材料和试剂

小号yringe无针（1毫升，Dutscher ，目录号：8SS01H1）
剃刀（19 x 38 x 0.27 mm，Dutscher ，目录号：320529）
滑轨（76 x 26 mm，Dutscher ，目录号：06962 ）
盖玻片（22 x 32 mm，Dutscher ，目录号：100034M）
镊子（P inceàéchardeforme pointue，Dutscher，目录号：711197）
植物材料（请参阅步骤A）
苯胺蓝（澳大利亚生物材料公司，目录号：100.1），在4°C下储存
注意：苯胺蓝储备溶液在水中为1 mg / ml。苯胺蓝工作溶液为0.025 mg / ml。当目标蛋白被GFP标记时，请勿使用更高浓度的苯胺蓝，否则苯胺蓝信号将与GFP信号串扰。

蒸馏水
Luria和Bertani培养基（LB brot h Miller，Sigma -Aldrich ，目录号：L3152）
蔗糖（Sigma -Aldrich ，目录号：S7903）

设备

共聚焦显微镜：使用蔡司显微镜（蔡司，型号：LSM880）进行植物成像
28°C摇动培养箱（Dutscher ，MaxQ 4000，货号：078381）
离心机（d utscher ，Spectrafuge 6下10毫升管，目录号：096610）

软件

斐济（https://imagej.net/Fiji）（Schindelin 等人。，20 12 ）
R（https://www.r-project.org）（R核心开发团队，2015 ）

程序

植物材料准备
在拟南芥幼苗中

苯胺蓝染色
这种方法可以使子叶和下胚轴上的PD染色，而根中的苯胺蓝染色则提供了分辨率和染色效率，我们发现很难与PD Index计算结合使用。

注意：对于根，我们建议用户使用单克隆抗体在整个根上进行免疫定位：澳大利亚生物材料公司（1-3）-β- 葡聚糖定向单克隆抗体，目录号400-2，以及Boutté 和Grebe中所述的方案， 2014。

在16/8小时的日/夜光周期条件下，在½MS 1％蔗糖琼脂平板上生长拟南芥幼苗4至6天（150 μ ë /米2 /秒，22 ℃）。
采取0.2毫升的苯胺蓝溶液以0.025的浓度毫克/毫升在水中与1ml注射器。
注意：可以测试非生物或生物应激条件以比较目标蛋白质的PD指数，在这种情况下，可以将苯胺蓝稀释在补充有不同分子（例如NaCl，甘露醇等）的水中，也可以在应用之前苯胺蓝染色（例如病毒感染，即在苯胺蓝渗透前几天被植物感染）。请注意，叶片或幼苗不能渗透两次。

从注射器中排出空气。
用镊子小心地取苗。
将幼苗轻轻推入注射器中，使幼苗的空中部分（即子叶和下胚轴）浸入溶液中（图1A-1D）。幼苗的根部应从注射器突出，以便能够在渗透后从注射器中拔出幼苗。
将手指放在注射器的末端，然后慢慢将活塞从注射器中拉出并达到0.21刻度，子叶表面会出现气泡（图1E-1H）。
数到5，然后非常缓慢地释放活塞（图1I）。
无德：我们推荐用户是在极其细腻与温柔两个步骤S（f和g），否则细胞就会发生爆炸的压力下，它会导致一般的模糊蓝色着色。

小心通过抓住袋鼠除去从注射器幼苗吨的它与镊子（图1J-1K）。
将幼苗放在一滴水滴的幻灯片上，然后轻轻地盖上盖玻片。
立即在共聚焦显微镜下进行采集。
注意：苯胺蓝快速漂白。应使用低功率的水银灯进行直接观察，以避免样品漂白。在共焦模式下，出于相同的原因，请使用尽可能低的405 nm激光功率。使用ZEISS 880共聚焦设备，激光功率通常设置为0.2％到5％，但是当然这可能会因所使用的显微镜而异。苯胺蓝染色可以立即显现，并且在10到15分钟内稳定。

图1。拟南芥幼苗浸润。使用1 ml注射器进行拟南芥幼苗浸润的不同步骤的图示。

使用PD蛋白作为PD标记
除苯胺蓝外，荧光标记的PD蛋白（如Plasmodesmata定位蛋白1（PDLP1）或Plasmodesmata ose 糖结合蛋白1（PDCB1））可用作PD指数的PD标记，可瞬时和稳定表达（Thomas 等。，2008 ；辛普森等，2009 ）。然而，我们强烈建议过路的Arabidosis 表达与可用感兴趣的蛋白线拟南芥系中表达荧光标记的PD标记蛋白。

笔记：

PD相关蛋白的过度表达可导致PD处的call质沉积。
可以使用拟南芥幼苗中荧光标记的PD蛋白标记的瞬时表达，但转化效率较低。我们不建议使用此方法。

在烟草本塞姆氏

苯胺蓝染色
三成像前几天，渗入烟草本塞姆氏叶只用农杆菌预先用感兴趣的蛋白质的有关二元质粒电穿孔（如在步骤中描述阿1 一个的在拟南芥幼苗）。
在1毫升注射器中以0.025毫克/毫升的浓度取少量约0.2 毫升的苯胺蓝。
轻轻地将叶子退回以显示其背面。
将注射器放在叶子上，然后将手指放在另一侧的同一位置，以阻塞注射器（图2A-2B）。
注意：避免在叶片的叶脉区域渗透，要渗透的区域应尽可能平坦。还应避免先前农杆菌浸润的穿刺部位。

用注射器在叶片上施加较小的压力，并缓慢推动活塞以使其渗入（图2C-2F）。
注意：当液体渗透并在叶片中迁移时，应该出现较暗的区域，并在注射器周围扩展。如果施加的压力正确，则渗透应该是平滑的，没有阻力，也不会损失液体，也不会伤及叶片表面。

不要渗入整片叶子，只要1 cm 2的小面积即可。
用锋利的剃刀刀片切开叶子的浸润区域。
将样品放在安装滑片上，叶片的背面朝上。
在样品上加一滴水。
用盖玻片盖上它。
立即在共聚焦显微镜下进行采集。

图2. 烟草本塞姆氏假浸润。的不同步骤说明（AF）的烟草本塞姆氏使用1ml注射器叶的渗透。

使用PD蛋白作为PD标记
生长的农杆菌事先在28°C和250 rpm的液体Luria和Bertani培养基中与合适的抗生素一起电穿孔了感兴趣的蛋白质和PD标记物的相关二元质粒（表1），持续1天。
对每种培养物进行1/10稀释，然后在28°C和250 rpm下再次生长，直到培养物的OD 600 达到约0.8
以3500 xg 离心培养物，小心丢弃上清液，重悬于水中，最终OD 600 为0.3。
将用目标蛋白和PD标记物转化的两种农杆菌培养物按1：1体积混合。
使用5到6片叶期植物，并在每片选定叶片的背面刺破一个很小的孔。避免叶脉。
在穿刺部位将1 ml装有农杆菌混合物的注射器用水冲在叶子上
将手指放在另一侧以阻塞注射器，并在叶子上施加较小压力的同时轻轻推动活塞，以使液体可以渗透。在此，有利的是渗透大部分的叶子。
再将植物放在适当的培养室中3天以表达蛋白质。
用剃须刀在叶子的浸润区域切一个大约1 c m 2 的正方形。
将样品放在安装滑片上，叶片的背面朝上。
在样品上加一滴水。
用盖玻片盖上它。
立即在共聚焦显微镜下进行采集。

共聚焦采集
建议使用63 x （NA≥1.4）的水浸物镜进行观察，以使浸入和安装之间的折射率相同。如果水浸泡的目的是不可用，在使用油浸物镜的仍然是可能的。
针孔值需要保持为通风1，以确保焦平面尽可能准确。
激发波长和光谱采集窗口应根据实验中选择的荧光蛋白进行调整（表1）。
应设置激光功率，光电倍增管（PMT）和光电倍增管偏移，以使采集的信号不饱和。在实验之间和同一实验中，可以修改PD标记的设置参数以获得尽可能好的信号而不会漂白。在同一实验中，比较不同的突变体或条件时，必须将荧光标记的目标通道标记的蛋白质保持相同。在实验之间，我们还建议对感兴趣的荧光标记蛋白质保持相同的设置。然而，PD指数是一个比例区之间的计算中在相同的画面（ROI）利息等荧光蛋白获取设定变更是可以接受的，如果确实需要。
线平均可以在图像采集期间应用，所有实验中都应保持相同的线平均。
在图像获取期间，与同时扫描相比，顺序扫描更为可取。重要的是要控制用于一种荧光蛋白的激发波长不会激发另一种荧光蛋白，即。e。确保PD标记物/苯胺蓝与目标蛋白的标记物之间没有串扰（表1）。
笔记：

苯胺蓝储备液在水中为1 mg / ml。苯胺蓝工作溶液为0.025 mg / ml。当目标蛋白被GFP标记时，请勿使用更高浓度的苯胺蓝，否则苯胺蓝信号将与GFP信号串扰。
为了避免通道之间的荧光串扰，有必要分别在单个荧光染料或荧光蛋白的激发和发射波长下进行独立和组合的激发和检测。应该准备仅用单个荧光蛋白/ PD标记物标记的对照样品，以验证用于激发一种荧光染料的激光激发波长不会激发另一种荧光染料。

表1.苯胺蓝和常用荧光蛋白的荧光激发和发射最大值（FP：荧光蛋白或染料； Ex：激发波长（nm）；Em ：发射波长（nm ））

FP或染料

前最大

Em最大

苯胺蓝

405

450

CFP

433

475

绿松石

433

475

微蓝藻

433

475

绿色荧光蛋白

488

507

眼动计划

514

527

金星

515

528

柠檬黄素

516

529

mRFP

584

607

mCherry

587

610

数据分析

使用斐济收集数据
使用斐济打开共聚焦图像。不要拆分通道。
打开ROI管理器（分析>工具> ROI管理器）。
使用主面板上的圆圈选择工具，并在PD标记通道上绘制一个稍小于PD标记信号大小的圆圈（图3A）。
注意：仅应选择尖锐的ose 信号作为PD ROI。当苯胺蓝色通道中的“斑点”模糊时，请勿为PD ROI和PM ROI选择ROI。

圆的位置和位置正确后，在ROI Manager上单击“添加”。新行应出现在ROI管理器中。
将圆（不对其进行修改）移动到另一个信号，然后再次单击“添加”。
重复步骤A4，直到有足够的ROI（ROI ；最好在5到10之间）。
将视图更改为另一个通道（感兴趣的蛋白质荧光通道）。
使用相同的圆圈从步骤A5 恢复并添加不与AB信号重叠但是在细胞外围的区域（图3B）。
通过转到分析>设置参数来验证测量参数。勾选“平均灰度值”框。
验证通道仍在目标蛋白上。然后，在ROI管理器上，单击“测量”。将出现一个包含值的新窗口。
选择并复制值。

图3.用于PD指数计算的ROI选择。A.在PD标记通道中选择PD ROI（白色箭头）。B.在感兴趣的蛋白质荧光通道（红色箭头）中选择PM ROI。验证在目标蛋白荧光通道中选择的ROI是否不对应于PD标记通道中的PD。

使用Excel计算PD指数
在Excel工作表上，粘贴从斐济（ImageJ）复制的值
计算“ PD处” ROI的平均值和“ PD处” ROI的平均值
通过执行“达到PD ROI平均值/ 外部PD ROI平均值”来计算PD指数。小于或等于1的PD指数值表示在PD处没有目标蛋白质的特异性富集或积累，而大于1的PD指数值对PD处的蛋白质富集意义重大。
注意：例如，PD驻留蛋白（如At-PDCB1）也位于质膜，当在本氏烟草中瞬时表达时，其PD指数为1.45 。QSK1和IMK2是两个与PM相关的LRR-RLK，它们有条件地重新定位于PD，在非生物胁迫下，PD指数从对照条件下的0.9升高到1到1.5升高到1.5 （Grison等，2019）。同样重要的是要注意，表达系统可能会严重影响PD指数值。说明这一点的是，At-MCTP4在本氏烟草中瞬时表达时显示出1.85 的PD指数，而在拟南芥中稳定表达时，PD指数上升到5 （Brault等人，2019）。

为了进行统计分析，建议使用R软件和Rcmdr 软件包。仅当n≥20且样本分布符合正常规律时才能使用参数测试。当n <20时，系统地使用非参数检验。

致谢

JDP由来自比利时的“地层点菜的博士奖学金资助RECHERCHE 丹斯欧莱雅工业等L'农业”（FRIA授予没有。1.E.096.18）。

这项工作是由美国国家研究机构（批准ANR-14-CE19-0006-01到EMB），“支持Osez L'interdisciplinarité ” OSEZ-2017-CNRS BBRIDGING程序，EMB，根据欧洲研究委员会（ERC）欧盟的Horizon 2020研究与创新计划（授予EMB的授权协议号772103-BRIDGING ）。

利益争夺

作者宣称没有任何竞争的经济利益。

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