材料和试剂

用料

鹘® 15米升聚苯乙烯离心管中，锥底，具有圆顶密封螺帽（康宁，目录号：352095）
组织培养皿，35 x 10 mm REF（Corning，目录号：353001）
组织培养皿，60 x 15毫米（Corning，目录号：353002）

细胞

C2C12电池（ATCC，目录号：CRL-1772 TM ）
Millay 等人产生了Myomaker缺陷的C2C12细胞和Myomerger缺陷的C2C12细胞。（2016年）; 奎因等。（2017）并在胶原蛋白涂层的基材上生长

试剂种类

Vybrant TM DiI 细胞标记溶液（Thermo Fisher Scientific，目录号：V22885）
CellTracker TM Green CMFDA（5-氯甲基荧光素二乙酸酯）（Thermo Fisher Scientific目录号：C7025）
橙色CMRA CellTracker TM （Thermo Fisher Scientific，目录号：C34551）
胰蛋白酶-EDTA 0.05％（Thermo Fisher，目录号：25300054）
Hoechst 33342三盐酸盐，三水合物-10 mg / ml水溶液（Thermo Fisher Scientific，目录号：H3570）
在磷酸盐中缓冲的10％福尔马林（电子显微镜科学，目录号：15740）
小牛皮肤的胶原蛋白（Sigma，目录号：C8919-20 ml）
二甲基亚砜（DMSO，Sigma，目录号：D2650-100 ml）

媒体

增殖培养基（PM）：DMEM，高葡萄糖，GlutaMAX TM 补充剂（Thermo Fisher，目录号：10566-016）+ 10％胎牛血清，青霉素/链霉素（Thermo Fisher，目录号：10378016）
分化培养基（DM）：DMEM，高葡萄糖，GlutaMAX TM 补充剂（Thermo Fisher，目录号：10566-016）+ 5％马胎血清，青霉素/链霉素
胎牛血清，FBS（GIBCO生命Ť echnologies，目录号：10437-028）
源自新西兰的热灭活马血清（Thermo Fisher，目录号：26050088）
PBS，康宁® 贝科的磷酸盐缓冲液（生命科学，目录号：21-030-CV），1个与钙和镁

设备

蔡司轴向显微镜
摄像头（厂商PCO -tech INC。，pco.edge 3.1 SCMOS ）
F-LD 32 / 0.4蔡司物镜
用于绿色细胞跟踪仪的单个荧光团带通滤光片：Semrock 激发472 nm / 30 nm，发射520 nm / 35 nm，二向色性495 nm LP
用于DiI的单个荧光团带通滤光片：蔡司（Zeiss）激发545 nm / 25 nm，发射605 nm / 70 nm，二向色570 LP

软件

Micro-Manager软件（Edelstein 等，2014）
开源平台ImageJ（美国国立卫生研究院，罗克维尔·派克，贝塞斯达，医学博士

程序

图2给出了制备用于脂质混合实验的细胞的时间表的示意图。

图2.为脂质混合实验准备和标记细胞的时间表示意图。细胞的标记开始48 小时后的分化（即，48 将细胞置于成DM后小时）。分化后49 小时1小时后，将不同标记的细胞混合。

胶原蛋白涂层餐具
Ç 燕麦的菜（60×15 通过覆盖培养皿用3ml或1.5毫升1:10溶液毫米）（两个菜对于每种条件）和35×10mm的培养皿（5个菜对于每种条件）与胶原的胶原蛋白在将无菌水分别用于60 x 15毫米培养皿和35 x 10毫米培养皿，并在室温下过夜孵育并用水洗涤两次（分别用于大和小的培养皿，分别洗涤3毫升和2毫升），然后在生物安全柜。

细胞
使C2C12细胞在胶原蛋白涂层培养皿中的增殖培养基（PM）中生长至75％融合度。将细胞转移至分化培养基（DM）（t = 0）。分化后 48 小时（t = 48 小时），细胞扩散至约90％融合，并观察到第一个肌管。此时，用2 ml PBS清洗两个培养皿中的每个细胞，然后将细胞放入2 ml新鲜PBS中。

细胞标记
用CellTracker TM Green 标记培养皿1中的细胞，并用Orange CMRA CellTracker 或DiI 标记培养皿2中的细胞。用CellTracker TM 绿色标记；添加4 μ 升的的CellTracker TM （50绿原液μ 克在20探针的μ 升在此培养基中，在37 DMSO的）至2毫升的PBS孵育细胞15分钟° C.然后把细胞进入在37 ° C下30分钟完成DM处理。使用相同的步骤对Orange CMRA CellTracker 进行标记。为了标记细胞的DiI ，注射4 μ 升的1种mM的的DiI 储备溶液于2ml的PBS中，在37 ° C和孵育细胞45分钟。用2 ml DM洗涤皿1和2中的细胞三遍，并用2 ml PBS洗涤两次。

共镀不同标记的细胞
在37 ° C下用1 ml的胰蛋白酶-EDTA 0.05％轻轻孵育1和2皿中的细胞，持续1分钟。在随后的2-3分钟已经在室温下孵育的过程中，检查细胞是否开始聚集。电梯。完成后，取出EDTA-胰蛋白酶，将细胞在37 ° C的条件下移入4 ml完全DM中。将培养皿1和2的细胞收集到同一15 ml试管中，并涡旋混合。将体积调整为10毫升。然后将细胞（2 ml细胞悬液）铺在五个胶原蛋白处理过的小皿中（35 x 10 mm）。两个小时后，通过更换新鲜DM的培养基去除碎片和未附着的细胞。
使用标记有不同CellTracker 的细胞的复制来分析细胞之间的内容混合。在没有内容混合的情况下，对用CellTracker TM Green 标记的细胞和用DiI 标记的细胞进行交配以分析脂质混合。
在t = 72小时，在室温下用10％福尔马林在磷酸盐缓冲液中固定细胞10分钟。在室温下放置30 分钟，用补充了Hoechst的PBS（10 mg / ml稀释1,000 倍的PBS）代替福尔马林以染色细胞核。用PBS代替补充Hoechst的PBS。采取上的图像一个利用合适的激发和发射滤光片的荧光显微镜。

数据分析

我们分析ImageJ中的图像。首先，使用只有绿色和红色单元格的板，我们验证了在使用的设置下，绿色和红色通道之间的渗漏可以忽略不计。在共镀CellTracker TM 绿色标记细胞和橙色CMRA CellTracker 标记细胞的实验图像中，在融合孔开放阶段中止融合的细胞将被检测为与两种探针共标记的单核细胞。小号Ø到目前为止，我们已经观察到这种表型仅适用于由病毒介导的fusogens融合。
在共镀DiI 标记的细胞和CellTracker TM Green标记的细胞的实验图像中，看到了在半融合阶段中止融合的细胞，并将其记为与两种探针共标记的单核细胞。图3、4和5显示了代表性的荧光显微镜图像，我们使用d 来分析脂质探针（DiI ）和含量探针（CellTracker TM Green）在体内的重新分布。 Myomerger -/-（图3）; Myomaker -/- （图4）和WT（图5）C2C12细胞。

图3. 缺乏Myomerger 的C2C12细胞的代表性荧光显微镜图像，通过分析脂质探针（Dil ）和含量探针（CellTracker TM Green）的再分布来评估脂质混合的效率。将Dil 标记的细胞与CellTracker TM 绿色标记的细胞在分化培养基中共同孵育后的细胞图像。核被赫斯特染色。箭头表示已计数或未计数为与Dil 和CellTracker TM Green 共标记的单核细胞的几种不同表型的例子。A和B标记具有Dil 荧光强度（A）和（B）较弱的共标记细胞。像标记为A和B的细胞被计为共标记的单核细胞。标记有唯一的细胞CellTracker TM 绿色（C），或仅语（d），或绿色细胞只用一个红点（E）或具有多于一个核（F）的细胞不计为共标记的单核细胞。规模BA - [R = 50 μ米。

图4. Myomaker缺陷型C2C12细胞的代表性荧光显微镜图像，用于通过分析脂质探针（Dil ）和含量探针（CellTracker TM Green）的再分布来评估脂质混合的效率。将Dil 标记的细胞与CellTracker TM Green标记的细胞在分化培养基中共同孵育后的细胞图像。核被赫斯特染色。箭头表示与Dil 和CellTracker TM Green 共标记的单核细胞的例子。比例尺= 50 μ 米。

图5.野生型（WT）C2C12细胞的代表性荧光显微镜图像，用于通过分析脂质探针（Dil ）和含量探针（CellTracker TM Green）的再分布来评估脂质混合的效率。将Dil 标记的细胞与Cell Tracker TM Green标记的细胞在分化培养基中共同孵育后的细胞图像。核被赫斯特染色。箭头表示与Dil 和CellTracker TM Green 共标记的单核细胞的例子。箭头标记了共贴合胞体的一个例子。比例尺= 50 μ 米。

要识别的DiI 标记的单核CellTracker TM 绿色标记的细胞，我们使用了下面的过程。首先，我们找到了约100个没有绿色荧光的DiI 标记细胞中最大DiI 荧光水平F max 的中值。我们使用以下值使用以下公式来设置用于检测DiI重分布的荧光下限：

我们发现k = 0.1很好地排除了通过融合无关机制获得DiI 荧光的细胞。为了计算共标记的细胞，我们通过将“ 亮度/对比度”工具中的最小值设置为F min 来调整图像对比度，然后选择最大值以显示最微弱的点。此后，我们将具有至少3个不同的核周定位的DiI小点的所有绿色细胞视为共同标记。（我们偶尔发现与细胞表面相关的1-2个亮红色点可能代表了碎片或细胞外囊泡，并且相应的细胞没有被标记为共同标记。）

为了量化为半融合我们正常化单核的数目在不同条件下的效率双- 标记的Ç 由该领域的单核细胞的总数中的视场厄尔。对于各条件，我们得分至少10个RANDO 米升的视图y经选择字段。该特性结果Myomerger 缺陷细胞，Myomaker 缺陷细胞和野生型（WT）细胞显示在图URE 6 。

图6.通过脂质混合测定法对半融合进行定量。在没有Cell Tracker TM Green 的情况下，半融合在操作上被定义为Dil 重新分布，并检测为以Dil 和CellTracker TM Green 标记的单核细胞的形成。数据表示和统计分析：箱须图显示中位数（中心线），第25-75％百分位数（框）以及最小值和最大值（须晶）；用Mann-Whitney检验评估统计学显着性。

合胞体被视为亮双标记或单- 标记的多核（正≥ 由融合产生的2）细胞涉及不同- 标记的和分别类似地标记的细胞。半融合效率，即在给定条件下细胞半融合但不会继续融合完成的概率，通过标准化视野中半融合事件的数量来量化（单核双标记细胞相对于该细胞核总数）。领域）。假设每个完全融合事件都是通过半融合中间体进行的，则产生半融合或完全融合的局部膜融合事件的效率可以量化为（N hf + N cf ）/ N t ，其中N hf 是半融合事件的数量，ñ CF 中，完整的融合事件的数（估计为在细胞中的核的具有至少2个核数）和ñ 吨，在此字段中的核的总数。

笔记

针对不同细胞-细胞融合过程的测定方法的修改

脂质混合测定已成功适应于原代鼠成肌细胞的融合（Gamage 等，2017; Leikina 等，201 3和201 8 ），HAP2介导的BHK细胞融合（Valansi 等，2017）和破骨细胞前体（Verma 等人，2018）。所需的修改大部分反映了细胞融合过程特征速率的差异，因此需要调整标记阶段的相对时间。例如，在PM而不是DM中标记比C2C12细胞分化和融合更快的原代鼠成肌细胞（Leikina 等人，2013）。然后将不同标记的细胞共铺在DM中，开始成肌分化和融合。
在Valansi 等人（2017）和Leikina 等人（2018）中，我们使用了脂质混合测定的一种改进方法，在该方法中，我们将脂质标记的细胞和内容探针标记的细胞与未标记的细胞共接种，而不是将标记的细胞共接种。带有膜探针和标记有内容探针的细胞。在该实验设计中，停滞在半融合阶段的细胞融合产生了带有膜标记的细胞，但没有标记内容物的细胞。该分析方法的应用要求使用在未标记的细胞不存在的情况下培养的用膜和内含探针标记的细胞进行对照实验，以验证仅用膜探针标记的细胞是通过标记的和未标记的细胞之间的相互作用产生的，而不是通过内含探针泄漏产生的。

关注和控制

开发用于非常缓慢融合过程的脂质混合测定法的一个重要问题与脂质探针通过脂质交换蛋白，脂质微团或细胞外囊泡从膜到膜的转移能力有关（在Merklinger 等人，2016 综述），即通过不依赖于细胞融合机制的机制。DiI是用于我们的测定的脂质探针，已开发用于长期标记，经过精心优化后，DiI 和类似的脂质探针已被用于跟踪组织中的单个细胞数天甚至数周（Progatzky 等人综述）。，2013年）。仍然，基于DiI 的脂质混合测定法在缓慢融合过程中的应用需要一套控制措施，以确保脂质探针的重新分布是由于膜合并而不是由于探针的不依赖融合的转移。如果在某些条件下，脂质探针的不依赖于融合的重新分布主导了融合依赖性的再分配，则应改变条件以减少脂质探针在膜之间转移的与融合无关的成分。为了优化实验程序，我们使用缺乏功能性融合机制的细胞（增殖卫星细胞，在DM 中分化成肌细胞缺陷型成肌细胞，以及在存在半融合抑制剂溶血磷脂酰胆碱的情况下分化成肌细胞[ Leikina 等，2013 ] ）。有助于融合-的主要因素独立脂质混合是细胞标记协议（探针浓度和温育时间），洗涤次数，细胞存活率（以最小化细胞碎片）和融合效率细胞的细节（以增加的相对膜合并依赖性脂质混合的贡献）。另外，太高的细胞单层融合度会导致荧光显微镜图像中未检测到的绿色细胞与红色细胞之间的重叠。
缺乏Myomaker 的C2C12细胞和缺乏Myomerger 的C2C12细胞为脂质混合测定提供了方便的对照。如图6中看到的，Myomerger 缺陷细胞表现出高得多的水平比脂质混合Myomaker 缺陷细胞。重要的是，我们表明，脂质探针传递Myomerger 缺陷细胞不同标记的细胞之间的依赖于触点，而不是通过所述介质的转移（例如，通过细胞外囊泡）中，由在从条件培养基中培养未标记的分化细胞的DiI -标记的分化细胞（图7）。

图7.代表性的荧光显微镜图像，其说明了与来自Dil 标记的细胞的条件培养基一起温育的未标记细胞对细胞的融合不依赖于Dil 的获取。如上所述，在分化后t ＝ 72小时收集来自Myomerger缺陷细胞的条件培养基，所述条件培养基致力于分化并如上所述用Dil 标记。在另一皿中，在t ＝ 24小时将未标记的分化性Myomerger缺陷细胞置于该条件培养基中。在t = 72 h，将这些细胞固定并分析。比例尺= 50 μ 米。

如预期的那样，在这些实验中，我们仅发现获得脂质探针的细胞很少，而没有包含超过3个位于核周附近的不同DiI 点的细胞。在这个实验设计，找到的显著数量的DiI - 标记的细胞会建议与问题的DiI 标记。

可以通过不使用脂质混合测定的独立实验方法进一步验证脂质混合测定中半融合表型的鉴定。这两种方法（低渗性休克或氯丙嗪的短期应用）通过将半融合中间体转化为易于检测的完全融合来揭示半融合中间体（Meliyan 等，1997；Chernomordik 等，1998）。低渗渗透性休克产生的膜张力会破坏半融合结构，氯丙嗪优先分配到质膜的内部单层，并使这些单层形成的半融合中间体不稳定。如果应用于紧密结合的细胞而不是半融合的细胞，这两种治疗方法都不会诱导完全融合。

致谢

LVC实验室的研究得到了Eunice Kennedy Shriver国家儿童健康与人类发展研究所，国立卫生研究院的校内研究计划的支持，并获得了美国-以色列国家双赢科学基金会（BSF）的2013151资助。此处描述的协议已在Leikina 等人201 3和2018中开发。

利益争夺

作者宣称没有任何竞争性的金融或非金融利益。

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