材料和试剂

1.5 ml反应管（Eppendorf，目录号：0030120086）
15 ml 离心管（Falcon，Corning，目录号：352196）
96个平底板（CytoOne ，Starlab ，目录号：CC7672-7596）
6孔板（CytoOne ，Starlab ，目录号：CC7672-7506）
疟原虫Knowlesi A1-H.1野生型（Mike Blackman，Francis Crick Institute London）（Moon et al 。，2013）
XL10-金超感受态细胞（Agilent，目录号：200315），- 70 °C
恒星TM 感受态细胞（Clontech公司，目录号：636766 ）
pCas9 / sg质粒（Robert W. Moon，伦敦卫生与热带医学学院，英国伦敦）
pKconGFP 质粒（英国伦敦伦敦卫生与热带医学院，Robert W. Moon）
RPMI-1640培养基（Sigma，目录号：R5886）
L-谷氨酰胺（Sigma，目录号：G7513-100ML），- 20 °C
马血清（PAN BIOTECH，目录号：P30-0711），- 20 °C
Nycodenz （Progen ，目录号：1002424），RT
4- [7-[（二甲氨基）甲基] -2-（4-氟苯基）咪唑并[1,2-a]吡啶-3-基]嘧啶-2-胺；大院2（Michael Blackman，弗朗西斯·克里克研究所，英国隆尼）
P3原代细胞4D Nucleofector X试剂盒L（Lonza，产品编号：V4XP-3024）
CloneAmp HiFi PCR预混液（TaKaRa ，目录号：639298）
BtgZI 限制性内切酶（N EW ê ngland BioLabs公司，目录号：R0703S），-20 ℃下
In-Fusion高清克隆套件增强版（TaKaRa ，目录号：638910）
NE缓冲液2（N EW ê ngland BioLabs公司，目录号：B7002S），-20 ℃下
氨苄西林钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：A016 6-5G），- 20 °C
赫斯特33342（N EW ê ngland BioLabs公司，目录号：4082），-20 ℃下
琼脂糖，分子级（Bioline 试剂有限公司，目录号：BIO-41026）
TAE Buffer 50x（VWR International，目录号：A1691.1000）
HyperLadder 1 kb（Bioline 试剂有限公司，目录号：BIO-33026）
QIAquick PCR纯化试剂盒（QIAGEN，订货号：28104）
测序试剂盒Mix2Seq（eurofins ）
QIAGEN Plasmid Mini Kit（QIAGEN，目录号：12123）
QIAGEN质粒Midi试剂盒（QIAGEN，目录号：12143）
QIAquick 凝胶提取试剂盒（QIAGEN，目录号：28704）
LB Broth，Miller（Sigma-Aldrich，目录号：L3522-250G）
CH 3 COONa，乙酸钠，NaAc （Sigma-Aldrich，目录号：S2889-250G）
CaNa 2 · EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：ED2SC-100G）
乙醇（Fisher Chemicals，E / 0650DF / 17）
DNeasy 血液和组织试剂盒（QIAGEN，目录号：69504）
GoTaq Green Master Mix（Promega，目录号：M7122），- 20 °C
Ibidiμ - slideVI 0.4，聚-L-赖氨酸（Ibidi ，Thistle Scientific Ltd，目录号：80604）
Oligos（IDT，集成DNA技术）
Ancotil / 5-氟胞嘧啶2.5 g / 250 ml输注溶液（PubChem CID：3366），RT
DMSO（Sigma-Aldrich，目录号：276855-250ML）
三HC 升，氨基丁三醇® hydrocloride溶液1 中号（Sigma，目录号：T-3038-1L ）
氯化钾（西格玛，目录号：P9541-500g）
RPMI-1640（HEPES修改，具有25 mM HEPES，无L-谷氨酰胺，Merck，目录号：R558）
小号憎恨碳酸氢盐（Sigma，目录号：S5761）
右旋糖（Sigma，目录号：G7021）
次黄嘌呤（Sigma，目录号：H9636）
Albumax II（Gibco，目录号：11560376）
L-谷氨酰胺（Merck，目录号：59202C）
不含谷氨酰胺的定制改性RPMI介质（生命技术品牌）（请参阅食谱）
Nycodenz 储备溶液（100％）（请参阅食谱）（Alere Technologies AS，目录号：1002424）
Nycodenz 工作解决方案（55％）（请参阅食谱）
乙胺嘧啶（西格玛（Sigma），目录号：P4200000 ）（请参阅食谱）
Ancotil 2.5克/ 250毫升输液（请参阅食谱）

设备

Amaxa 4D-Nucleofector TM 核心单元（Lonza，目录号：AAF-1002B ）
Amaxa 4D-Nucleofector TM X单元（Lonza，目录号：AAF-1002X）
具有冷却功能的离心机（Eppendorf，目录号：5424 R）
加热块（USA Scientific，Thermal-Lok 2位干式热浴锅，目录号：2510-1102）
凝胶电泳室（Analytik Jena，目录号846-025-100）
ChemiDoc 成像系统（BioRad ，目录号：17001401）
ThermoMixer C（Eppendorf，目录号：2231000574）
显微镜（Invitrogen EVOS数字彩色荧光显微镜，AMEFC4300，目录号：15319601）
分光光度计DS-11 Fx +（DeNovix ）
热循环仪PCRmax Alpha循环仪（Cole-Parmer，目录号：SI-93945-12）

软件

SnapGene（GSL Biotech LLC，www.snapgene.com）
Protospacer软件（BIHP，巴斯德研究所，法国巴黎，www.protospacer.com）
图像实验室软件（BioRad ）
CRISPR软件（例如Benching ，Protospacer）

程序

pCas9 / sg质粒的克隆
选择引导顺序中的目的基因
一种。在将要删除/替换的基因区域中找到PAM位点（NGG）。根据目标，PAM网站的位置将有所不同。对于剔除或替换研究，可以将其放置在删除/替换区域内的任何位置。为了进行标记研究，指导RNA序列应越过标记插入的位置。

b。使用CRISPR软件（例如Benching ，Protospacer）确定引导序列（NGG站点上游N20）的脱靶和脱靶得分。选择一个或多个脱靶得分< 0.03的指导序列。确定指导顺序时，排名和脱靶得分应该是您的首要因素。我们建议避免使用富含AT的序列。目标得分通常是在其他物种的背景下确定的，而根据我们的经验，它们与成功的相关性不高，因此尽管应将其考虑在内，但应优先考虑其他标准。

设计融合寡核苷酸，将靶序列整合到pCas9 / sg质粒中
正向寡核苷酸：5 ' -TTACAGTATATTATT（N 20）GTTTTAGAGCTAGAA -3 '

反向寡核苷酸：5 ' -TTCTAGCTCTAAAAC（N 20）AATAATATACTGTAA -3 '

图1中的示意图描述了将指导序列插入pCas9 / sg质粒中。

线性化2 微克pCas9 / SG质粒用1 微升BtgZI 酶和5 微升切智能缓冲器50 微升反应体积为至少2小时，在60℃，用清理的QIAquick PCR纯化试剂盒。通过在0.8％琼脂糖凝胶上电泳确认线性化。将线性质粒稀释至50 ng / μl 。
退火引导寡核苷酸
一种。制备寡核苷酸100的悬浮液μM 并混合10 微升的每个（正向和反向寡核苷酸）与2.2 微升在1.5ml反应管NEB2缓冲液中。

b。在加热块中于95 °C 孵育10分钟。将加热块放在冰上，让其冷却。（我吨大约需要1分钟用于块冷却下来。）从现在起，始终保持在反应管上的冰。

C。稀退火的寡聚1：200至0.5μM 与Ç 旧EB从QIAGEN试剂盒（1缓冲微升退火的寡聚的199 微升EB缓冲液）。

准备注入反应
一种。在冰上混合1μl线性化质粒（50 ng），1μl稀释的退火寡核苷酸，2μlH 2 O和1μlIn-Fusion缓冲液。

b。在50°C下孵育15分钟。

pCas9 / sg_guide的转换
一种。5添加微升IN-FUSION反应的50 微升XL10 Gold超细胞或替代细胞，例如恒星TM 感受态细胞（Clontech公司）。

b。在冰上孵育30分钟。

C。根据应用热休克牛逼Ø 该制造商的说明。对于XL10金电池，在42°C的热浴中持续30 s。

d。在冰上孵育反应2分钟。

e。加入200μlLB培养基，并在350 rpm 摇动下于37°C孵育20分钟。

F。在含0.1μg/ ml氨苄青霉素的琼脂平板上平板反应，然后在37°C下孵育过夜。

确认将N20引导序列插入pCas9 / sg质粒
一种。将菌落接种于含0.1μg/ ml氨苄青霉素的5 ml LB培养基中，并于37°C孵育过夜。

b。用Mini-prep试剂盒纯化质粒。

C。序列的至少两个质粒（效率通常在50和100％）用寡5 ' -CATTGTTCCCCCCTTTGTTTTGCAAG-3 ' ，以确认插入。

纯化质粒进行寄生虫转染
一种。用0.1μg/ ml氨苄青霉素接种250 ml LB培养基，并在37°C下孵育过夜。

b。用Midi-prep试剂盒纯化质粒。为了获得足够的质粒用于一种寄生虫转染，产量应至少为30μg。

C。通过与0.1体积的3 M NaAc和2体积的冰冷的100％乙醇混合来沉淀质粒，并在-20°C 孵育至少3 0分钟。

d。降速质粒在4℃下30分钟，15871 RCF 。用700μl70 ％乙醇洗涤沉淀两次，每次在4°C和15,871 rcf 下离心沉淀15分钟。

e。在无菌实验室柜中干燥质粒沉淀，并用10μl无菌TE缓冲液重悬。

F。测量DNA浓度。

G。保持质粒在4°C直至转染。

图1.指导序列的融合克隆到pCas9 / sg质粒。BtgZI 在其识别位点之外分裂。两个BtgZI 位点（绿色）用于线性化质粒并去除识别位点。通过使用整合位点任一侧的15 bp同源区域，在靶基因内NGG位点的上游20 bp侧翼，生成融合融合片段。灰线表示序列同源性。

生成PCR模板DNA
产生寡核苷酸
一种。选择的寡核苷酸来扩增同源性的区域（HRS）上调（产品1，oligo5 + oligo2）和下游（产物2 ，oligo3 + oligo6）引导序列的（双- 每个至少500bp长度的链断裂），但理想的800 bp。如果可能的话，要避免长聚- 一个或T大片。

b。将待整合的DNA的衔接子序列（可能是标签或整个表达盒）添加至〜20 bp（Tm至少为56 °C）的oligo 2和oligo 3 。

C。选择的寡核苷酸的至少50个碱基的上游5' HR和50bp的所述的下游3' HR（oligo1和oligo4），这些将允许你进行聚变反应作为半嵌套PCR，这是至关重要的，以确保最小的本底产物和足够的产量。

d。选择寡核苷酸以扩增要整合的DNA序列（产物3 ，ol igo 7 + ol igo 8 ）。

AMPLIFY 5' HR（产物1，oligo1 + oligo2），3'HR（产品2，oligo3 + oligo4）和DNA序列被整合（产物3，oligo7 + oligo8）。根据用户手册，一式两份运行每个PCR，总体积为25μl 。对于CloneAmp Hifi PCR Premix，这是32个循环：
98 °C 10 s 变性55 °C 15 s 退火72 °C 5 s / kb 延伸在琼脂糖凝胶上运行并进行凝胶纯化。

通过PCR（oligo5 + oligo8）合并产物1和产物3。在扩展步骤中允许15 s / kb。在琼脂糖凝胶上运行并进行凝胶纯化。
例如：25 微升PCR使用：1 2.5 微升CloneAmp 预混料，0.5 微升FWD 低聚，0.5 微升转低聚，1 微升的产品1，1 微升产品2和10 微升ħ 2 O.

通过PCR（oligo5 + oligo6）合并产物1/3和产物2。在扩展步骤中再次允许15 s / kb。运行至少6×50个μ 升此最终的PCR反应中，得到40 微克的DNA。请注意，尽管有时可以在一个反应中同时融合所有三种产品，但将其分为两个步骤可提高鲁棒性和良率，因此我们建议将其作为默认设置。
不纯化（避免DNA丢失）沉淀DNA，如pCas9 / sg质粒所述洗涤并干燥。A S 的电气原理的用于产生模板DNA的3步PCR 示于图2。
笔记：

一种。如果插入的DNA序列是小标签（如血凝素标签）整个标签序列可以被添加作为适配器寡小号2和3，并且需要到保险丝只有两个PCR步骤5' HR和3' HR。

b。如果目的是敲除的基因，靶向同源性的区域的5' 和3' 非编码区可以简单地被稠合在一起（或带有短居间“条形码”或接头）来创建一个PCR敲除构建体。

C。如果靠近目的基因的C端或N项没有PAM的网站，一个网站PAM更远可以选择，但流程的一部分需要小号被recodonized 的轨迹避免修复而无需修改（见图3中的示例）。

d。如果需要更大数量的模板DNA，或者如果需要通过测序确认序列，则最终PCR也可以整合到质粒中（例如，通过TA克隆到pGEM中）。

图2.用于生成模板DNA的三步PCR示意图。目的基因的基因组序列用于设计寡核苷酸，以扩增要缺失/置换的序列（红色）旁的同源区域。另外，寡核苷酸被设计为扩增要引入的序列（绿色）。在三个PCR步骤中，产生了用于同源修复的模板DNA 。在第一步PCR中，生成了三种产物。在第二个P CR步骤中，将产物s 1和3融合，在第三次PCR中，将产物1/3和2融合。ol = oligo。

图3.血清胆碱酯酶MATIC表示生成模板DNA与recodoni ž 通货膨胀。在这个例子中，目的是标记目的基因（紫色）的C末端，而所选的PAM位点位于基因的3' 末端，而20 bp的引导序列不会因引入a标签序列。该网站PAM因此，必须通过引入被删除recodoni ž 版序列（蓝色）从PAM现场，直到标签序列运行（以确保没有突变PAM网站和标签之间的整合的机会）。在这种情况下，标签是短序列，如血凝素标签或斑点标签（绿色）。如前所述设计PCR寡核苷酸，区别在于需要至少两个HR1的反向寡核苷酸。在第一个反向寡核苷酸（寡核苷酸2.1）中，5' 末端包含重新密码化的序列（蓝色），第二个寡核苷酸（寡核苷酸2.2）在重新密码化的序列内结合，并在其5' 末端包含标签序列。第一次PCR的模板DNA是基因组DNA，第二次PCR的模板是产物1.1，最终PCR 的模板是产物1.2和产物2。

同步P. knowlesi 经由寄生虫Nycodenz 纯化
将5 ml的5 ％Nycodenz 工作溶液转移到15 ml锥形管中，并加热至室温。
注意：1 ml红细胞需要1个Nycodenz 管（50 ml培养液含2％的血细胞比容）。

离心机向下高寄生虫血症（4-10％）P. knowlesi 培养在900 ×g下在室温下4分钟。
在RPMI中以50％的血细胞比容重悬寄生物沉淀。
在5毫升Nycodenz上小心地将2毫升这种培养物分层。
以低制动/加速度以900 xg离心12分钟。未感染的红细胞和环形阶段的寄生虫将沉到底部，裂殖体在Nycodenz的顶部形成一层。
转印顶层裂殖（BRO wnish颜色）到一个新的锥形管和洗涤用RPMI以除去Nycodenz （参见图4）。
将裂殖体与1μM 化合物2 孵育2-3小时。化合物2是一种PKG抑制剂，可逆地阻断裂殖子的流出。此步骤是可选的，但将有助于maximi ž 后期裂殖电子产率，并且还提供与定时一定的灵活性为后续步骤中的用户。如果孵育时间超过3小时，寄生虫的生存力将急剧下降。
洗净化合物2并将裂殖体转移回培养物中（含2％的红细胞比容红细胞）。
注意：要使寄生虫更同步，请执行上述步骤，然后让它们侵入红细胞30至60分钟，然后再次对Nycodenz进行纯化，只有这次保持环形寄生虫的沉淀并去除荆芥。您可以通过将寄生虫在室温下放置数小时来减慢寄生虫的成熟，以使其在下一次纯化/转染的方便时间进入裂殖体阶段。

图4 。用Nycodenz进行Schizont浓缩

转染P. knowlesi 寄生虫与CRISPR结构
为了转染这些寄生虫，需要准备DNA和血液。这可以同时进行。
一种。血液：自旋向下新鲜达菲阳性红细胞（储存不超过1周），并转移200 微升填充单元以一个新的1.5ml反应管中。加入500 微升在37完全培养基孵育的℃，在550摇动的转速（以，例如，Eppendorf恒温混合器中）。

b。脱氧核糖核酸：

结合〜20 微克的pCas9 / sg_guide 质粒用〜40至60 微克模板DNA（〜1：20的摩尔比），调整到10的终体积微升用无菌的TE缓冲液。
将10μlDNA 与100μl 补充P3转染缓冲液（来自Lonza试剂盒）混合。
C。寄生虫：

净化P. knowlesi 寄生虫Nycodenz 从同步后期裂殖（24-26小时龄）培养孵育1种2小时μM 化合物2的最佳指标在裂殖年龄P. knowlesi 是一个紧凑的存在颜料颗粒和鱼腥藻完全隔离。紧密的颜料颗粒在流出前约30-45分钟形成。Maximi ž ING牛逼，他这阶段的比例将显着提高转染效率。
裂殖体化合物2温育后，洗涤和转移10到20个微升裂殖（〜1-2 X 10 8 个细胞）到新的1.5ml反应管中。将它们与至少100μl 的完全培养基在37 °C下放置15至20分钟。
将程序添加到Amaxa 4D-Nucleofector X或使用以下设置选择现有实验：脉冲代码：FP 158，解决方案：原代细胞P3，体积：100μl 。
从步骤D1 c.ii 孵育后，立即在845 rcf下将schizonts旋转1分钟，并除去培养基。
转移100 微升所述的DNA /转染缓冲液至裂殖体沉淀并轻轻混合。
将100 微升的裂殖体/缓冲混合的核转试管，并移动到Amaxa公司4D-的Nucleofector X.按开始等待unti 升的屏幕显示绿色标志的人，表示成功转染。向比色皿中装入超过100μl 的混合物会增加错误消息的可能性，这些错误消息表明部分（“黄色”）或完全（“红色”）脉冲故障。
转染后，立即将带有糊状的分裂症（包括在Lonza试剂盒中）转移至准备好的温暖的红细胞中。用血液/介质冲洗比色杯，以免丢失裂殖体物质。
在将培养物移至6孔板中并加入4.5 ml完全培养基之前，将裂殖体在37 °C下孵育20-30分钟，并以550 rpm摇动以使其浸润。
注意：为了确定转染效率，应转染游离型eGFP质粒（例如PkconGFP）作为对照。

转染后的第二天，每天更换培养基，持续5天，添加阳性选择药物乙胺嘧啶（终浓度100 nM ）。

确认转染效率
显微镜检查（如果荧光附加质粒被转染）
一种。约24小时后转染染色30 微升培养物，用30 微升的4 微克/毫升的Hoechst的PBS在37 15分钟℃。

b。用100μlPBS稀释，然后将100μl稀释液应用于显微镜通道载玻片（ibidi）。

C。计数具有定义的Hoechst信号的20至50个寄生虫，并检查其中有多少也显示游离质粒的荧光。转染效率通常在5％至40％之间。

d。示例荧光显微镜图像如图5所示。

图5. 显微镜我的法师的eGFP 阳性寄生虫

诊断PCR
一种。选择基因组中修复模板HRs以外至少100 bp的正向寡核苷酸。在野生型基因座内选择一种反向寡核苷酸，在修饰的基因座内选择一种反向寡核苷酸。

注意：该产品对于整合的寄生虫必须是唯一的，并且也不应扩增出转染的模板DNA。由于大量用于转染，因此构建体在转染后的一段时间内仍可检测到，从而导致潜在的假阳性PCR结果。应该设计其他的对照PCR，这些PCR仅在野生型寄生虫和不相关的对照位点提供产物（以证明gDNA没有问题）。

b。旋转1 ml的寄生虫培养物，用RPMI或PBS洗涤血球并将其保存在-20 °C或立即用于gDNA提取（Dneasy血液和组织试剂盒）。

C。设置六个PCR反应以确定野生型寄生虫和转染的寄生虫的野生型基因座，修饰的基因座和独立的基因座。如图6 所示，在琼脂糖凝胶上电泳。

图6. 诊断PCR以确认整合。琼脂糖凝胶是诊断PCR的一个实例，以确认野生型基因座，整合基因座和无关/独立的基因座。野生型正向寡核苷酸应在修复模板的外部（5' 同源区域上游或3' 同源区域下游约100 bp ）。反向寡核苷酸应特定于野生型或整合。基因组DNA来自转染前的野生型寄生虫（WT）或转染后（TF）重新出现的寄生虫。

注意：整合可以在转染后的两天之内检测到，但是PCR在更高的DNA浓度下工作更加可靠，因此，当细菌在培养物中通过吉姆萨涂片很容易检测到耐药性对位点（> 0.2％寄生虫病）时，应取样。。

排序
通过PCR扩增修饰的基因座并通过测序确认。

去除含有带有负选择的寄生虫的Cas9 / sg_guide 质粒
添加1 μM Ancotil 7天（5-氟胞嘧啶）到〜0.5％的寄生虫培养物（寄生虫应确认集成正极和在培养物中稳定地增长）。
注意：如果没有阳性选择，寄生虫会很快丢失质粒，因此预计寄生虫不会大幅下降。

通过限制稀释来克隆出寄生虫（Moon 等，2013）。
如上所述，通过PCR或显微镜确认整合在多个克隆系中。
如前所述，通过用乙胺嘧啶处理5天的寄生虫，确认整合阳性克隆系中Cas9 / sg_guide 质粒的去除。继续培养一周以测试寄生虫是否再次出现。
注意：准备转染后的寄生虫（大量培养）和克隆系的冷冻原种。

笔记

所有的寄生虫工作均应在II级微生物安全罩中进行，以达到无菌和保护使用者的目的。由于诺氏疟原虫是人类感染性物种，所有工作必须在适当的批准安全性和收容条件下进行。P. knowlesi 培养物可以在庆大霉素（25毫克/升）抗生素的存在下生长，但具有良好的无菌techniq UE 这不应该是必要的，也不是推荐的。

该transfectio n和整合效率可以是可变的，如果没有充分优化解ž 编。可以通过以下方式实现高效率：

使用新鲜血液（年龄不超过7天）。
确保你至少有10 μ 升裂殖体，较低的量会严重影响工作效率。
确保您使用的是非常晚且高度同步的裂片（很大一部分用凝结的颜料颗粒完全分段）。
确保您的P. knowlesi 寄生虫转之前成长可靠3-4每天倍（人类红细胞）。
确保您有足够的DNA。
使用长同源性的区域（500 - 1 ，000基点）。
比较几个指导序列。

菜谱

Nycodenz 储备溶液（100％）
化合物的最终浓度为100 ml的注

Nycodenz 27.6％（w / v）27.6 g 加入50 ml温暖的H 2 O中，并通过加热（60 °C）和搅拌使其溶解

Tris HCl 5 mM 2.5毫升的1 M库存

氯化钾3毫米22.37毫克

碳酸钙2· EDTA 0.3毫米11.23毫克

调节至100 ml和pH 7.5，无菌过滤器并在4 °C下储存

Nycodenz 工作解决方案（55％）
将55 ml Nycodenz 储备液与45 ml RPMI混合。储存在4°C

乙胺嘧啶
一种。制备在DMSO中的10mM储备溶液，制备60个微升在-20℃等分并储存

b。通过将50μl 的储备溶液添加到50 ml的RPMI中来制备100μM的工作溶液

C。无菌过滤器，并在4°C下储存。保持有效的解决方案不要超过2周

d。向5 ml寄生虫培养物中添加5μl 工作溶液（培养物中终浓度为100 nM ）

安科蒂尔
一种。通过在RPMI中稀释无菌储备溶液（2.5 g / 250 ml = 77 mM = 1％）1/77来制备1 mM工作溶液

b。保持室温

C。向5 ml寄生虫培养物中添加5μl （1μM ）

完整的媒体
RPMI-1640（HEPES修改，具有25 mM HEPES，无L-谷氨酰胺），并具有以下添加：

2.3 g / L碳酸氢钠

2克/升葡萄糖

0.05克/升次黄嘌呤

5克/升Albumax II

0.3 g / L L-谷氨酰胺（10 ml 200 mM溶液和1 L介质）

10％（vol / vol）马血清

无菌过滤器并在4 °C下储存

致谢

这项工作得到了由英国医学研究委员会和国际发展部（RWM，FM）共同资助的MRC职业发展奖（MR / M021157 / 1），布鲁姆斯伯里大学的研究奖学金和惠康信托基金会资深研究人员奖（ 106240 / Z / 14 / Z）。该协议改编自Ecker 等。（2006 ），Ghorbal 等。（2014 ）和Mohring 等人。（2019）。

利益争夺

作者宣称没有相互竞争的财务利益。

伦理

该项目，同意书和协议经LSHTM观察研究伦理委员会批准，项目编号为5520-1。

参考文献

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Ecker，A.，Moon，R.，Sinden ，RE和Billker ，O.（2006）。通过适合高通量应用的基于PCR的方法生成伯氏疟原虫的基因靶向构建体。Mol Biochem Parasitol 145（2）：265-268。
Ghorbal ，M.，Gorman，M.，Macpherson，CR，Martins，RM，Scherf ，A.和Lopez-Rubio，JJ（2014）。使用CRISPR-Cas9系统编辑人类疟原虫恶性疟原虫中的基因组。 Nat Biotechnol 32（8）：819-821。
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