材料和试剂

50毫升p 聚环氧Ç onical 吨ubes中（Falcon ，目录号：352098）
高g级微量离心管（Beckman Coulter，目录号：357448）
15米升50K MWCO离心过滤器（Millipore ，目录号：U ˚F C905024）
4 ml 50k MWCO离心过滤器（Millipore，目录号：UFC805024）
0.4 μ米挤出机滤器（Whatman，目录号：800282）
0.22 μ M混合床柱的纤维素酯膜（Millipore，目录号：GSTF02500）
7毫升玻璃闪烁瓶（Fisher Scientific，目录号：03-340-4A）
SEC色谱柱（GE生命科学Superdex 200增加10/30 GL;目录号：28-9909-44）
直径1厘米的玻璃柱（Kimble Flex-Column，货号：420401）
生物珠SM-2 一dsorbent 米EDIA（生物- Rad公司，目录号：152-8920）
Slc35a1 基因的cDNA ; 小鼠CMP-唾液酸转运蛋白; mCST（生物碱，Uniprot：Q61420）
EasySelect Pichia表达试剂盒（赛默飞世尔（Thermo Fisher），目录号：K174001）
巴斯德毕赤酵母菌株SMD1168H（Thermo Fisher，目录号：C18400）
分裂前蛋白酶
注：W é表达，这洁净自己，但它也可以购得，例如，通用电气医疗集团，目录号：27084301 。

胞苷5'-单磷酸-N-乙酰神经氨酸；CMP-唾液酸；CMP-Sia（Carbosynth，货号：MC04391）
[ 3 H] CMP唾液酸（美国放射性标记的化学品，目录号：ART 0147 -50μCi ）
4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙烷磺酸; HEPES（Fisher Scientific，目录号：BP310-1）
氯化钠; NaCl（Fisher Scientific，目录号：S 27 1 -3）
氯化钾; KCl（Fisher Scientific，目录号：P217-3）
氯化镁; MgCl 2 （Fisher Scientific，目录号：M33-500）
氯化锌 ZnCl 2 （Acros Organics，目录号：380130050）
盐酸苄am水合物（Acros Organics，目录号：105240250）
咪唑（Fisher Scientific，目录号：O3196-500）
脱氧核糖核酸酶I；DNase I II级，来自牛胰腺（Sigma-Aldrich，目录号：10104159001）
抑肽酶A（Fisher Scientific，目录号：BP2671-25）
亮丙肽半硫酸盐（Fisher Scientific，目录号：BP2662-100）
牛肺抑肽酶（Fisher Scientific，目录号BP2503-10）
苯甲磺酰氟（Acros Organics，目录号：215740010）
正十二烷基β -D-吡喃麦芽糖苷solgrade; DDM（Anatrace，目录号：D310S）
正十二烷基β -D-吡喃麦芽糖苷anagrade; DDM（Anatrace，目录号：D310）
用水制成的20 ％DDM（溶解）溶液；储存在-20°C
甲醇（Fisher Scientific，目录号：A452-SK4）
1,3-双[三（羟甲基）氨基]丙烷; Bis-tris-丙烷-HCl（Acros Organics，目录号：202640250）
氢氧化钠; NaOH（Fisher Scientific，目录号：S318-1）
TALON金属亲和树脂（宝酒，商品目录号：635504）
DL-1,4-二硫苏糖醇; DTT（Acros Organics，目录号：16568-0250）
乙二胺四乙酸二钠盐；EDTA（Fisher Scientific，目录号：S311-500）
酵母极性脂质提取物；YPL（Avanti，目录号：190001C）
戊烷（Fisher Scientific，目录号：P399-1）
南极磷酸酶（新英格兰生物实验室，目录号：M0289S）
Ultima Gold闪烁鸡尾酒（Perkin Elmer，目录号：6013329）
至少4.8级的氩气
超纯水
液氮
裂解缓冲液（请参见食谱）
缓冲区A（请参阅食谱）
缓冲区B（请参阅食谱）
缓冲区C（请参阅食谱）
AnP缓冲区（请参阅食谱）

设备

P ipettes
-80 °C冷冻室
米勒（Retsch ，型号：MM400）
离心机
50 m l 带有25 mm研磨球的研磨罐（Retsch ，目录号分别为01.462.0216和05.368.0105）
G lass Hamilton注射器（Hamilton ，目录号：81365）
12孔过滤器真空歧管（Millipore ，型号：1225，目录号：XX2702550）
超声仪（Avanti，型号：G112SP1T_B）
小型挤出机（Avanti，目录号：610000）
液体闪烁计数器，例如Beckman LS 6000IC

软件

棱镜6（GraphPad）
程序

CST蛋白表达和纯化
根据生产商的说明（EasySelect Pichia表达试剂盒，Thermo Fisher）生成表达CST的巴斯德毕赤酵母稳定细胞系。
注意小号：

简而言之，这需要先将CST cDNA亚克隆到pPICZ 载体中。将该载体线性化，然后通过电穿孔引入巴斯德毕赤酵母（SMD1168H菌株）细胞。在含zeocin的生长培养基上选择成功的转化体。
虽然我们对CST的大部分结构和生化特性都与小鼠蛋白有关，但我们已经观察到人蛋白具有几乎相同的特性。因此，此处描述的方法应适用于两种CST类型的研究。
根据制造商的说明在巴斯德毕赤酵母中表达CST 。我们通常在25到20-24小时内在含甲醇的培养基中诱导表达 ℃。我们通常生长6 x 1 L培养物，每升培养物产生约10 g细胞糊。
通过以4,000 xg离心15分钟收获细胞。丢弃上清液并用液氮冷冻细胞沉淀。
在搅拌机中裂解冷冻细胞。我们通常在25 Hz的频率下，每50 ml研磨室裂解10 g冷冻细胞糊，进行3分钟的5个循环。循环之间将室在液氮中冷却。
每克细胞在2.5 ml裂解缓冲液（配方1 ）中重悬研磨的细胞，并在4 °C 下孵育1.5 h 。
在4 °C下以35,000 xg 离心裂解液35分钟。
收集上清液，使用5 M NaOH将pH调节至7.2，然后将咪唑添加至5 mM。
在缓冲液A中平衡T ALON 树脂（配方2 ）。每克细胞使用0.175毫升填充树脂。
向T ALON 树脂中添加pH调节的上清液，并在4 °C 下温和旋转孵育2 h。
娲SH树脂分批用含5mM咪唑的缓冲液A的5个柱体积。以1,250 x g 的速度沉淀5 分钟，然后重悬于1 倍柱体积的缓冲液A中。
将树脂加载到直径为1 cm的玻璃柱上，并使用蠕动泵以大约1 ml / min的速度用5柱体积的含20 mM咪唑的缓冲液A洗涤，然后用2柱体积的含40 mM咪唑的缓冲液A 洗涤。
用至少5 倍柱体积的含有300 mM咪唑的缓冲液A 洗脱的蛋白质。
合并洗脱的蛋白质，并加入1 mM DTT和1 mM EDTA。
以1:20蛋白酶：总蛋白质的质量比添加PreScission蛋白酶，并在4 °C下对缓冲液A 透析过夜。对足够的体积进行透析，以使咪唑浓度降至5 mM或更低。例如，针对至少是样品体积60倍的体积进行透析。
将切割的蛋白质运行在在缓冲液A中平衡1 m L T ALON 柱。收集初始流通量。用一个色谱柱体积缓冲液A清洗色谱柱两次。合并流通液和洗涤液。
注意：此步骤对于去除在尺寸排阻色谱法（下一步）中未从CST中分离出的污染物是必要的。

浓缩合并样本到至少500 μ 升在50K MWCO集中器和在缓冲液B（平衡的10/300的Superdex 200增加凝胶过滤柱运行配方3 ）。
合并峰级分以结合到脂质体中。

蛋白脂质体重建
要将纯化的CST掺入脂质囊泡中，必须先将脂质转化为小单层囊泡（SUVs）。由于供应的脂质原料溶解在氯仿中，因此此过程的第一步涉及蒸发掉氯仿，然后将脂质重新悬浮在水性缓冲液中。
典型的复原使用40 mg 脂质（酵母极脂质提取物）。到等分该量，使用玻璃Hamilton注射器用Ť EFLON柱塞测量1.6毫升溶解在氯仿中的脂质的25毫克/毫升溶液。将脂溶液放入玻璃试管中，并用氩气缓慢吹扫氯仿。Ť 母鸡，再溶解干燥的脂质用约2ml 戊烷，然后蒸发戊烷使用的温和的流氩气。再次重复戊烷洗涤一次，然后将干燥的脂质放置在真空干燥器中过夜，以去除残留的溶剂。
重悬的干燥脂质小号在缓冲液C（配方4 在11.1）毫克/毫升并声处理2-3小时在槽式声波处理器。用环架和夹子将玻璃试管悬挂在浴中，使脂质悬浮液完全浸没。每隔5-10分钟运行一次超声仪，以防止过热（约40 °C以上）。在此期间，溶液应从不透明变为半透明，表明SUV 的形成。
使用20 ％的储备溶液将DDM加入至终浓度为5 mM ，以部分溶解SUV 。轻轻涡旋，然后在室温下孵育10-15分钟。
以5-10分钟的间隔再次超声处理长达1小时，直到溶液变为半透明。
加入200 μ 从上一节纯化CST的克。所述蛋白质应使用50K MWCO集中器，使得除了蛋白与脂质不稀释低于10的脂质被充分浓缩毫克/米升。对于无蛋白囊泡控制，替换为CST缓冲液B的等效体积对于具有基板（填充囊泡例如，300 μ 中号CMP），在该步骤中添加所希望的衬底。
注意：凭经验确定此蛋白质与脂质的质量比为1：200，以在我们的测定中提供最佳的信噪比。其他蛋白质或脂质组合物可能需要不同的蛋白质：脂质比率。

使最终脂质浓度到10毫克/米升稀释用缓冲液C，在4如果必要的话，然后孵育1个小时℃下。
要形成蛋白脂质体，可通过将Bio-Beads添加至100 mg / ml除去DDM。在4 °C 下轻轻旋转孵育2小时，然后短暂沉淀Bio-Beads，然后将上清液以100 mg / ml的浓度转移至新鲜的Bio-Beads。再次孵育在4 2小时℃的下轻轻旋转，然后在100毫克/米转让给第三新鲜批次生物珠的升。将其在4 °C 下缓慢旋转孵育过夜。孵育结束后，完成的蛋白脂质体应明显不透明。
笔记：

通过在50 ml Falcon管中的约2 g Bio-Beads中添加30 ml甲醇来制备Bio-Beads。旋转珠子15分钟，然后使用针对在Falcon管底部形成的小孔施加真空，以除去甲醇。在50毫升水中洗涤小珠四次，然后抽真空除去水。在10 ml 的缓冲液C中洗一次磁珠，然后在缓冲液C下保存直至需要。
为了获得所需量的珠子，请在真空中短暂沥干清洗后的珠子，然后用天平称出所需量。
分装脂质体并在液氮中快速冷冻。储存在-80 °C 。
笔记：

脂质体可以在-80 °C下保存至少几个月。
我们通常可以将蛋白质起始量的约60％掺入囊泡中。
为了确定蛋白质掺入的效率，请使用DDM溶解少量的囊泡，然后在凝胶过滤柱上运行。然后将峰高与未掺入囊泡的等效蛋白质样品进行比较。

CMP-Sia配体纯化
笔记：

CMP-Sia的商业库存包含约10％的CMP，随着时间的流逝，它们将进一步水解形成游离的CMP和Sia。对于转运测定，必须首先将所有游离CMP转化为胞苷- 对CST的亲和力很低–使用南极磷酸酶（AnP）。
我们筛选了许多商业上可获得的磷酸酶。大多数能够有效地将CMP转化为胞苷，但我们最终选择了AnP，因为它在酸性pH（这是我们获得大多数结晶产物的pH范围）内保留了高酶促活性。
CMP-Sia的水解取决于温度和pH值（在较高的温度和/或较低的pH值下更快），因此在使用过程中，将AnP处理的CMP-Sia溶液保持在中性pH缓冲液和冰中，并在-80 °C下储存。
我们确定，在室温下，在运输测定缓冲液（缓冲液C）中CMP-Sia的水解速率为0.005 ％/ min。这是设计和解释转运分析实验数据时要考虑的因素。但是，考虑到我们的大多数运输实验都使用了相对较低的CMP-Sia浓度和较短的孵育时间，因此我们认为少量的CMP并不是很重要。
NEB 的南极磷酸酶（AnP ）库存为5,000 U / ml。浓缩程度不足以充分处理CMP-Sia的浓缩（100 mM）储备液；因此，必须集中精力。要做到这一点，首先dilut Ë 的ANP 到100U / ml，在ANP缓冲液（配方5 ）（以减少甘油浓度），然后浓缩至10,000 U / ml时，用10K MWCO集中器。
将CMP-Sia粉溶解到10,000 U / ml AnP溶液中至终浓度为100 mM。添加ZnCl 2 至终浓度为0.2 mM，添加MgCl 2 至终浓度为2 mM。
将该混合物在室温下孵育8小时。
通过3k MWCO浓缩器过滤混合物以除去AnP，该浓缩器保留70 kDa AnP。
注意：我们确认此步骤后我们没有观察到任何AnP活性。

如果需要，请通过HPLC分析确认从CMP-Sia库存中消除了CMP。
分装并在-80 °C 冷冻。等分试样可以存储至少几个月。

运输分析
解冻从部分B的脂质囊泡和拉伸10次通过0.4 μ 使用阿凡提微型挤出机米的Whatman的Nuclepore滤波器。
通过使用高g等级的1.5 ml Beckman管在194,800 xg 在4°C下进行60分钟的超速离心来沉淀囊泡，以去除外部CMP 。45个μ 每次测定点需要升囊泡。
弃上清，沉淀冲洗两次，用500 μ 缓冲液C的升。然后重悬在沉淀缓冲液C的最终体积应为起始体积0.444倍; 但是，它是有帮助的最初仅加入小体积（〜50 μ 升缓冲液C），以使其更易于完全使所述样品达到最终体积之前均质化囊泡。存放在冰上，直到需要为止。
对于每个测定点，通过取20发起传输μ 升再悬浮的囊泡中，加入30 μ 升缓冲液C的与ANP处理CMP-Sia的含有30-50纳米[所需浓度3 H] CMP-Sia的（20℃ 我/毫摩尔）。
注意：我们尚未评估用于转运分析的[ 3 H] CMP-Sia 的纯度，但由于以下原因，我们预计任何CMP杂质的存在都不是一个重大问题：1）is是在Sia部分上，因此我们不必担心检测[ 3 H] CMP转运，并且游离Sia对CST具有不可检测的亲和力，很可能不会转运。2）[ 3 H] CMP-Sia仅作为示踪剂使用，通常用冷CMP-Sia稀释至少100倍进行分析；因此，任何CMP的相对浓度都非常低。

根据实验将混合物孵育所需的时间和温度。W¯¯ Ë通常孵育在23 ℃下为方便起见，并尽量减少CMP-Sia的水解。在此温度下，囊泡似乎在10分钟之前达到平衡，直至30 s的摄取速率都是线性的。
停止输送通过添加0.6米升冰上冰冷缓冲液C的和存储。
从外部溶液中分离的囊泡中，f 通过0.22 ILTER混合物μ M混合床柱纤维素酯膜。为减少背景计数（[ 3 H] CMP-Sia对过滤器的非特异性粘附），在使用囊泡之前，先用2 ml 冰冷的缓冲液C 预清洗过滤器是有帮助的。囊泡过滤后，用2 ml 冰冷的缓冲液C 清洗过滤器3次。我们通常使用容纳25毫米直径过滤器的12孔过滤器真空歧管（MilliporeSigma）。
将过滤器放入7 ml的闪烁小瓶中，加入5 ml的闪烁鸡尾酒，并在液体闪烁计数器中计数。

数据分析

要确定背景计数，请使用含蛋白的囊泡与热底物混合后的值，然后立即添加0.6 ml 冰冷的缓冲液C 淬灭。或者，可以使用与含蛋白的囊泡相同的实验条件的无蛋白的囊泡使用。我们发现这些方法产生相似的结果。
从每个样品的总计数中减去背景计数，以确定特定计数，并转换为mol / min用于底物运输。
将数据拟合为一个米氏模型来确定ķ 米和V 最大（小号EE例如图1的数据）。

D：\ Reformatting \ 2020-1-6 \ 1902713--1301 Matthew Whorton 784665 \ Figs jpg \图1.jpg

图1 。鼠标CST的功能特性。一。30时间过程μ 中号CMP-Sia的摄取对于纯化小鼠CST（MCST）重构为脂质囊泡与（黑色）或无（红色）300 μ 中号CMP囊泡内。（插图），Ť 他CMP-Sia的摄取为MCST的第一分钟重构为CMP填充的囊泡被示出以说明摄取和时间最长为30秒，这是我们用于确定传输的用于初始速度之间的线性关系给定浓度的CMP-Sia。乙。将重构为CMP的囊泡中的mCST的CMP-Sia吸收初始速度绘制为底物浓度的函数，以确定转运的K m 和V max 。在所有面板中，符号均表示n = 2（A ）或n = 4（B ）的平均值±平均值的标准误差（SEM ）。改编自Ahuja和Whorton，2019。

菜谱

裂解缓冲液
50 mM HEPES，pH 7.5

150毫米氯化钠

0.01 mg / ml脱氧核糖核酸酶I

胃抑素0.7μg/ ml

1μg/ ml亮肽素

1μg/ ml抑肽酶

1 mM联am

0.5 mM苯基甲基磺酰氟

2％（w / v）DDM（溶剂化）

缓冲液A
50 mM HEPES ，pH 7.5

150毫米氯化钠

0.1％（w / v）DDM（溶剂化）

缓冲液B（凝胶过滤缓冲液）
25 mM HEPES ，pH 7.5

150毫米氯化钠

0.1％（w / v）DDM（降级）

5毫米DTT

1 毫米EDTA

缓冲区C（复原缓冲区）
20 mM HEPES，pH 7.5

0.1 M氯化钾

AnP缓冲液
50 mM Bis-Tris-丙烷-HCl，pH 6.0

0.1 mM氯化锌2

1毫米氯化镁2

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）资助R01GM130909和俄勒冈州健康与科学大学的支持。该协议已从以前的工作中扩展（Ahuja和Whorton，2019）。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

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