材料和试剂

无菌手术单
铝箔
外套（ProtDesc ，目录号：80404440020），储存温度：RT
面膜（ProtDesc ，目录号：80404440006），储存温度：RT
瓶盖（ProtDesc ，目录号：80404440004），储存温度：RT
手套（Maxitec ，Kevenol ，目录号：80748910002），存储温度：RT
20 ml注射器（BD Plastipak，目录号：990687），存储温度：RT
21G针（BD PrecisionGlide ，目录号：300054），存储温度：RT
玻璃组织培养皿（派热克斯（Pyrex），目录号：HX0004-00376），储存温度：RT
康宁® 75厘米2 ，具有排气孔盖U型倾斜颈细胞培养瓶（Corning，目录号：430641U），贮存温度：15/30 ℃下
24孔细胞培养板（Corning，目录号：3524），储存温度：15/30 °C
12孔板（Corning，目录号：3512），存储温度：15/30°C
6孔培养板（Corning，目录号：3335），存储温度：15/30 °C
50 ml锥形管（Sarstedt ，目录号：62.547.254），储存温度：15/30°C
1.5 ml 微量管（Eppendorf，目录号：Z606340），储存温度：RT
微量移液器吸头（Eppendorf，目录号s ：0030000811/0030000854/0030000870/0030000919 ），储存温度：RT
超低附件，96孔（Costar ，目录号：CLS7007），储存温度：15/30 °C
Alpha最低基本培养基（α-MEM）（Thermo Fisher Scientific，目录号：12000-022），存储温度：2/8 °C
Dulbecco改良的Eagle培养基（D-MEM）（Thermo Fisher Scientific，目录号：12100-046），存储温度：2/8 °C
Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Thermo Fisher Scientific，目录号：21600-010），储存温度：15/30 °C
碳酸氢钠（Sigma-Aldrich，Sigma，目录号：S5761-1KG），储存温度：15/30 °C
庆大霉素试剂溶液（Thermo Fisher Scientific，目录号：15710-064），存储温度：-20 / -5 °C
青霉素-链霉素（Thermo Fisher Scientific，目录号：15140-122），储存温度：15/30 °C
地塞米松（Sigma-Aldrich，目录号：D8893），储存温度：2/8 °C
FBS合格的胎牛血清（赛默飞世尔科技，产品目录号：12657-029），贮存温度：- 10 ℃下
两性霉素B 250 μ 克/毫升（赛默飞世尔科技，产品目录号：15290-018，储存温度：- 20 / - 5 ℃下）
0.25％胰蛋白酶（1×）（赛默飞世尔科技，产品目录号：15050-057），贮存温度：- 20 / - 5 ℃下
II型胶原酶冻干（Thermo Fisher Scientific，目录号：17101-015），储存温度：2/8 °C
2.5％洗必泰（Bioflora M anipullarium ），储存温度：室温
β- 甘油磷酸二钠五水合物98.0％（NT）（Sigma-Aldrich，目录号：50020-100G），储存温度：2/8 °C
L-抗坏血酸（Sigma-Aldrich，目录号：33034-100G），储存温度：15/30 °C
乙醇96％（默克（Merck），货号：100971），存储温度：5/30 °C
甲醛溶液37％（默克（Merck），货号：104002），存储温度：15/25 °C
异丙醇（默克密理博（Merck Millipore），目录号：1096341000），存储温度：5/30°C
茜素红S（Sigma-Aldrich，目录号：A5533-25G），储存温度：15/30 °C
醋酸（默克（Merck），目录号：199061），储存温度：15/25 °C
3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（Sigma-Aldrich公司，目录号：I7018-1000MG），贮存温度：- 20 ℃下
甲醇（Merck，目录号：1.06009），存储温度：5/30 °C
人胰岛素（Sigma-Aldrich公司，目录号：I2643-50MG），贮存温度：- 20 ℃下
盐酸发烟37％（默克，目录号：1.00317），存储温度：5/30 °C
消炎痛（Sigma-Aldrich，目录号：I7378-5G，储存温度：15/30 °C ）
油红色O（Sigma-Aldrich，目录号：O0625-25G，存储温度：15/30 °C ）
Trichome染色剂（Masson）试剂盒（Sigma-Aldrich，目录号：HT15-1KT，存储温度：RT ）
丙酮酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：S8636，储存温度：2/8 °C ）
人白蛋白（Institute Grifols，目录号：A4AFC03441，储存温度：2/25 °C ）
转化生长因子β 3（派普泰克公司制公司，目录号：100-36E，存储温度：- 20 ℃下）
4％多聚甲醛（Electron Microscopy Sciences，目录号：157-4-100），储存温度：2/8 °C
二甲苯（LabSynth ，目录号：X1001.01.BJ），储存温度：16/26 °C
石蜡（EasyPath ，目录号：EP-21-20068A），储存温度：15/30 °C
曙红（Sigma-Aldrich，目录号：HT110132），储存温度：RT
单克隆抗大鼠抗体：抗CD29（BD Biosciences，目录号：562154，存储温度：4 °C ）
单克隆抗大鼠抗体：抗CD31（BD Biosciences，目录号：555027，存储温度：4 °C ）
单克隆抗大鼠抗体：抗CD34（Invitrogen，目录号：11-0341-81，储存温度：4 °C ）
单克隆抗大鼠抗体：抗CD45（BD Biosciences，目录号：554878，存储温度：4 °C ）
单克隆抗大鼠抗体：抗CD90（BD Biosciences，目录号：554898，存储温度：4 °C ）
单克隆抗大鼠抗体：抗CD106（BD Biosciences，目录号：559229，储存温度：4 °C ）
传输介质（请参阅食谱）
胶原酶溶液（请参阅食谱）
胰蛋白酶溶液（请参阅食谱）
抗坏血酸和β-甘油磷酸酯溶液（参见食谱）
生长培养基（10％MEM）（请参阅食谱）
成骨分化培养基（请参见食谱）
软骨分化培养基（请参阅食谱）
脂肪细胞分化培养基（请参阅食谱）
地塞米松原液（200 μ中号）（见配方）
抗坏血酸储备溶液（20 mM）（请参阅食谱）
TGF-β3 （请参阅食谱）
油红色O染色（请参阅配方）

设备

剪刀（Quinelato ，目录号：QT.109.14）
镊子（Quinelato ，目录号：QC.301.14）
ERV -mount ® （的EasyPath ，目录号：EP-51-05041），存储温度：20 ℃的
微量移液器（Eppendorf，目录号s ：4921000028/4921000044/4921000079/4921000109/4921000117/4921000150）
分析天平M214A（BEL，货号：BL0003）
RT basic系列磁力搅拌器（Thermo Fisher Scientific，目录号：88880009）
pH台式测量仪（汉娜，目录号：HI5522-01）
Stericup 快速释放真空驱动的一次性过滤系统（Merck，目录号：S2GPU05RE）
真空泵和压缩机（Prismatec ，目录号：132）
气流II级生物危害安全柜（Esco Micro Pte.Ltd 。，型号：AC2-4E8）
微处理器水浴箱（Quimis ，目录号：Q215M）
CO 2 培养箱（Panasonic，Panasonic / Sanyo，型号：MCO-19AIC）
的Eppendorf ® 离心机5702（Sigma-Aldrich公司，目录号：Z606936）
Axiovert 25倒置显微镜用于高级常规操作（卡尔·蔡司）
紧凑型数字微孔板振荡器（Thermo Fisher Scientific，目录号：88880023）
Epoch 2微孔板分光光度计（BioTek ，目录号：BTEPOCH2）
5418 R离心机（埃彭多夫（Eppendorf），目录号：5401000013）
排气教堂（Lutech ，目录号：LCE-15）
立式冷冻机，231升（领事，目录号：CVU26EB）
无霜冰箱，342升（领事，目录号：CRB39AB）
超低温冰箱（松下，目录号：MDF-U500VXC-PA）
FACSCantoTM II（BD Biosciences，目录号：338962）
石蜡分配器（奥马，货号：IO-88）
切片机（Micron，GMI，目录号：8243-30-0001）

软件

第5代TS 2.06（BioTek Instruments Inc./ BioTek ，https: //www.biotek.com/products/software-robotics-software/gen5-microplate-reader-and-imager-software/ ）
BD FACSDiva TM 软件v8.0.3（https://www.bdbiosciences.com/zh-cn/instruments/research-instruments/research-software/flow-cytometry-acquisition/facsdiva-software）
StepOne 软件v2.3（Thermo Fisher Scientific / Applied Biosystems，https://www.thermofisher.com/br/en/home/technical-resources/software-downloads/StepOne-and-StepOnePlus-Real-Time-PCR-System .html）

程序

手术程序
根据当地法规，使用异氟烷对大鼠实施安乐死。
用1％的碘化乙醇完全沐浴消毒大鼠（图1A），并用2.5％的洗必泰擦拭腹部和下肢。
将大鼠转移到无菌手术单中。
戴无菌外套，口罩，帽子和手套。
为防止污染，用无菌剪刀和镊子，以做一个小切口，双边的腿胫关节区域（图1B）的皮肤。
使用该切口作为进入点，向腹部和腹股沟区域进行双侧渗出。
进行水平切割以连接先前制作的两个切口（图1B）。
使用＃15手术刀刀片连接到电缆＃3，双侧切断tell骨肌腱，外侧和内侧副韧带，露出关节囊。
进行双侧关节囊泄漏。
去除肌肉组织以暴露股骨的前部（图1C）。
切下剩余的韧带，使股骨髋关节脱节。
去除股骨，并迅速清除附着在骨骼上的大部分肌肉和结缔组织。
将股骨转移到装有15 ml运输介质的50 ml锥形管中。
从腹部和腹股沟区域收回皮肤（图1D）。
小心地去除所有脂肪组织而不刺破腹壁，并将其转移到装有15 ml传输介质的50 ml锥形管中。
将包含脂肪组织和股骨的锥形管移至层流罩。

D：\ Reformatting \ 2020-1-6 \ 1902730--1292 Adalberto Rosa 753853 \ Figs jpg \图1.jpg

图1.收获股骨和一个只Wistar大鼠体重150的脂肪组织的外科手术- 200克。A.安乐死后用1％碘化乙醇对动物进行消毒。B.切口的示意图。C.肌肉去除和股骨暴露。D.皮肤回缩以及腹部和腹股沟脂肪组织的暴露。

BM-MSC分离和培养程序
将股骨从锥形管转移到装有70％乙醇的玻璃组织培养皿中。
在1分钟内，用无菌剪刀，镊子和15号手术刀刀片除去剩余的结缔组织。
将股骨转移至装有2.5％洗必泰的新玻璃培养皿中。
1分钟内，用无菌剪刀，镊子和15号手术刀刀片清洁剩余的结缔组织（图2A）。
将股骨转移到新的锥形管中，该锥形管中含有15 ml的运输培养基，并在室温下孵育15分钟。
再次，将股骨转移至含有15 ml转运培养基的新锥形瓶中，并在室温下孵育15分钟。
最后，将股骨转移至含有15 ml转运培养基的新锥形瓶中，并在室温下孵育15分钟。
将该锥形管的内容物转移到玻璃组织培养皿中。
用生长培养基填充20毫升注射器，并连接21G针头。
用镊子夹住股骨，并用无菌剪刀剪掉骨epi（图2B）。
将充满生长培养基的注射器针头插入骨干，并将所有骨髓冲洗到新的50 ml锥形管中（图2C）。
在室温下以600 xg离心5分钟。
弃去上清液，将沉淀重悬于新的生长培养基中（每股股骨2 ml）。
将2 ml这种悬浮液转移到装有10 ml生长培养基的75 cm 2 细胞培养瓶中。
在37°C的恒温箱中，在含有5％CO 2 和95％空气的潮湿气氛中，将烧瓶保温。
24小时后，用1x PBS轻轻冲洗烧瓶三遍，并用新鲜的生长培养基替换。
每两天更换一次培养基，直到细胞生长到70％融合为止。
注意：在生长培养基中培养7天后，从每只动物的每个股骨中产生大约5 x 10 6个MSC。

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图2.从股骨中提取骨髓。答：清洁股骨。B.骨epi切片后骨髓腔暴露。C.使用针头和注射器用生长培养基冲洗骨髓。

AT-MSC分离和培养程序
将脂肪组织从50 ml锥形管转移到装有1x PBS的玻璃组织培养皿中，以冲洗组织。
将脂肪组织转移到新的玻璃组织培养皿中（图3A）。
使用无菌剪刀剁碎的脂肪组织切成小块，大约1 - 2毫米3 （图3B）。
将切碎的碎块转移到装有20 ml胶原酶溶液的50 ml锥形管中（图3C）。
将试管置于37°C水浴中振摇40分钟。
向含有脂肪组织和胶原酶溶液的50 ml锥形管中加入20 ml生长培养基。
将含有脂肪组织，胶原酶溶液和生长培养基的锥形管以600 xg离心5分钟。
弃去上清液，然后将沉淀重悬于新的生长培养基中（每只脂肪组织从1只动物中取出5毫升）。
将5毫升这种悬浮液转移到装有10毫升生长培养基的75 cm 2 细胞培养瓶中。
在37°C的恒温箱中，在含有5％CO 2 和95％空气的潮湿气氛中，将烧瓶保温。
24小时后，用1 x PBS 轻轻洗涤烧瓶3次，并用新鲜的生长培养基替换。
每两天更换一次培养基，直到细胞融合至70％。
注意小号：

在生长培养基中培养7天后，从每只动物的脂肪组织中产生了大约5 x 10 6个MSC。
通常，在7天内，MSC达到融合的70％，并准备用于后续实验（图4）。

D：\ Reformatting \ 2020-1-6 \ 1902730--1292 Adalberto Rosa 753853 \ Figs jpg \图3.jpg

图3.腹部和腹股沟脂肪组织的酶消化。A.收获的脂肪组织。B.用无菌剪刀和镊子将脂肪组织切成小块。C.将脂肪组织碎片转移至II型胶原酶溶液中，以进行酶消化和细胞分离。

D：\ Reformatting \ 2020-1-6 \ 1902730--1292 Adalberto Rosa 753853 \ Figs jpg \图4.jpg

图4.相差显微照片，显示了在生长培养基中和在聚苯乙烯培养皿上培养长达7天的BM-MSC和AT-MSC的形态。24小时后，BM-MSC和AT-MSC均已附着在聚苯乙烯培养皿上，其形态为圆形/椭圆形。培养细胞时，它们增殖并变得细长，多边形和纺锤形。比例尺= 100 µm。

BM-MSC和AT-MSC的表征
用1x PBS洗涤烧瓶3次。
将5 ml胰蛋白酶溶液加入烧瓶中，并于37孵育5分钟 ° Ç 。
向烧瓶中加入2.5 ml新鲜生长培养基，将细胞悬浮液转移到50 ml锥形管中，并以600 xg离心5分钟。
丢弃上清液。
用1x PBS洗涤细胞沉淀一次。
将细胞悬液以600 x g 离心5分钟。
丢弃上清液。
将5 ml 1x PBS加入细胞沉淀并混合细胞悬液。
在血细胞计数器（Neubauer Chamber）中计数细胞。
调整细胞悬液的浓度，用1x PBS 获得2 x 10 5个细胞/ ml 的密度。
向每个流式细胞仪管中加入1 ml细胞悬液（每种特异性抗体一个管，一个同种型对照管，一个不带有抗体标记细胞的管）。
将流式细胞仪试管以600 x g 离心5分钟。
丢弃上清液。
向细胞沉淀中加入100 µl 1x PBS，并轻拂/轻敲试管进行混合。
将每支试管与2 µl以下单克隆抗大鼠抗体在黑暗中于室温孵育30分钟：抗CD29，-CD31，-CD34，-CD45和-CD106，直接与荧光团偶联（抗体最终稀释度： 1:50）。对于直接与荧光团偶联的单克隆抗大鼠抗体-CD90 ：在1x PBS中按1：5稀释抗体，然后将2 µl加入细胞悬液中（抗体最终稀释度：1：250）。
将2 µl同型对照加入相应的试管中。
用2毫升1x PBS洗涤细胞。
以600 xg 离心5分钟。
丢弃上清液。
加入在1x PBS中稀释至1％的0.5 ml甲醛溶液（4％）。
通过流式细胞仪分析细胞（图5和6）。

D：\ Reformatting \ 2020-1-6 \ 1902730--1292 Adalberto Rosa 753853 \ Figs jpg \图5.jpg

图5.在聚苯乙烯培养皿上的生长培养基中培养7天的BM-MSC的流式细胞仪分析。直方图显示与相应抗体孵育后表面标记CD29，CD90，CD106，CD31，CD34和CD44的表达。还将细胞与同型FITC-A和PE-A孵育，用作阴性对照。高百分比的BM-MSC表达CD29，CD90和CD106（分别为98.7％，98.7％和28.7％），低百分比表达CD31，CD34和CD44（分别为7.8％，0.4％和0.3％））。

D：\ Reformatting \ 2020-1-6 \ 1902730--1292 Adalberto Rosa 753853 \ Figs jpg \图6.jpg

图6.在聚苯乙烯培养皿上的生长培养基中培养7天的AT-MSC的流式细胞仪分析。直方图显示与相应抗体孵育后表面标记CD29，CD90，CD106，CD31，CD34和CD44的表达。还将细胞与同型FITC-A和PE-A孵育，用作阴性对照。高百分比的AT-MSC表达CD29，CD90和CD106（分别为99.9％，99.3％和41.8％），低百分比表达CD31，CD34和CD44（分别为7.6％，5.3％和0.2％））。

成骨细胞分化
当BM-MSC或AT-MSC达到70％融合时，请去除生长培养基。
用1x PBS洗涤烧瓶3次。
将5 ml胰蛋白酶溶液加入烧瓶中，并在37 °C 下孵育5分钟。
将2.5 ml新鲜的生长培养基添加到烧瓶中，将细胞悬浮液转移到50 ml锥形管中，并以600 x g 离心5分钟。
丢弃上清液并将细胞沉淀重悬在新的生长培养基中。
计数细胞，并将其以2 x 10 4个细胞/ 孔的细胞密度接种在1 ml成骨培养基中的24孔培养板中或1 x 10 5个细胞/孔的2 ml成骨培养基中的6孔培养板中。
在实验过程中，将板在培养箱中于37°C，含有5％CO 2 和95％空气的潮湿气氛中孵育。
每2天更换一次培养基。
Ť 他的细胞外基质矿化能够在培养21天观察。

茜素红染色
为了确认成骨细胞的分化，我们使用的方法之一是通过茜素红染色检测矿化的细胞外基质。

从每个孔中移出培养基，并用1x PBS轻轻洗涤细胞3次。
加入10％福尔马林，并在4 °C 下孵育24小时（24孔板– 500 µl； 12孔板–1 ml； 6孔板– 2.4 ml）。
除去10％福尔马林，并使用浓度递增的乙醇（30 ％，50 ％，70 ％和96 ％）将细胞脱水，每次1小时（24孔板– 500 µl； 12 孔板– 1 ml； 10孔板– 500 ml）。 6孔板– 2.4毫升）。
除去96％的乙醇，在室温下孵育直至孔干燥。
用茜素红染色覆盖孔，在室温下孵育10分钟。
用去离子水洗涤一次，并在室温下孵育直至孔干燥。
拍摄孔的宏观（图7）和微观照片。
注意：通常，与我们之前观察到的相比，与AT-MSC相比，BM-MSC更致力于成骨细胞分化（Abuna 等，2016）。

D：\ Reformatting \ 2020-1-6 \ 1902730--1292 Adalberto Rosa 753853 \ Figs jpg \图7.jpg

图7. 在聚苯乙烯培养皿中在成骨性培养基中培养21天后，在BM-MSC和AT-MSC培养物中通过茜素红染色检测到的矿化细胞外基质

软骨母细胞分化
当BM-MSC和AT-MSC培养物达到70％融合时，请去除生长培养基。
用1x PBS洗涤烧瓶3次。
将5 ml胰蛋白酶溶液加入烧瓶中，并在37°C 下孵育5分钟。
向烧瓶中加入2.5 ml新鲜生长培养基。
将此细胞悬液转移至50 ml锥形管中，并以600 xg 离心5分钟。
丢弃上清液。
将细胞重悬于软骨母细胞分化培养基中，密度为1.25 x 10 6 细胞/ ml。
用移液器将200 µl细胞悬液等分试样（2.5 x 10 5个细胞）分配到聚丙烯96孔板的每个孔中。
将板以500 xg离心5分钟。
加入200 微升1×PBS中的入空孔，以最小化培养基的蒸发。
在实验过程中，将板在培养箱中于37°C，含有5％CO 2 和95％空气的潮湿气氛中孵育。
温育24小时后，可见细胞聚集体，并且在培养30天后观察到软骨形成表型。
每两天更换一次培养基，方法是使用200μl 无菌移液管小心吸出过期的培养基，并向每个孔中添加200μl 新鲜的软骨形成培养基。

三色染色
为了确认软骨母细胞的分化，我们使用的方法之一是用三色染色法检测胶原纤维。

使用微量移液器，去除软骨细胞分化培养基。
加入200 微升1×PBS中的到每个孔中。
使用微量移液器除去PBS。
在室温下添加200μl4 ％多聚甲醛5分钟。
除去多聚甲醛。
用1x PBS清洗每个孔，每次2次，每次3分钟。
在室温下用曙红对细胞聚集体染色5分钟。
除去曙红，用1x PBS洗涤2次，每次3分钟。
使用1 ，000微升微量，收获所述聚集体，并将它们传送到1.5毫升的微管。
将细胞聚集体放入1.5 ml微量管中，以300 µl梯度乙醇系列（分别为70 ％，80 ％，90 ％，95 ％和100 ％，每5分钟）脱水。
除去100 ％乙醇，并在300 µl二甲苯中进行三个澄清步骤，每个步骤3分钟。
将石蜡在热表面上将聚集体嵌入模具中5分钟，然后将每个模具转移到冷表面上。
使用切片机切割相邻的5μm 切片。
在60°C的培养箱中将石蜡切片脱蜡过夜。
分三步在二甲苯中对石蜡进行脱蜡，每次5分钟，然后通过在乙醇系列（100 ％，95 ％，90 ％，80 ％和70 ％，每次3分钟）中孵育使切片重新水化。
用去离子水清洗切片5分钟。
在室温下用酸性品红（HT15-1）染色5分钟。
用水洗涤5分钟。
在室温下用磷钼酸（HT15-3）和磷钨酸（HT15-2）的工作溶液染色5分钟。
在室温下用苯胺蓝溶液将切片染色5分钟。
除去过量的苯胺蓝，并加入1％的乙酸溶液3分钟。
用自来水冲洗切片3分钟。
以梯度乙醇系列（分别为70 ％，80 ％，90 ％，95 ％和100 ％，每次1分钟）脱水切片，然后在二甲苯中进行三个澄清步骤，每次1分钟。
安装使用幻灯片ERV -mount ® 。
拍摄组织切片的显微照片（图8）。
注意：细胞质染成红色，胶原纤维染成蓝色。

D：\ Reformatting \ 2020-1-6 \ 1902730--1292 Adalberto Rosa 753853 \ Figs jpg \图9.jpg

图8.在超低簇96孔板的软骨形成培养基中培养30天的BM-MSC和AT-MSC中，通过三色染色检测的胶原纤维（蓝色）和细胞质（红色）。比例尺= 100 µm。

脂肪细胞分化
当BM-MSC和AT-MSC培养物达到70％融合时，请去除生长培养基。
用1 x PBS 洗涤烧瓶三遍。
将5 ml胰蛋白酶溶液加入烧瓶中，并在37°C 下孵育5分钟。
向烧瓶中加入2.5 ml新鲜生长培养基。
将此细胞悬液转移至50 ml锥形管中，并以600 xg 离心5分钟。
丢弃上清液并将细胞沉淀重悬在新鲜的生长培养基中。
计数细胞，并将其以2 x 10 4个细胞/ 孔的细胞密度接种于1 ml 脂肪形成培养基板中的24孔培养皿中，或以1 x 10 5个细胞/孔置于2 ml 脂肪形成培养基中的6孔培养皿中接种。。
在实验过程中，将板在培养箱中于37°C，含有5％CO 2 和95％空气的潮湿气氛中孵育。
每2天更换一次培养基。牛逼，在培养了十天时间观察他胞浆内脂滴。

油红O染色
为了确认脂肪细胞的分化，我们使用的方法之一是用油红O染色检测胞浆内脂质滴。

从每个孔中移出培养基。
加入10％福尔马林，在室温下孵育5分钟（24孔板– 500 µl，12孔板– 1 ml，6孔板– 2.4 ml）。
丢弃10％福尔马林，并加入相同体积的新鲜10％福尔马林。孵育至少1小时。
注意：在染色前，细胞可以在福尔马林中保存几天。将平膜包裹在板上，以防止细胞干燥，并用铝箔覆盖板。

使用小型移液管移出10％福尔马林。
用60％异丙醇（24孔板– 500 µl，12孔板– 1 ml，6孔板– 2.4 ml）洗涤孔。
让孔完全干燥。
加入油红色的O染色工作溶液10分钟（请勿触摸孔壁）。
去除油红色的O染色，并立即添加去离子水（重复此步骤4次）。
除去所有去离子水，在室温下孵育干燥。
使用相差显微镜对孔成像（图9）。
注意：通常，与我们之前观察到的相比，与BM-MSC相比，AT-MSC更致力于成脂分化（Abuna 等，2016）。

D：\ Reformatting \ 2020-1-6 \ 1902730--1292 Adalberto Rosa 753853 \ Figs jpg \图8.jpg

图9. 在聚苯乙烯培养皿中的成脂培养基中培养10天的BM-MSC和AT-MSC 中，通过油红O染色检测到的胞质内脂质滴。比例尺= 100 µm。

菜谱

运输介质
注意：刚使用前准备新鲜，并保持在37 °C下。

57毫升的阿尔法最低必需培养基（α-MEM）

3毫升庆大霉素（50微克/毫升）

720 µl两性霉素B（0.3 µg / ml）

胶原酶溶液
注意：刚使用前准备新鲜，并置于RT 。

15 mg II型胶原酶（0.075％）

20毫升1x PBS

使用20 ml注射器和0.2 µm过滤器在层流罩中将该溶液过滤到50 ml锥形管中。

胰蛋白酶溶液
注意：刚使用前准备新鲜，并置于RT 。

19毫升胰蛋白酶（0.25％）

500 µl II型胶原酶（1.3 mg / ml）

1毫升EDTA（1毫米）

抗坏血酸和β-甘油磷酸酯溶液
注意：事先准备好，在4 °C下保存最多7天。

5 mg抗坏血酸（5 µg / ml）

2.16克β-甘油磷酸酯（7毫米）

10毫升去离子水

使用20 ml注射器和0.2 µm过滤器在层流罩中将该溶液过滤到50 ml锥形管中。

生长培养基（10％MEM）
注意：事先准备好，在4 °C下保存30天。

360毫升的α-MEM

40毫升胎牛血清

2毫升庆大霉素（50微克/毫升）

500 µl两性霉素B（0.3 µg / ml）

成骨分化培养基
注意：事先准备好，在4°C下保存长达30天。

400 ml生长培养基

4毫升地塞米松（10 - 7 M）

1％抗坏血酸和β-甘油磷酸酯溶液

注意：在使用培养基之前，应立即添加抗坏血酸和β-甘油磷酸溶液。

软骨分化培养基
注意：事先准备好，在4 °C下保存30天。

100毫升D-MEM

100 µl丙酮酸钠（100 mM）

100 µl地塞米松（1 mM）

250 µl抗坏血酸（20 mM）

1 ml人白蛋白（0.02％）

20 µl / ml转化生长因子β3（TGF-β3，1 µg / ml）。

注意：在使用培养基之前，应立即添加TGF-β3。

脂肪细胞分化培养基
注意：事先准备好，在4 °C下保存30天。

180毫升D-MEM

20毫升胎牛血清（10％）

2毫升庆大霉素（50微克/毫升）

250 µl两性霉素B（0.3 µg / ml）

2毫升地塞米松（10 - 6 M）

2毫升3 - 异丁基-1-甲基黄嘌呤（0.5毫摩尔）

260毫升吲哚美辛（0.1 M）

150微升胰岛素（10毫克/毫升）

地塞米松原液（200 µM）
注意：预先制备，保持在- 20 ℃。

地塞米松以200 µM的浓度溶于绝对的乙醇和去离子水中

抗坏血酸原液（20 mM）
注意：事先准备好，在4 °C下保存最多7天。

在1x PBS中制备20 mM抗坏血酸的储备溶液

转化生长因子β3
注意：刚使用前准备新鲜，并置于RT 。

A 1 微克/ ml储备TGF-β3的溶液在1×PBS和0.5％人白蛋白制备。

油红O染色
油红O原液

注意：事先准备好，在室温下保存长达6个月。

将油红色O（700毫克）添加到200毫升异丙醇中，搅拌过夜，然后通过0.2微米过滤器。

油红O工作液

将6份油红色O储备溶液与4份去离子水混合，并在室温下孵育20分钟。

致谢

这项研究由圣保罗州研究基金会（FAPESP，巴西，＃2017 / 12622-7），国家科学技术发展委员会（CNPq ，巴西，＃305523 / 2013-9和404318 / 2016-9）资助，以及提高高等教育人员的协调能力（CAPES，巴西）。由FAPESP（＃2018 / 17356-6）资助的ENAGO （www.enago.com）进行了英语审查，该协议是根据这些工作改编的（Maniatopoulos 等，1988; Huang 等，2002; Penick 等，2005）。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

伦理

所执行的所有程序均根据国际，国家和/或机构动物保健指南的道德标准执行。圣保罗大学RibeirãoPreto 牙科学院动物研究伦理委员会（＃2018.1.30.58.8）审查并批准了我们在此所做的所有动物程序。

参考文献

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