材料和试剂

1。手套

2. Labcoat

3. 发网

4. 口罩

5. 大鼠

6. α 松油烯（Millipore公司西格玛，Sigma-Aldrich公司，目录号：86473），小号在易燃柜撕

7. 辛醇（Millipore公司西格玛，Sigma-Aldrich公司，目录号：297887），小号在易燃柜撕

8. 矿物油器（Millipore西格玛，Sigma-Aldrich公司，目录号：330760），小号在易燃柜撕

9. 4-甲基戊醛（Santa Cruz Biotechnology公司，目录号：SC-483809），小号在易燃柜撕

10. 己醛（Santa Cruz Biotechnology公司，目录号：SC-252885），小号在易燃柜撕

11. 100％乙醇（商业醇，目录号：P016EAAN），小号在易燃柜撕

12. 纯净水

13. 萜品烯（6.63％）（请参阅食谱）

14. 辛醇（2.67％）（请参阅食谱）

15. 4-甲基戊醛（1.6 x 10 -6 M）和己醛（8.7 x 10 -6 M）二元混合物（请参见食谱）

16. 乙醇（70％）（请参阅食谱）

设备

1. 冲击发生器与网格和可移除的有机玻璃盘（室町，机械兴业，米Odel等：SGS-003DX ）

2. 有机玻璃无底盒（定制）

3. 透明有机玻璃盒盖（定制）

4. 范- 附盖为有机玻璃盒（自定义制造）

注：牛逼他风扇通过连接到通风系统天花板疏散管吹出异味箱子外面。这样可以使气味最小地渗透到房间中。

5. 疏散管

6. 气味传送系统（定制）

7. 气味输送瓶（碳酸钙瓶，盖子上有2个孔，用于c-flex管）

8. 异味输送c-flex管

9. 医用储气罐（95％O 2 5％CO 2 ）

参见图1为一个拉贝导致的实验装置的图像。

10. 空气交换器

11. 计时器

12. 秒表

13. 网络摄像头和三脚架

14. 手提电脑

15. 家用笼子

D：\ Reformatting \ 2020-2-7 \ 1902495--1324 Samantha Carew 725716 \ Figs jpg \图1.jpg

图1 。标签编定做的实验装置的照片。一。气味传送系统；乙。疏散油管；Ç 。风扇- 附盖; d 。有机玻璃盒无底；Ë 。防震网；˚F 。可移动有机玻璃托盘；摹。冲击发生器 ^ h 。气味传送瓶；我。气味输送管（白色）；Ĵ 。医用气罐。

程序

习性
1. 在轻循环中完成。

2. 将大鼠放在家笼中训练室外面的推车上，并在任何行为程序之前将其从动物保育室运离后保持20分钟不受干扰。

3. 打开空气交换器。

4. 打开医用储气罐，使空气自由流过避震箱。

5. 戴手套，labcoat ，发网和口罩，只需要一次一个从家里笼，纳入培训室，发生在箱体震荡（网格关闭）与风扇- 附着在上面，打开盖子。

将成对有气味+休克（O + / S + ）和仅具有气味的同伴（O + / Comp）的大鼠在适应前一周开始配对饲养。
大鼠气味只（O + / S - ），仅休克（O - / S + ），和弄脏被褥（O + / SB）的条件下，和O + / S + 弄脏被褥供体大鼠单独饲养。
6. 让动物探索环境30分钟。

7.将动物放回笼子里。

8. 清除电击箱。

用70％的乙醇喷洒所有内表面（配方4）。
用纸巾擦拭。
将盖子与风扇和排气管连接，然后打开以消除异味。
等待至少10分钟，然后再移至下一只动物，以确保房间内没有残留的气味。
9. 在气味加电击之前的2天内，将每只动物每天置于电击箱中2天，每天30分钟。

这可以防止动物将休克与周围环境相关联，并促进针对所呈现气味的特定恐惧条件。

训练
1. 在照明周期内完成。

2. 将大鼠放在家笼中训练室外面的推车上，并在任何行为程序之前将其从动物保育室运离后保持20分钟不受干扰。

3. 打开空气交换器。

4. 打开医疗气流。

5. 根据动物状况训练动物1天，详情如下。

注意：在条件c下对大鼠的训练必须始终以笼状/成对方式在条件d和e之前，但是其他组的训练顺序并不重要。

Ø + / S - 条件
使每个大鼠调理室，并装在箱体震荡（网格接通）和盖用风扇- 附盖打开。
启动计时器。
4分钟后，松开c-flex管，使松油烯异味进入电击腔。
让松油烯（配方1）流经管路1分钟，然后关闭c-flex管路以停止松油烯流动。
在14、19和29分钟，按照步骤B5aiii和B5aiv中所述重复气味的释放。
从电击腔中取出老鼠，立即返回家笼。
清洁冲击腔。
1）用70％乙醇喷洒所有内表面。

2）将附有风扇的盖子放在减震室上，然后打开以清除所有残留的气味。

3）等待至少10分钟以引入下一只老鼠。

Ø - / S + 条件
带来每只大鼠给空调室，并装在箱体震荡（网格接通）和盖用风扇- 附盖开启。
启动计时器。
在5、15、20和30分钟时，按下手动电击按钮以发出1 s 0.5 mA电击。
从电击腔中取出老鼠，立即返回家笼。
清洁冲击腔。
1）用70％乙醇喷洒所有内表面。

2）将附有风扇的盖子放在减震室上，然后打开以清除所有残留的气味。

3）等待至少10分钟以引入下一只老鼠。

O + / S + 条件
带来大鼠调理室，并装在箱体震荡（网格接通）和盖用风扇- 附盖开启。
注意：在进行O + / S + 训练时，将O + / Comp陪伴鼠留在远离训练室的家笼中很重要。

启动计时器。
4分钟后，松开c-flex管，使松油烯异味进入电击腔。
使松油烯流过管道1分钟。
在4:59（在发出气味的最后一秒钟期间），按手动电击按钮以发出1 s 0.5 mA电击。
关闭c-flex管，以阻止松油烯流出。
按照步骤B5ciii-B5cvi中第14、19和29分钟的说明重复气味传递。
从电击腔中取出老鼠，并立即与同伴老鼠一起返回家笼。
清洁冲击腔。
1）用70％乙醇喷洒所有内表面。

2）将附有风扇的盖子放在减震室上，然后打开以清除所有残留的气味。

3）等待10分钟以介绍下一只老鼠。

注：牛逼他必须是相应的配套大鼠（O + / COMP）。

O + /比较条件
以下用新鲜训练ö相互作用的10分钟+ / S + 伴侣大鼠，带来每只大鼠给空调室，并装在箱体震荡（网格接通）和盖用风扇- 附盖开启。
注意：在进行O + / Comp训练时，O + / S + 陪伴鼠必须远离训练室，呆在笼子里，这一点很重要。

启动计时器。
4分钟后，松开c-flex管，使松油烯异味进入电击腔。
让松油烯流经管路1分钟，然后关闭c-flex管路以停止松油烯流动。
按照步骤B5diii和B5div中第14、19和29分钟的说明重复气味传递。
从电击室中取出老鼠，并立即用O + / S + 陪伴老鼠返回家笼。
清洁冲击腔。
1）用70％乙醇喷洒所有内表面。

2）将附有风扇的盖子放在减震室上，然后打开以清除所有残留的气味。

3）等待至少10分钟以引入下一只老鼠。

O + / SB条件
注意：训练单独分开安置的O + / S + 脏床上用品供体大鼠后立即训练O + / SB大鼠，在O + / S + 脏床上用品供体大鼠训练期间将床上用品放在避震格下面的托盘中，并且不要清洗避震箱在动物之间，使O + / SB暴露于O + / S + 供体大鼠的被褥中。

乙环每只大鼠给空调室，并装在箱体震荡（网格接通）和盖用风扇- 附盖开启。
启动计时器。
4分钟后，松开c-flex管，使松油烯异味进入电击腔。
让松油烯流经管路1分钟，然后关闭c-flex管路以停止松油烯流动。
如第14、19和29分钟的步骤B5eiii和B5eiv所述重复气味的释放。
从电击腔中取出老鼠，立即返回家笼。
清洁冲击腔。
1）用70％乙醇喷洒所有内表面。

2）将附有风扇的盖子放在减震室上，然后打开以清除所有残留的气味。

3）等待至少10分钟以引入下一只老鼠。

O + / Ph条件
在防震栅下方的托盘中，放置干净的铺垫材料和一块浸有0.75 ml 4-甲基戊醛和己醛二元混合物的滤纸（配方3）。
BRI 纳克每只大鼠给空调室，并装在箱体震荡（网格接通）和盖用风扇- 附接通盖。
启动计时器。
4分钟后，松开c-flex管，使松油烯异味进入电击腔。
让松油烯流经管路1分钟，然后关闭c-flex管路以停止松油烯流动。
在14、19和29分钟，按照步骤B5fiii和B5fiv所述重复气味的释放。
从电击腔中取出老鼠，立即返回家笼。
清洁冲击腔。
1）用70％乙醇喷洒所有内表面。

2）将附有风扇的盖子放在减震室上，然后打开以清除所有残留的气味。

3）等待至少10分钟以引入下一只老鼠。

4）更换被0.75 ml 4-甲基戊醛和己醛二元混合物浸透的被褥和滤纸。

测试中
1. 在轻循环中完成。

2. 将大鼠放在家笼中训练室外面的推车上，并在任何行为程序之前将其从动物保育室运离后保持20分钟不受干扰。

3. 打开空气交换器。

4. 设置笔记本电脑和网络摄像头，以便可以看到大鼠并记录测试会话。

5. 打开医疗气流。

6. 戴上手套，白大褂，发网和面罩，从笼子中一次取一只老鼠，带入训练室，放在电击室中（格栅关闭），并盖上透明的盖子。

7. 启动计时器。

8. 开始录制视频。

9. 保持医用空气流通15分钟，以观察基线行为。

10. 在15分钟时，松开c-flex管，以便松油烯可以流过电击腔。

11. 在接触异味期间，观察冷冻行为15分钟。

使用秒表记录冻结时间总量。

注意：这可以减少到5分钟的医疗空气和5分钟的异味暴露。

12. 从冲击腔中取出鼠笼，然后返回家笼。

13. 清洁冲击腔。

用70％乙醇喷洒所有内表面。
将附有风扇的盖子放在减震室上，然后打开以清除所有残留的气味。
等待至少10分钟以引入下一只老鼠。
14. 在一天的不同部分，在单独的测试阶段中，在步骤C10中使用辛醇（配方2）（控制气味）（而不是萜品烯）重复整个测试过程（例如，如果早晨使用松油烯进行了测试，请在这个下午）。

数据分析

除呼吸所需的运动外，“自由结冰” 行为被视为没有其他运动。要将时间计为阳性冻结，除了呼吸外，大鼠必须完全固定。鸟瞰图（放置相机的位置）将显示大鼠的头低至地面，但未塞入人体，并且其耳朵将向后拉并平放在头骨上。秒表用于记录静止所花费的总时间，并在观察到冰冻行为时立即启动，并在检测到大鼠运动时立即停止。

使用Bonferonni 事后检验，使用单向方差分析（ANOVA），比较条件之间每单位时间的冻结时间百分比。理想情况下，至少要包含n = 6才能进行数据分析。

在医疗空气和辛醇暴露期间运动非常有限的情况将被视为数据排除的标准，并且任何落在高于或低于组平均值的两个标准偏差范围之外的冻结分数％也将被视为排除标准。

D：\ Reformatting \ 2020-2-7 \ 1902495--1324 Samantha Carew 725716 \ Figs jpg \图2.jpg

图2. 冷冻时间占经过五分钟测试暴露于经过训练的气味后的总时间的百分比。一。配对房屋实验。ø - / S + ，休克只大鼠; Ø + / S - ，气味只有那些单独笼中鼠; O + / S + ，有气味/休克的大鼠；O + / Comp，仅将气味笼罩在有气味/休克的大鼠中。乙。单房实验。Ò + / S - ，气味只大鼠; O + / Ph，暴露有气味的大鼠用先前确定的警报信息素分子处理过；O + / SB，暴露有气味的大鼠用脏的被褥处理。该图改编自Carew 等人。，2018。

笔记

1. 确保其他老鼠离当前正在训练的老鼠较远，以排除通过超声波发声进行交流的可能性，这种冲击可能在电击调理过程中发生，也可能不会发生。

2. 确保从大鼠之间的训练室中可靠地清除所有气味。

3. 可以使用其他气味，但是初步测试必须确保在训练之前这些气味不是天生的厌恶或刺激性。这种测试的一个例子是Y型迷宫，其中一只手臂使用一种有异味的气味，另一只手臂使用其媒介物（矿物油），并记录每只手臂所花费的时间。如果气味固有地具有刺激性，则相对于矿物油，大鼠将在大于50％的时间内接近该气味，如果气味固有地具有厌恶性，则该大鼠将在50％以上的时间内避免该气味。我们根据之前确定的中性选择了松油烯和辛醇气味（Lee 等人，2013）。

菜谱

注意：选择松油烯和辛醇的浓度应使气味散发出1 Pascal的气相分压（Lee等，2013）。

1. 松油烯（6.63％）

将1.326毫升α-萜品烯添加到聚碳酸乙烯酯瓶中的18.67毫升矿物油中
最终体积20毫升
充分混合涡流
2. 辛醇（2.67％）

添加534 μ升1-辛醇以19.47毫升矿物油的在聚乙烯碳酸盐瓶
最终体积20毫升
充分混合涡流
3. 4-甲基戊醛（1.6 x 10 -6 M）和己二醛（8.7 x 10 -6 M）二元混合物（Inagaki et al。，2014）

添加16 微升4-甲基戊醛和87 微升的己醛99.9毫升纯净水
最终体积100毫升
充分混合涡流
4. 乙醇（70％）

将350 ml的100％乙醇添加到150 ml喷雾瓶中的去离子水中
最终体积500毫升

致谢

该协议源自以下研究论文：Carew 等。（2018）。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

伦理

所有程序均由纪念大学机构动物护理委员会批准，并遵循加拿大动物护理委员会的指南进行。批准ID：15-04-QY；有效期：2月201 日6- 2019 年2月。

参考文献

1. Bind，RH，Minney ，SM，Rosenfeld，S.和Hallock，RM（2013）。信息素反应在啮齿动物行为中的作用：实验室规程发展的未来方向。Ĵ上午副教授实验室动画科学52（2）：124-129。

2. Brain，PF，Homady ，MH，Castano，D.和Parmigiani ，S.（2009）。啮齿动物和灵长类动物的信息素和行为。Bollettino 二Zoologia 54（4）：279-288。

3. 布鲁斯，HM（1959）。小鼠的妊娠外阻滞。自然184：105。

4. Bruchey ，AK，Jones，CE和Monfils，MH（2010年）。恐惧调理：在记忆检索过程中恐惧的社交传播。行为大脑研究214（1）：80-84。

5. Carew，SJ，Mukherjee，B.，MacIntyre ，ITK，Ghosh，A.，Li，S.，Kirouac ，GJ，Harley，CW和Yuan，Q.（2018）。信息素诱导的大鼠气味关联恐惧学习。科学报告8（1）：17701。

6. Debiec ，J.和Sullivan，RM（2014）。情感创伤的代际传递是通过杏仁核依赖性母婴向特定恐惧的转移。PROC国家科科学院科学USA 111（33）：12222-12227。

7. Gawienowski ，AM，Orsulak ，PJ，Stacewicz-Sapuntzakis ，M。和Joseph，BM（1975）。雄性大鼠前腺中性信息素的存在。内分泌醇67（2）：283-288。

8. Hayashi，S.和Kimura，T.（1974）。雌性小鼠发出的性吸引剂。生理学Behav 13（4）：563-567。

9. Hoover，JE和Drickamer ，LC（1979）。怀孕和哺乳期雌性家鼠的尿液对成年雌性雌性周期的影响。Ĵ 生殖体外受精55（2）：297-301。

10. H. Inagaki，Y。Kiyokawa ，S。Tamogami ，H。Watanabe ，Y。Takeuchi 和Y. Mori（2014）。鉴定增加大鼠焦虑症的信息素。PROC国家科科学院科学USA 111（52）：18751-18756。

11. 菊水，T.，Takigami ，S.，竹内，Y。和森，Y。（2001）。警报信息素增强大鼠应激诱导的体温过高。生理学Behav 72（1-2）：45-50。

12. Kiyokawa，Y.（2017年）。社交气味：信息素警报和社交缓冲。CURR 前Behav 神经科学30：47-65。

13. Y. Kiyokawa，Y。Kodama，T。Kubota，Y。Takeuchi和Y. Mori（2013）。雄性大鼠的犁鼻器官检测到了信息素警报。Chem Senses 38（8）：661-668。

14. Y. Kiyokawa，Y。Shimozuru ，T。Kikusui ，Y。Takeuchi 和Y. Mori（2006）。警报信息素会增加雄性大鼠的防御和风险评估行为。生理学Behav 87（2）：383-387。

15. Knapska ，E.，尼古拉耶夫，E.，Boguszewski ，P.，Walasek ，G.，布拉什奇克，J.，卡兹玛瑞克，L。和Werka ，T。（2006）。主体之间的情感信息传递唤起了杏仁核激活的特定模式。PROC国家科科学院科学USA 103（10）：3858-3862。

16. Krames ，L.，Carr ，WJ和Bergman，B。（1969）。与雄性鼠中的社交优势相关的信息素。Psychon 科学16（1）：11-12。

17. Kumar，V.，Vasudevan，A.，Soh，LJ，Le Min，C.，Vyas，A.，Zewail-Foote，M.和Guarraci ，FA（2014）。雄性大鼠的性吸引力与主要尿蛋白的浓度更高有关。Biol Reprod 91（6）：150 。

18. Lee，J.，Linster ，C.，Devore，S。，（2013）。气味偏好影响大鼠的歧视学习。Behav Neurosci 127（4）：498-504。

19. Posadas-Andrews，A.和Roper，TJ（1983）。饮食偏好在成年大鼠中的社会传播。动物行为31（1）：265-271。

20. 范登伯格，JG，惠特塞特，JM和伦巴第，JR（1975）。雌性小鼠中信息素加速青春期的部分隔离。Ĵ 生殖体外受精43（3）：515-523。