材料和试剂

1.5 ml微量离心管（Eppendorf TM 3810X微量离心管，Fisher Scientific，目录号10451043）
15 ml离心管（Fisherbrand TM PP离心管，Fisher Scientific，目录号：11889640）
血细胞计数器盖玻片（Huberlab ，24 x 24 x 0.4 mm，货号：10.0440.24）
托盘（Thermo Scientific TM Nalgene TM可高温高压聚丙烯锅，1260 x 159 x 64 m m，货号：6902-1000）
无菌米拉布（高压灭菌），孔径22-25 µm （VWR，Millipore sigma，目录号：EM475855-1R）
接种环，inocu lating无菌的一次性环路（VWR，目录号：612-9358P）
一次性比色皿（半微量比色皿10 x 1 0 x 45 mm，Fisher Scientific，Greiner Bio One ，目录号：613101）
薄纸
水果包装托盘（用于苹果检测）
30厘米直尺
定制产品，包括木柄，金属盖和从工具尖端伸出3毫米的金属钉；导致3 毫米深和2.5毫米宽的病变
东部的生物防治（例如，A。Pullulans ；根据CCOS1008 ，可从瑞士的培养物保藏中心获得）（在22℃下于马铃薯葡萄糖琼脂平板（PDA）上保持72小时）
植物病原真菌（例如，B. 灰霉病（购自德国微生物收集和细胞培养物，DSMZ，DSM 877）下，镰孢属（CCOS1020））（保持在22 ℃下在PDA 5-7 d AYS ）
整个水果（例如，苹果，樱桃，李子）
马铃薯葡萄糖琼脂（CM0139B马铃薯葡萄糖琼脂[EP / USP / JP / BP] [脱水]，Thermo Scientific TM ，目录号：10197602）
甘油
70％乙醇
蒸馏水

设备

微型微镜（Leitz-Wetzlar ; Ortholux ）
血细胞计数器（改良Neubauer，0.1 mm深度，Huberlab ，目录号：10.0442.04）
分光光度计（GE ħ ealthcare Novaspec TM III可见期分光光度法ometer，Fisher Scientific公司，目录号：10773457）
涡流（伊卡® 涡流，天才3，Fisher Scientific公司，目录号：10132562 ）
微量P10，P1000（SOCOREX ：讴歌® 手册825 autocl avable可调微量）
3毫米软木钻（软木钻工具包，Huberlab ，目录号：13.1118.06）
钳子
宽底量筒（3升）
-80°C冷冻室

程序

苏rface sterili ž 通货膨胀和准备的水果
用含70 ％乙醇的湿纸巾擦去水果上的任何污垢。作为标准，我们为每种处理使用6个水果（重复样本），但根据测定的可变性，可能需要或多或少的重复样本。
用薄纸衬住丙烯托盘，然后将它们放在干净的表面上。
将70％的乙醇喷洒到放置在托盘中的薄纸上，直到覆盖整个薄纸表面。
在3 L的量筒中加入1 L的70％乙醇。
用手（用表面消毒的手套）将水果浸在70％的乙醇中1分钟（浸泡后不要擦拭），轻轻转动水果，使整个水果表面都被覆盖，用手将水果小心地转移到消毒的托盘上（使用表面消毒手套）。
让它们在无菌托盘中干燥1小时。在每个纸盘上贴上不同的处理标签。当使用更大的果实（即，苹果），应用标签ü 唱AP ermanent记号笔水果本身。

伤水果
使用70％的乙醇对定制的工具进行灭菌，并使用它在每个水果中创建一个2.5毫米宽和3毫米深的伤口（图s 1 A- 1 B）。
让伤口干燥1小时。

图1 。用菌丝体伤苹果果实的伤口和感染。A.使用定制工具对苹果造成伤口。B.感染前造成的伤口。C.将菌丝体应用到伤口中开始感染。D. 在感染后第5 天测量病变。

酵母悬浮液的制备
在-80 °C下解冻最初保存在30％甘油中的生防酵母。将10 µl转移至PDA平板上，并使用接种环进行铺展。在22 °C 孵育72小时。
使用接种环，挑选5个已在PDA上生长72小时的生防酵母菌落。
将菌落转移到1毫升蒸馏水中。
涡旋悬浮液1分钟或直到酵母细胞溶液均匀。
将酵母悬浮液在一次性比色皿中稀释10次（即，将100 µl酵母溶液与900 µl蒸馏水混合）。
使用分光光度计测量600 nm（OD 600 ）的吸光度，并记录该OD 600 读数。
调整细胞悬液至最终OD 600 的2合1 ，000微升蒸馏水如下：

例如：如果OD 600 读数为5.6，然后357微升（（1000微升× 2）/5.6 ）的酵母细胞悬浮液和643微升（1 ，000微升- 357微升）的蒸馏水在一个干净的混合1.5毫升微量离心管。

注意：最终的OD 600 可能取决于酵母，水果和病原体。

酵母应用于伤口
向伤口中添加10 µl酵母悬浮液（确保将溶液移液至伤口内且不流出）。
让伤口干燥3小时（请勿移动托盘，以免酵母溶液从伤口流出）。取决于测定的目的，同时接种酵母菌和病原体，或给予酵母更多的时间在伤口中建立（即在3 h，12 h或1 d ay 之后接种病原体）。
注意：在添加病原体之前，一些酵母可能会受益于更长的建立时间。

真菌植物病原体的制备
解冻最初保存在-80 °C的30％甘油中的真菌病原菌菌丝体栓塞。使用无菌环取出菌丝体塞，然后将其转移到PDA板上。每个板（在板的中心）放置1个菌丝体塞，并在22 °C 下孵育。

根据选择的病原体，使用分生孢子或菌丝体进行感染。

分生孢子的制备（例如，镰孢属）
让真菌生长在5厘米PDA 平板（或介质最适合于所讨论的具体真菌病原体）为7-14 d AYS 取决于所述真菌病原体。
在含有病原体的5 cm PDA平板上添加10 ml蒸馏水。
使用接种环，轻轻刮擦平板表面，使分生孢子悬浮在水中。
过滤器使用无菌分生孢子MIRACLOTH 的d收集滤液在无菌的15毫升离心管中。
注意：分生孢子在滤液中，而菌丝保留在米拉布中。

将1 ml滤液转移到1.5 ml微量离心管中。
使用70％乙醇清洁玻璃盖玻片和血细胞计数器。
将玻璃盖玻片放在血细胞计数器的计数腔上（施加足够的力，以使玻片完好无损并形成“牛顿色环”）。
在固定盖玻片和血细胞计数器之间吸取10 µl分生孢子悬浮液（在边缘缓慢吸移将使溶液渗入）。
查看在显微镜下血球在倍率125 X （目标10倍，目镜12.5倍）。
计算大角正方形中分生孢子的数量，并根据所用特定血细胞计数器的规格计算其分生孢子的密度。
调整分生孢子的浓度为5× 10个4 每ml分生孢子在限定的体积（1 ，000微升通常是足够的），如下所示：

示例：如果计算的分生孢子浓度为1 x 10 5 分生孢子/ ml，则500μl（1000μl × 5 × 10 4 / 1 × 10 5 的分生孢子悬浮液和500μl（1,000μl- 500μl）蒸馏水在1.5 ml 微量离心管中混合。
注：分生孢子可以存储在30％克lycerol在-80 ℃下以供后续使用。但是，如果保存时间较长，则应测试其生存能力（将其放在PDA培养基上，并在24小时后用显微镜检查其发芽和生长）。

的myceliu制备米（例如，B. 灰霉病）
使用7个d AYS 保持在PDA上的老真菌培养。
从结肠的边缘用3mm软木钻孔机，仔细切出来的菌丝体塞NY，其中菌丝是年轻（图2 ）。

D：\ Reformatting \ 2019-12-23 \ 1902859--1274 Florian Freimoser 794522 \ Figs jpg \图2.jpg

图2 。制备菌丝体塞。A.准备菌丝体的工具和材料（镊子，软木钻和在PDA板上生长的病原体）。B.使用3毫米软木钻切出菌丝体塞。C.用镊子从板中挑出菌丝体塞，将其用于伤口感染。

伤口感染
与分生孢子
使用已调整浓度的分生孢子悬浮液进行感染。
小心地将10 µl分生孢子溶液移入伤口，并使其干燥1小时（请勿移动托盘，以免病原体从伤口流出）。
与菌丝体
使用镊子转移菌丝体塞，然后将其倒置放置在伤口上（这可确保菌丝体长入伤口（图1 C）。

孵化
在水果包装托盘上保留较大的水果（例如，苹果，橙子，油桃）。将不同的处理均匀地分布在所有包装盒上，并用高压灭菌器袋盖好包装盒。将较小的水果（例如，樱桃，李子）放在盖有盖子的塑料培养箱中（在所有情况下，确保感染侧都朝上）。
在室温下孵育3-7 d AYS 。
注：d epending的水果和病原体的类型和成熟，腐烂和病变会在不同时间点的发展。

评估和测量电EMENT
使用垂直于茎的直尺测量病变/腐烂的直径（图1 D）
记录测量值。

数据分析

从所有其他记录的值中减去未感染或没有酵母的伤口直径。
计算每种治疗的病变/腐烂直径的平均值和标准偏差（表1 ）。
通过将每个平均值除以PO处理的平均值，对所有“仅病原体（PO）”处理的方法进行标准化。
注：normali ž 为宝治疗ED值永远是1，而对于生物防治酵母处理该值大于1小于理想。

统计学ANALY ž E中的数据（理想情况下，应该有病原体仅（PO）治疗和“生物防治酵母+病原体”治疗之间的统计学显著差异）。

表1。B 的直径。苹果果实经各种处理后的灰质病病损（毫米）

病变/腐烂直径（毫米）

Normali ž 版

一世

ii

iii

iv

v

六

意思

标清

意思

标清

葡萄孢属

17

17

22

20

17

16

18.2

2.3

1个

0.1

葡萄孢菌+酵母

2

3

2

3

2

1个

2.2 *

0.8

0.1

0

酵母

0

0

0

0

0

0

0.0 *

0

0

0

无感染/酵母

0

0

0

0

0

0

0.0 *

0

0

0

* 与仅病原体（PO）处理具有统计学意义的平均差异。

将数据显示为直方图，标出病变Y轴的相对大小百分比）和不同的治疗方法（x轴）（图3 ）。

D：\ Reformatting \ 2019-12-23 \ 1902859--1274 Florian Freimoser 794522 \ Figs jpg \图3.jpg

图3 。的抑制灰霉病病变苹果果实在生物防治酵母（存在阿。霉）。直方图显示了葡萄孢属病变的相对大小（六个独立重复样本的标准化均值）。在苹果伤口上添加曲霉菌可抑制B 引起的病变/腐烂。灰质至10％。单独受伤或仅添加酵母都不会引起病变的发展。

笔记

虽然normali ž 用于生物防治酵母治疗ED值大于1（意味着病原体文件还原理想地少锡永形成在与生物防治酵母处理），在一些情况下为1的值或大于1可制得。对于酵母菌对病原体具有刺激作用（值大于1）或无作用（值1）的情况。

致谢

这项工作得到了Agroscope 和瑞士联邦环境办公室（FOEN）的瑞士生物安全专家委员会（SECB）的支持。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考文献

El- Ghaouth ，A.，Smilanick ，JL，Wisniewski，M.和Wilson，CL（2000）。结合使用假丝酵母念珠菌和2-脱氧-D-葡萄糖，可以更好地控制苹果和柑桔的腐烂。Plant Dis 84（3）：249-253。
Ferraz，LP，Cunha，TD，da Silva，AC和Kupper，KC（2016）。酵母菌对柑橘类水果中柠檬土霉的生物控制能力和推测的作用方式。微生物研究188-189：72-79。
的Gore-劳埃德，D.，Sumann ，I.，Brachmann ，AO，SCHNEEBERGER ，K.，Ortiz的-美利奴羊，RA，莫雷诺-特兰，M.，SCHL ä FLI ，M.，Kirner宾馆，P.，桑托斯克朗，A 。，Rueda-Mejia，MP，Somerville，V.，Wolfe，KH，Piel ，J.，Ahrens，CH，Henk，D.和Freimoser ，FM（2019）。Snf2控制pulcherriminic酸的生物合成和生防酵母Metschnikowia pulcherrima的抑菌活性。摩尔微生物学112（1）：317-332。
Grzegorczyk ，M.，Ž arowska ，B.，Restuccia ，C。和Cirvilleri ，G。（2017）。对杀手酵母菌采后生物防治能力褐fructigena 和褐腐病菌对核果。食品微生物学61：93-101。
Janisiewicz ，WJ，Jurick ，WM，2nd，Peter，KA，Kurtzman，CP和JS买方（2014）。与李子相关的酵母及其在收获后控制褐腐的潜力。酵母31（6）：207-218。
Janisiewicz ，WJ，Kurtzman，CP和JS买方（2010年）。与油桃有关的酵母及其对褐腐病的生物防治潜力。酵母27（7）：389-398。
Lutz，MC，Lopes，CA，Sosa，MC和Sangorrín ，MP（2012）。一种新的改良策略，用于选择冷适应性拮抗酵母菌来控制梨收获后的疾病。Biocontrol Sci Techn 22（12）：1465-1483。
Norelli ，JL，Wisniewski，M.，Fazio，G.，Burchard，E.，Gutierrez，B.，Levin，E. and Droby ，S.（2017年）。基因分型的分测序标记促进数量性状基因座控制电阻的标识扩展青霉中野苹果。PLoS One 12（3）：e0172949。
Oro，L.，Feliziani，E.，Ciani，M.，Romanazzi，G.和Comitini，F.（2014）。酿酒酵母Disva 599，Metschnikowia pulcherrima Disva 267和Wickerhamomyces anomalus Disva 2菌株对甜樱桃采后褐腐病的生物防治。采后乙IOL Ť EC HN 96 ：64-68。
帕拉法蒂（L.），维塔莱（Vitale），A。雷斯塔奇亚（Restuccia）和G.西维尔里（2015）。食品分离酵母菌株对灰葡萄孢引起采食后葡萄串腐烂的生防能力和作用机理。食品微生物学47：85-92。
Vero，S.，Garmendia ，G.，González，MB，Garat ，MF和Wisniewski，M.（2009）。出芽短梗霉作为在乌拉圭苹果采后病原体生物防治剂。生物防治小号CI Ť echn 19（10）：1033年至一零四九年。
Yan F.，Xu，S.，Chen Y.，and Zheng X.（2014）。鼠李糖脂对樱桃番茄果实中链球菌（Rhodotorula glutinis）生物控制链格孢菌的影响。采后乙IOL Ť EC HN 97 ：32-35。
Yu T.和Zheng XD（2006）。水杨酸增强了苹果果实中拮抗劳氏隐球菌的生物防治功效。植物生长调节杂志 25（2）：166-174。