材料和试剂

纸巾
定制的竞技场，由层压木圆地板（直径40厘米）和金属漆墙（25厘米）建造
个人防护设备（例如克，手套，面罩，防护服装）
线栅
笔和日志
实验室繁殖的小鼠
从巴西圣保罗大学生物医学科学研究所免疫学系的动物设施获得了无特定病原体（SPF）的小鼠。在受控的室温（22±5）°C和湿度范围为45％至65％的条件下，将这些动物圈养在单独通风的笼子（巴西蒙特莫尔的Alesco工业和商业公司）中作为垫料。用人造光将房间保持在12/12小时的光照/黑暗周期（在07:00 AM点亮）。动物可以不受限制地使用经过过滤和高压灭菌的水以及根据AIN93M啮齿动物饮食（Nuvilab，Quimtia，巴拉那州，巴西）配制的高压灭菌的商业颗粒。总共使用了26只12周龄的BALB / cJ突变克鲁萨自然（“腿交叉”；缩写crup ）（n = 13）和BALB / cJ（n = 13）雄性小鼠。所述crup 突变菌株从出现的ENU（N-乙基-N-亚硝基脲）诱变在通过Massironi（2006）中描述的BALB / cJ的遗传背景屏幕。

5％乙醇

设备

解剖钳
录影机
固定铁杆，用于将摄像机放置在竞技场中心上方
连接到个人计算机的视频跟踪系统（Noldus信息技术，型号：Ethovision XT软件）（可选）

软件

Ethovision XT（Noldus，http：//www.noldus.com/animal-behavior-research/products/ethovision-xt ）
计算机软件进行自动跟踪ANA 裂解，或任何其他软件的行为肛门YSI 小号。

Prism 8（GraphPad软件，http：//www.graphpad.com）。计算机软件进行统计分析，或其他任何SOF 进行统计分析tware

程序

通用规则
竞技场必须放置在间接光线下，避免黑暗区域或阴影区域。摄像机必须放置在舞台上方并与舞台中心对齐，以在记录框架内提供整个覆盖范围。
测试必须在隔离的房间中进行，且无大声噪音，以免在操作过程中干扰动物。如果无法在安静的地方使用白噪声，则有助于最大程度地减少其他噪声的干扰。
动物识别码可以写在纸上并放在地板上，因此在整个过程中由摄像机记录下来。
将小鼠放在测试室的家笼中30分钟以适应环境。
在每次训练之前，必须使用5％的乙醇溶液清洁竞技场，以防止前一只鼠标留下的气味提示引起的偏差。
为了避免数据丢失，在将动物放置到竞技场中心之前，相机必须开始记录。
为了顺应不断增加的应力水平，应该按顺序测试参数，以便第一个响应不会干扰下一个响应。
所有参数都必须在不熟悉动物的同一区域进行评估，以最大程度地减少动物的压力情况。确保记下每个评估的参数。稍后可以在视频上分析观测参数。

测试程序/数据收集
适应时间过后，打开相机，从笼子中轻轻取出鼠标，然后立即将其- 每次将鼠标每次放置在相同位置- 放置在舞台中央的测试室中。
一旦动物进入竞技场，离开房间并记录动物活动5分钟。
在记录了活动之后，返回到试验箱以开始测试后续参数。记录该过程的以下部分不是强制性的。
分数在表1中描述。

表1.与一般活动，感觉神经系统，感觉运动系统，中枢神经系统（CNS）和自主神经系统（ANS）相关的参数

参数

如何测量

一般活动

饲养

量化事件（例如频率）

修饰

量化事件（例如，频率，时间）

运动

量化事件（例如，距离，速度，时间）

得分

感觉神经系统

触觉回应

1个不动（不存在）

2 步困难

3 慢慢走

4 次敏捷步行或跑步（基线）

耳反射

1个垂直于头部并指向前方的耳朵（不存在）

2个耳朵向外和/或向后旋转（基线）

3 鼠标将耳朵向后拉

4根耳朵平放在头上

角膜反射

1 只眼睛保持睁开（不存在）

2 只眼睛半睁

3 眼完全闭合（基线）

甩尾

1 无反应（不存在）

2 移动缓慢

3 步快

4 奔跑和跳跃（基线）

感觉运动系统

肌张力

1 缺席

2个礼物（基准）

后肢成角度

1个正常的后肢和抬高的尾巴位置（基线）

2 胸背和臀部之间的夹角增加

胸背与臀部之间的最大夹角为3 ，尾巴降低

表面扶正反射

1 不返回俯卧姿势（不存在）

2 难以回到俯卧位

3 慢慢回到俯卧位

4 快速返回俯卧姿势（基线）

掌握力量

1个不保持网格（不存在）

2 握住栅格，但迅速将其释放（2-9 s）

3 保持电网但释放它（10 - 20秒）

4 握住网格，然后释放它（20-29 s）

5 不释放网格（超过30秒）

中枢神经系统

Straub尾巴

1 缺席（基准）

2 礼物

共济失调

1 缺席（基准）

2 礼物

震颤

1 缺席（基准）

2 礼物

镇静剂

1 缺席（基准）

2 礼物

发作

1 缺席（基准）

2 礼物

ANS

排尿

量化事件（例如计数尿斑）

排便

量化事件（如计数粪便勃利）

参数分类从SHIRPA程序适于（罗杰斯等人，1997）。

观测参数（表1）
一般活动（视频1）

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视频1. 观察参数– 常规活动。视频演示了一般活动参数：饲养，修饰和运动。

一般活动参数应该被量化。运动可以通过软件（空白区域）进行分析，也可以通过直接计算具有网格地板的区域中动物所覆盖的区域来进行分析。

一个。饲养。站立活动的频率。动物站立或不站立的爪子都放在竞技场墙上。

b。修饰。自我修饰活动的频率和周期。动物清洁脸部和/或身体。

C。运动：在舞台上的动物步行活动。

感觉运动系统
肌张力。动物表现出连续和被动的局部肌肉收缩，以维持其身体姿势（视频2）。

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视频2. 观测参数s –感觉运动系统。视频显示了后肢成角度，这是与感觉运动系统有关的观察参数。

后肢成角度。动物的后肢成角度增加，可能导致行走困难。
中枢神经系统（视频3）

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视频3. 观察参数– 中枢神经系统。视频演示了与中枢神经系统有关的观察参数：尾，共济失调和震颤。

Straub尾巴。动物行走和/或休息时，尾巴会变得僵硬和直立
共济失调。缺乏自愿协调的肌肉运动，步态异常。
震颤动物在走路和/或休息时会出现震颤。

自主神经系统
一个。排尿。尿斑数量。

b。大便。大便次数薄利。

介入参数
感觉神经系统（视频4）
响应触摸。轻轻将镊子靠近动物体，并通过横向位置使其接触15 s以上。观察鼠标反应。

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视频4.干预参数（需要刺激[Skinner，1950]）参数- 感觉神经系统。视频演示了与感觉神经系统相关的干预参数：对触摸的反应[得分2 – 缓慢行走，得分4 – 敏捷或跑步行走（基线）]；耳反射[得分1（无）和得分4 –耳朵向外和/或向后旋转（基线）]；角膜反射[得分3 –完全闭眼（基线）]和甩尾[得分4 –跳广告（基线）。

耳反射。从侧面靠近，将手指靠近动物的耳朵并评估耳朵的姿势。
角膜反射。轻轻地将镊子靠近动物的眼睛，但不要触摸它。请小心避免碰到晶须，并注意观察鼠标的反应。
尾巴轻弹。用镊子紧紧按下尾尖，观察小鼠的反应。
感觉运动系统（视频5）

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视频5.介入参数-感觉运动系统。视频演示了与感觉运动系统有关的介入参数：表面矫正反射[得分4 –快速回到俯卧位（基线）]和抓握力[得分1 – 不适应网格（无），得分2 – 保持网格，但很快将其释放（2-9 s）]。

表面扶正反射。轻轻将动物转回其背部，并将其置于仰卧位置。保持5秒钟，然后分析松弛度以回到俯卧位。
掌握力量。将动物放在线栅上。给动物5秒钟以适应情况，然后慢慢转动网格。观察动物的反应。
中枢神经系统
镇静剂。（如果动物正在休息，则闭上眼睛）用镊子轻轻触摸动物的躯干，观察其是否移动或睁开眼睛（视频6）。

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视频6. 干预参数– 中枢神经系统。视频演示了诱发癫痫发作的程序，这是与中枢神经系统相关的干预参数：显示了1分（不存在）（基线）。

发作。抓住老鼠的尾巴，轻轻地将其挂起，在手指之间旋转，然后将动物轻轻地放回舞台。分析反应。
数据分析

定量- 饲养（频率），修饰（频率和/或Ti 米E），运动（在-1距离使用软件，例如，Ethovision ® -和/或计数平方单位），排尿（尿斑点的数目），排便（粪便的数量大丸剂）。
定性– 耳反射（分数），角膜反射（分数），对触觉的反应（分数），甩尾（分数），肌张力（无/存在），后肢成角度（分数），表面扶正反射（分数），握力（评分），Straub尾巴（不存在/存在），共济失调（不存在/存在），镇静（不存在/存在），癫痫发作（不存在/存在）。
对于统计分析，可以使用统计分析软件执行Mann-Whitney（对于非参数变量，例如得分）或Unpaired t - t est（对于参数变量，例如频率）。

代表性的结果

为了说明使用该方案来表征具有感觉运动障碍的小鼠品系，从隐性突变crup 的初步研究中得出了代表性的结果。BALB / cJ小鼠用作对照组。

关于一般活动，crup 突变体显示出较低的饲养（t = 4.221，df = 28，P = 0.0002），修饰频率（t = 5.453，df = 24，P < 0.0001），且行进距离减少了（t = 6.124，df 与BALB / cJ小鼠相比（= 1 = 24 ，P < 0.0001）和平均速度（t = 6.109，df = 24 ，P < 0.0001 ）（图1）。

D：\ Reformatting \ 2020-3-2 \ 1902958--1351 Mariana Garcia-Gomes 837219 \ Figs jpg \ Fig1.jpg

图1. 代表性的结果显示了BALB / cJ和crup 突变小鼠（n = 13 /组）在野外的一般活动。A.饲养频率；B.梳理频率；C. 行驶距离，运动；D.平均速度。数据表示为平均值±SEM。采用未配对的t 检验评估应变差异，P <0.05。

所述crup 呈现突变体降低角膜反射（P 与BALB / cJ小鼠相比= 0.0023，U = 30.50）。感觉系统中涉及的其他参数，例如耳反射（U = 62.50），对触摸的反应（U = 57.50）和甩尾（U = 66.50），并未显示出菌株之间的差异（图2）。

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图2. 代表性结果显示了与BALB / cJ和crup 突变小鼠（n = 13 /组）的感觉系统相关的参数。一。耳反射 B.角膜反射；C.对触摸和D的响应。甩尾。数据表示为四分位数间距的中位数。采用Mann-Whitney检验评估菌株差异，P <0.05。

对感觉运动系统的分析表明，与cr缩小鼠相比，后肢弯曲减少了（P < 0.0001，U = 0），表面扶正反射（P < 0.0001，U = 0）和抓地力（P < 0.0001，U = 0）BALB / cJ控件（图3）。

D：\ Reformatting \ 2020-3-2 \ 1902958--1351 Mariana Garcia-Gomes 837219 \ Figs jpg \ Fig3 .jpg

图3. 代表性结果显示了与BALB / cJ和crup 突变小鼠（n = 13 /组）中的感觉运动系统有关的参数。一。后肢成角度；B.表面扶正反射；C.掌握力量。数据表示为四分位数间距的中位数。采用Mann-Whitney检验评估菌株差异，P <0.05。

对于使用分数参数，我们使用Mann-Whitney检验以及其他参数，我们使用非配对牛逼- 测试。

关于自主神经系统参数，与BALB / cJ相比，crup 突变体排尿（t = 2.312，df = 24，P = 0.0297）和排便（t = 6.853，df = 24，P < 0.0001）降低（图4）。

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图4. 代表性结果显示了与BALB / cJ和crup 突变小鼠（n = 13 /组）中的自主神经系统有关的参数。一。ü rination ; 乙。排便。数据表示为平均值±SEM。未配对吨- 试验来评估应变的差异，P <0.05。

笔记

此测试使用的竞技场可以与开放式测试使用的竞技场相同。
测试应在每天的同一时间（例如，早晨）由同一人进行，该人对动物的表型视而不见。必须在电池之间没有静止时间的情况下测试参数。可以在相似条件下的不同日期对动物进行测试以进行比较。
该协议旨在筛选具有遗传变异，神经退行性疾病功能或药物研发的小鼠的行为表型。测试涵盖基本参数，以评估一般的神经系统特征，包括感觉运动和感觉能力，以及自主神经和中枢神经系统功能。
考虑到因观察每个参数而引起的反应的复杂性，必须仔细进行数据解释，同时还应考虑到表型表现可能因体重，健康状况，身体状况，昼夜节律，遗传背景，性别或年龄而异；例如，随着年龄的增长，行为变化可能会恶化，如果在不同的生命阶段对动物进行分析，则会表现出不同的结果。多因素的干扰应采取的帐户，如环境和壳体条件，动物实验者相互作用，样品大小和顺序试验进行（ħ å 内尔和Marklund ，2014）。
可以远程记录常规活动，从而可以进行自动分析，但其他参数需要在现场评估中进行。
由于两个主要原因，必须在露天场地而不是在笼子里进行测试：首先，所有动物都应该暴露在相同的陌生环境中（Whishaw 等，1999）。其次，需要进行一些测试和干预，这在露天场地中很方便。
正常的探索行为是通过计算水平运动和垂直活动来衡量的，该活动用于评估基本运动信息，该信息与其他参数一起可以提供有关小鼠表型的更准确数据。
感觉神经系统评估是表征遗传修饰或自发突变小鼠品系的重要步骤。因此，感觉障碍的观察可能有助于阐明其发展（^ h å 内尔和Marklund，2014）。可以通过动物的反射以及对与身体和本体感受有关的特定刺激的反应来测量感觉参数，这表明了诱发的脑电位（Sousa and Almeida，2006）。
在该协议中，通过直接测量反射来评估感觉功能，例如对听觉（耳反射），视觉（角膜反射）和体感（对触碰和甩尾反应）的反应。感觉运动系统参数- 肌肉张力，后肢成角度，表面扶正反射和抓握力- 可以提供有关小脑功能或大脑不对称功能的信息。但是，抓地力也会受到体重的影响（Sousa和Almeida，2006）。
在初步筛查中检测感觉或感觉运动不足可能会支持选择特定的行为测试，因为考虑到了动物的身体残疾。

通常，可以选择多个任务来测试与基因产物的假定功能相关的行为类型（Crawley，1999）。在crup 突变小鼠的行为分析中代表了我们方法的一个例子，与BALB / cJ小鼠相比，其表现出总体活性的显着降低。与BALB / cJ相比，感觉运动障碍的表现为表面矫正反射和抓握强度得分较低，而后肢成角度得分较高。关于感觉功能，cr缩除了排尿和排便减少外，还表现出角膜反射降低，而排尿和排便是与自主神经系统有关的参数。该协议允许进行准确而全面的行为分析，暗示了从隐性突变株crup 的初步研究来看的退化过程。当前的代表性结果表明，行为遗传学分析关注突变基因的作用。适当的行为反应取决于反射和感觉能力。初步分析可以为其他导致真正的认知缺陷的测试提供指征（Sousa和Almeida，2006），并且可以扩展用于进一步的研究。
使用行为测试电池时的一个关键点是，如果操作程序令人反感，动物会受到干扰。如果按照不断增加的应力阶梯进行测试，则测试序列可以减弱此类干扰。例如，首先在露天场所观察到环境适应的一般活动，然后观察参数。作为压力最大的干预参数必须是最后要观察的，因此一项测试的压力不会干扰随后的测试响应。

该协议解决了对18个参数的分析，这些分析提供了表征小鼠表型的初步数据，并有助于选择更具体的测试。尽管已经单独描述了其中一些任务，但此处将它们作为测试电池展示。突出了以下优点：价格便宜；快速且易于执行的协议；旨在涵盖动物所表现出的大量行为的组合参数；导致各种残疾的行为指纹。

致谢

该协议基于在圣保罗埃斯帕多萨基金会基金会（FAPESP）根据项目编号2017 / 21103-3，以及在巴西比索尔大学佩尔索阿尔·皮埃尔· 桑维尔高级协调局（CAPES）-财务代码001支持的工作。作者要感谢Ricardo Antiorio先生在视频记录方面提供的技术帮助，以及Marina FA Landi女士的英文版本。Thi 的方案改编自Manes 等。（2019）和Yamamoto 等人。（2019）。

利益争夺

作者声明没有利益冲突或利益冲突。

伦理

动物实验得到巴西圣保罗大学动物医学与动物科学学院动物护理和使用伦理委员会的批准（协议编号3773120116，FMVZ-USP）和生物医学科学研究所，协议编号053，第页32，书3（2015）。

参考文献

克劳利，JN（1999）。转基因和基因敲除小鼠的行为表型：总体健康，感觉功能，运动能力和特定行为测试的实验设计和评估。脑研究835（1）：18-26。
ħ å 内尔，A。和Marklund，N。（2014）。用于药物发现研究的啮齿动物行为测试的结构化评估。前行为神经科学8：252。
伊利亚迪（KG），格吕森科娃（Gluscencova）和瑞士布连尼（GL）（2016）。心理运动行为：果蝇中的一种实用方法。前沿精神病学7：153。
鬃毛，M.，加西亚-戈麦斯，MSA，Sandini，TM，Zaccarelli-Magalh ã ES，J.，弗洛里奥，JC，亚历山大-Ribeiro的，SR，Wadt，D.，Bernardi的，MM，Massironi，SMG和森，CMC （2019）。缺乏otoconia 的mlh 突变小鼠的行为和神经化学特征。Behav Brain Res 359：958-966。
McCorry，LK（2007）。自主神经系统的生理学。Am J Pharm Educ 71（4）：78。
McLeod，C.和Hartley，S.（2018年）。责任与实验动物研究治理。科学技术人类价值观43（4）：723-741。
Pritchett-Corning，K.，Chou，S.，Conour，L. and Elder，B.（2011年）。小鼠和大鼠菌落管理指南。
罗杰斯（Rogers，DC），费希尔（Fisher），新兴市场（EM），布朗（SD），彼得斯（Peters），J。，亨特（Hunter），AJ和马丁（JE）马丁（1997）。小鼠表型的行为和功能分析：SHIRPA，拟议的综合表型评估方案。哺乳动物基因组8（10）：711-713。
斯金纳，B 。F. （1950年）。科学与人类行为。卷 28. doi：10.2307 / 3707860。
Sousa，N.，Almeida，OF和Wotjak，CT（2006）。实验室啮齿动物行为分析的旅行者指南。基因脑行为5补充2：5-24。
Van Meer，P.和Raber，J.（2005）。系统生物学中的鼠标行为分析。生物化学杂志389（Pt 3）：593-610。
瓦尔斯滕。D.（2011年）。鼠标行为测试。伦敦，学术出版社。
Whishaw，IQ，Haun，F。和Kolb，B。（1999）。实验室啮齿动物行为分析。在：Windhorst U.，Johansson H.（E ds 。）中。在：神经科学研究的现代技术。施普林格，柏林，海德堡。
山本（PK），德索萨（Z. 2019）。遗传和行为表征的Kmt2d 小鼠突变体，一种歌舞b综合症的新模型。基因脑行为18（8）：e12568。