材料和试剂

3.0 ml无抗凝剂的真空血管（BD Vacutainer，目录号：366703）
24孔板（Greiner Bio-One CELLSTAR，目录号：662-160）
96孔板（Greiner Bio-One CELLSTAR，目录号：687-100）
标准移液管尖端与20的体积容量微升和1000 微升（的Eppendorf ，目录号：22491911和22491351）
去离子水
人血
生物材料表面（平均顶部面积〜25 mm 2 ）
真空线
标记（来自任何商业来源）
70％乙醇
PBS（请参阅食谱）

设备

酶标仪（BMG LABTECH，FLUOstar Omega）
卧式振动筛（VWR，目录号：97109-890）
测量移液器（Eppendorf，目录号：ES-20F和ES-1000F）
计时器（来自任何商业来源）
镊子（任何商业来源）
板凳

软件

软件Omega 和MARS数据分析（BMG LABTECH ，https: //www.bmglabtech.com/reader-control-software/ ）
Microsoft Excel或Origin软件（OriginLab ，https : //www.originlab.com/ ）

程序

注意：对于抽油烟机每个表面的三个样本，所有程序都要进行两次（使用来自两个不同供体的血液）。

Biomater IAL 消毒
将生物材料表面放在24孔板的每个孔中。在每个时间点（15、30和45分钟）准备一块板，并在相应的时间点在盖上贴上标签。
加入500 微升的乙醇，在室温下5分钟。
吸出乙醇并用500冲洗生物材料表面三次微升PBS中。
吸出PBS并冲洗所述生物材料的表面一旦用500 微升去离子水中。
吸入去离子水，并使生物材料表面干燥至少30分钟。

向生物材料表面添加血液
在没有抗凝剂的真空管中抽取人全血。
抽血后，立即小心地打开真空管和吸管7 微升的血液从管的，并把在每个生物材料表面（图1）。
合上盖子，开始为每个板计数计时器（1、5、30和45分钟）。

图1 。生物材料表面上的全血。将7μl 血液置于每个表面上，使其凝结15、30和45分钟。A组和B组是正在研究的不同生物材料表面。

准备阳性对照（最大血红蛋白释放）
准备一个新的24孔板用500 微升在3个孔DI水。
添加7 微升的血液用DI水（图2A）每个孔中。

图2 。积极控制。A. 最大血红蛋白释放获得添加7 微升的血液在500 微升去离子水中。B.将200μl 每种溶液转移到96孔板中以读取吸光度。

将板放在水平振荡器上30 s（100 rpm）。
将板移到工作台上，等待5分钟以释放游离的血红蛋白。
5分钟后，吸移管200 微升的溶液至96孔板（图2B）的。
使用酶标仪在540 nm波长处读取吸光度。

转移样品以缓解血红蛋白
P repare新的24孔板用500 微升在每个去离子水的井。
15分钟后，用去离子水将生物材料表面从第一块板轻轻转移到新孔中。移动生物材料表面时要小心，以免干扰表面的血液。在此步骤之后，样品应在水下。如果您的样本较厚，请使用更多的水以使整个血液覆盖。
将板放在水平振荡器上30 s（100 rpm）。
将板移到工作台上，等待5分钟以释放游离的血红蛋白（图3）。

图3 。去离子水中不同的生物材料表面A和B 释放出游离的血红蛋白。红细胞的溶解是由于压力变化而发生的，血红蛋白在去离子水中释放。

读取吸光度
5 分钟后，将200μl “水+释放血红蛋白”溶液移液至96孔板。更改每种溶液的移液器吸头（图4）。
使用酶标仪在540 nm波长处读取吸光度。
30和45分钟后分别对第二块板和第三块板重复步骤C和D。

图4.来自不同生物材料表面的溶液，A和B（水+血红蛋白释放）。将200μl 图3中的每种溶液转移到96孔板中以读取吸光度。

数据分析

使用酶标仪读取540 nm处的吸光度值。将数据导出到excel格式文件。
建议任何涉及血液的方案至少要使用两个不同的献血者进行两次。如何以往，以避免供体到供体变性，仅呈现从一个供体获得的结果（达莫达兰等人，2013; 萨比诺等人。，2019）。
使用Origin / Excel（或类似软件），绘制每个组的吸光度值的平均值/标准差（图5）。插入与阳性对照测得的平均吸光度对应的线。
使用Origin软件（或类似软件）以5％的显着性水平对实验数据进行方差分析（ANOVA）（P < 0.05）。

图5 。游离血红蛋白浓度值的吸光度为不同来测量生物材料ス后15,30和45 rfaces 分钟。WER结果Ë显著LY 所有时间点不同。B组显示明显较高的血红蛋白浓度，这表明与A组相比，这些表面明显延迟了全血凝结。

笔记

该协议可用于评估水下稳定的任何生物材料表面的全血体外凝结。如果样品漂浮在水中，请使用双面胶带将样品粘贴到井底。灭菌过程可能会因生物材料表面而异。

菜谱

PBS（10x）
将100 ml的10x PBS溶于900 ml的去离子水中，高压灭菌或过滤灭菌

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院国家心，肺和血液研究所的支持，授予的编号为R01 HL135505和R21HL139208。该协议改编自以前的出版物从我们的组（Leszczak 等人，2。013 ; 小号abino 等人，2019）。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

伦理

所有实验均按照美国国立卫生研究院的“伦理研究指导原则”进行。科罗拉多州立大学机构审查委员会批准了从健康受试者中分离血液的方案（17-7195H ，有效期从04/01/2017至03/31/2020 ）。通过静脉穿刺从健康个体获得全血，并从供体获得正式同意。

参考文献

Damodaran，VB，Leszczak ，V.，Wold ，KA，Lantvit ，SM，Popat ，KC和Reynolds，MM （2013）。一氧化氮释放葡聚糖衍生物的抗血栓形成特性：评估血小板活化和全血凝固动力学。RSC Adv 3（46）。
Gorbet ，MB和Sefton，MV（2004）。生物材料相关的血栓形成：凝血因子，补体，血小板和白细胞的作用。生物材料25（26）：5681-5703。
Leszczak ，V.，Smith，BS和Popat ，KC（2013）。聚合物纳米结构表面的血液相容性。J Biomater Sci Polym Ed 24（13）：1529-1548。
Obstals，F.，Vorobii，M.，Riedel，T.，de Los Santos Pereira，A.，Bruns，M.，Singh，S.和Rodriguez-Emmenegger，C.（2018）。通过嫁接非血栓形成性聚合物刷改善体外膜氧合器的膜的血液相容性。Macromol Biosci 18（3）。
萨比诺，RM，Kauk ，K.，Movafaghi ，S.，哥打，A。和Popat ，KC（2019）。血浆蛋白与超疏水二氧化钛纳米管表面的相互作用。纳米医学21：102046。
西蒙·沃尔克（R.Simon -Walker，R .），卡维奇亚（Cavicchia ，J.），普拉维尔（Prawel），DA，达西（Dasi），LP，詹姆斯（James），SP和波帕特（Popat），KC（2018）。透明质酸增强的线性低密度聚乙烯在血液接触应用中的血液相容性。生物医学研究杂志B应用生物学杂志106（5）：1964-1975。