图3. 细胞外囊泡（EV）的保护性测定和裂解活性测量图

用于高分辨率活细胞显微镜检查的BODIPY TM FL C12 标记方案（图4）
从板或甘油储备液中开始细菌的发酵培养。在适当的媒体中成长。对于单核细胞增生李斯特氏菌，我们使用了Brain Heart Infusion肉汤或Vegitone 肉汤。
制备细菌的两个相同的培养物在1 μ 中号的BODIPY TM FL C12 通过从单一电镀菌落，或1个接种在细菌培养物培养基中稀释（或其它BODIPY-脂肪酸偶联物）μL 起子培养物，在1毫升Vegitone 肉汤。生长16-20小时或直到它们达到早期静止期。对于成像实验，我们使用了少量细菌（最多5 ml细菌），并在30 °C 搅拌下生长以抑制LLO的产生。对于其他研究，我们在37 °C的条件下生长了较大的体积（最大1 L），并发现实验易于扩大规模。考虑需要使用适当体积的媒介物（DMSO）包括未标记的细菌控制。
通过在室温下以2,000 xg离心2分钟将未结合的BODIPY TM FL C12 洗掉，以分离细胞和培养基，并用冰冷的PBS洗涤两次，其体积约为细胞沉淀体积的10倍，以进行大量制备；以及用1 ml 的PBS进行成像所需的低倍。细胞沉淀应为粉红色。为了成像，将其重悬于1 mL完全补充的无酚红DMEM中，不使用抗生素。确定在600 nm波长处的光密度（OD）。
仅取一个装有细菌的试管，并用它来制备灭活的细菌对照（对于单核细胞增生李斯特菌，根据培养物和细胞沉淀的体积，我们在70 °C下使用10分钟-2小时）。被杀死的细菌可作为脂质或碎片从死细胞中被动释放与健康细胞主动分泌EV的对照。其他杀死方法也适用，只要它们能使细胞保持相对完整。将健康的细菌细胞放在冰上的第二个试管中，以阻止此期间的生长。杀死细胞后，您现在可以生长并收集BODIPY 标记的EV（请参阅步骤D5）或进行成像（请参阅步骤D6）。或者，继续制作带有BODIPY标签的电动汽车。
对于收集BODIPY -标记的电动车：生长细胞6小时（或MOR 在500 E）ml至1 L淡水介质，包括的杀死细胞控制和未标记的cellls 。在适当的时间后，继续执行EV隔离程序规程A。请注意，由于将BODIPY- 脂肪酸共轭物成功掺入EV中，因此EV沉淀应为淡粉红色。我们证实掺入BODIPY TM FL C12到电动汽车通过使电动车从健康的细菌细胞以密度梯度分离，结果发现，在活细胞BODIPY TM FL C12信号是在与可观察到的电动汽车相同的级分中发现（Coelho的等人。，2019）。
现在可以对细胞进行成像了：将BODIPY 标记的细菌添加到哺乳动物细胞中，以进行感染研究或测试其他实验条件。
对于MCF-7成像实验，在感染前24小时，将30,000个MCF-7细胞均匀接种在8孔ibidi 成像室的每个孔中。
根据OD值，假定感染前MCF-7细胞增加一倍（大约60,000个细胞），计算10-50个感染复数（MOI）所需的细菌细胞量。假设OD = 1为1 x 10 9 单核细胞增生李斯特/毫升（如果使用其他生物，该比率可能会改变）。
一种。使用MOI和细胞密度计算所需的细菌数。感染时60,000个MCF-7细胞被MOI 10 → 60,000 x 10 = 600,000细菌感染

b。细菌/米的计算数升使用OD测量，并知道在悬浮液OD和细菌浓度之间的关系。悬浮液中细菌的测得OD为0.5 → 1 x 10 9 细菌/ ml x 0.5 = 5 x 10 8 L单核细胞增生李斯特/ ml 。

C。计算将细菌添加到细胞所需的悬浮液体积。至600,000细菌添加到细胞中，calcula 在（TED 一个）从悬浮液5的X 10 8 单增李斯特菌/米升，在（计算b ）→ 600000 ÷ 5 X 10 8 = 0.0012 ml的= 1.2 微升。

感染后30分钟至1小时后，将培养基换成200 µl 完全补充的，不含苯酚红的DMEM，其中含有100 µg / ml的他米生素。

从感染后2-3小时开始执行活细胞成像，或使用预热的成像室在4％多聚甲醛中将细胞固定15分钟。
使用60倍油浸物镜在37 °C下获取活细胞高积垢图像。使用60倍油浸物镜在室温下对固定的细胞成像。感染，活MCF-7细胞的延时成像以1个图像/ 5秒为短暂的时间（执行例如，2 分钟），小心地限制光漂白。
为了获得最高的分辨率，请使用Softworx对使用DeltaVision 显微镜采集的图像进行反卷积。
使用ImageJ / FIJI软件分析单个时间点图像和时间序列图像集，该软件提供了许多用于图像表示和量化表型的插件。例如，使用“ Cell Counter”插件对每个单元格的BODIPY TM FL C12 点数（EV）进行评分。通过使用“ Manuel Tracking”插件按时间序列跟踪BODIPY TM FL C12 点的位置，对亚细胞EV动态进行评分。

D：\ Reformatting \ 2019-12-23 \ 1902711--1264 Carolina Coelho 734818 \ Figs jpg \ Fig4.jpg

图4. 用于单核细胞增生李斯特氏菌感染期间EV分泌的实时成像的BODIPY TM FL C12标记图

[R ecipes

RBC裂解缓冲液
将BSA溶于pH 5.5 PBS中至终浓度为0.1％BSA （w / v）

致谢

AC获得了美国国立卫生研究院（NIH）奖项5R01HL059842、5R01AI033774、5R37AI033142和5R01AI052733的支持。Figu res 1-4中的示意图是使用BioRender.com创建的。

我们感谢Casadevall 实验室的前任成员多年来对协议的优化。标记方案由Anne Hamacher -Brady和Nathan R. Brady 设计和优化。

利益争夺

我们声明没有利益冲突。

参考文献

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