材料和试剂

10厘米细胞培养皿（Corning，目录号：430167）
1.5 ml Eppendorf管
移液器吸头
小鼠（NOD.CB17-PRKDC SCID / J，杰克逊大号aboratory，目录号：001303）
A549细胞（ATCC ，目录号：CCL- 185）
DMEM / F12培养基（Sigma，目录号：D8437）
笔/链球菌/谷氨酰胺（Gibco，目录号：10378-016）
胎牛血清（FBS）（Sigma，目录号：F0926）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Thermo Fisher，目录号：10010-049）
生长因子减少基质胶（Corning，目录号：354230）
镇痛药（盐酸丁丙诺啡，0.1 mg / kg SQ，ZooPharm ）
胰蛋白酶-EDTA（Gibco，目录号：25300-054）
70％乙醇（Decon Labs，目录号：DSP-MD-43）
10％中性福尔马林缓冲液（Sigma，目录号：HT501128）
苏木（VWR，目录号：97062-216）
曙红（VWR，目录号：97061-034）

设备

Sorvall Legend X1 离心机（Thermo Scientific，目录号：75004221）
Vi-cell XR细胞活力分析仪（Beckman Coulter，目录号：1096573）或血细胞计数器
操作剪刀（Fisher，目录号：13-806-4）
Exel International具有11 号手术刀片的无菌一次性手术刀（Fisher，目录号：14-840-01）
解剖镊子，尖尖的，弯曲的和笔直的（Fisher，目录号s ：08-875 和08-880）
生物安全柜
外科自动夹系统套件（包括夹钳和卸妆器）（精细科学工具，目录号：12120-00）
耳标签（1005-1）和涂抹（1005s1）（国家乐队和标签公司）
150 mm / 6 数显卡尺（World Precision Instruments ，目录号501601）
È·Z麻醉（Euthanex CORP。，串行NO：EZV2007）

软件

Olympus cellSens Standard 1.17 图像分析软件（奥林巴斯，宾夕法尼亚州中心谷）
SAS9.4 （美国北卡罗来纳州卡里的SAS Institute Inc. ）
R （综合R 存档网络，http：//cran.us.r-project.org，1997年）

程序

准备细胞
种子细胞成10厘米dishe 秒（0.5 X 10 6 个细胞/皿）在植入前三天。
植入前一天更换培养基（DMEM / F12 + 10％FBS + 1％Pen / Strep /谷氨酰胺）。
通过胰蛋白酶消化收集细胞，用PBS冲洗3次，计数并以2 x 10 7 / ml 将细胞重悬于PBS中。
注意：Ť 制备将取决于所需的小鼠的细胞数目otal体积。

准备每米1.5毫升Eppendorf管乌斯并在PBS中与60微升的Matrigel混合60μl的细胞悬浮液（比例细胞：基质胶为1：1）。
注意：由于基质胶在10°C以上会形成凝胶，因此基质胶溶液应在4 °C 融化过夜，并在整个制备过程中置于冰上。植入前，应将用于转移Matrigel溶液的试管和吸头冷却。

植入细胞和Matrigel混合成NOD.CB17-PRKDC SCID / J（＃001303;杰克逊大号aboratory）
从身体外侧的墙壁区域剃掉头发。
小鼠手术前20-30分钟给予镇痛药（丁丙诺啡e HCl，用无菌生理盐水稀释，剂量为0.1 mg / kg SQ）。
注：乙uprenorphin HC 升是一种受控物质，应该是ST 在双重上锁的柜子或运算。

通过异氟醚吸入麻醉小鼠，直到对脚趾不敏感为止。在操作过程中，保持鼠标温暖并监测呼吸。
注：Ÿ 欧应遵循IACUC协议ADMINIST 呃异氟醚的合适的剂量。

消毒手术部位以providone 与-碘交替70％等hanol 为3吨输入法编辑器。

注意：小号EE V 记意1 为小号TEP 小号乙5- 乙9 。

提起的小号用无菌镊子解剖和与补充约5毫米的切口亲属操作剪刀在横向体壁只是后方的腋区。
用钝器解剖皮下袋。
（可选）使用带有200 µl宽孔移液器的移液器将100 µl与Matrigel混合的细胞（1 x 10 6个细胞）转移到袋中，以最大程度地减少细胞的剪切。
将耳标放在鼠标上。
关闭切口使用夹具施放瓦特第i 9米米外科夹子和地方小鼠中恢复笼中。中号乌斯应该恢复从麻醉中1-2 分钟。

C：\ Users \ Bio-Dandan \ Dropbox \ Refomatting \ 2020-4-05 \ 3579--1902863--1323 Min Chen 781947 \ video 1.jpg

视频1. 将细胞和基质胶混合物皮下植入小鼠体内

监测肿瘤的生长
每天检查夹子和鼠标的健康状况，直到使用从鼠标上取下的夹子去除夹子为止；手术后7-10天应去除伤口夹。
使用卡尺3次/周测量肿瘤大小和体重备忘录Ë 直到肿瘤大小达到周围1,000-1 ，5 00 毫米3 （注：端点将取决于实验的目标）。第REE 参数的的肿瘤：将长度（的最长直径），该宽度（在直径perpend icul 一个ř 到的长度），并且所述高度被记录。

收获原发性肿瘤组织和器官
执行CO 2 安乐死和维持CO 2 流为一个最小的1 分钟后呼吸停止; 然后进行颈椎脱位。
注：Ÿ 欧应遵循你的IA CUC协议，以牺牲鼠标。

用70％乙醇清洁肿瘤区域。
切割皮肤的仔细d移除肿瘤和肿瘤发生在含有DMEM / F12培养基中，并保持在冰上的无菌管中。
进行尸检以去除肺或其他器官，例如肝，脾，肾或脑，然后将其放入装有DMEM / F12培养基的试管中，并将试管放在冰上。
用PBS冲洗组织。
在4 °C下将组织在10％中性缓冲福尔马林中固定过夜，并在处理石蜡包埋之前用70％乙醇代替溶液。
注意：此步骤可能需要组织病理学设施来处理样品。

用苏木精和曙红（H＆E）染色组织。
检查H＆E 载玻片来识别病灶的腺癌（对A549 细胞）（图1）。这些可以被识别通过识别特征的建筑和细胞学特征（例如，腺肿瘤地层，乳头状生长，或鳞片状瘤;传播损失的核极性，细胞核与精细染色质和突出的核仁，anisonucleosis ）。
测量的直径的每个肿瘤病灶中毫米使用一个数字千分尺。
注：w ^ ê使用奥林巴斯cellSens 标准1.17图像分析软件。

D：\ Reformatting \ 2020-2-7 \ 1902863--1323陈敏781947 \ Figs jpg \图1.jpg

图1.肺切片的H＆E染色。放大倍率= （A）中图像的40倍，（B）中图像的200倍。秤栏= 1 的（A）毫米，100微米（B）中。箭头指示肿瘤灶。显示了代表性图像。

数据分析

记录总数的病灶和计算的肿瘤病灶发生率（总数的病灶/观测时间（天））。
计算肿瘤体积（V）基于对所述测量从步骤c ^ 2 为V = （L X w ^ X H）/ 2 ，其中V = 肿瘤体积，大号= 肿瘤长度，w ^ = 肿瘤宽度，和^ h = 肿瘤的高度。
数据分析：对于在体内实验转移研究中，一个线性混合效应模型被用于到适合的纵向肿瘤体积和测试的显著差异的平均肿瘤体积型材之间治疗GROU PS（图2）。Ť 他韦尔奇两样本吨-test 应该被用来以试验的差的的平均肿瘤灶大小之间的基团。甲泊松模型被用来对模拟的数量肿瘤病灶发生率每一天和显著差的肿瘤病灶发病率之间组被测试使用泊松测试。统计差异之间的群体将被视为显著在该水平的0.05。

D：\ Reformatting \ 2020-2-7 \ 1902863--1323陈敏781947 \ Figs jpg \图2.jpg

图2.肿瘤增长率。拟合肿瘤生长曲线并使用R软件作图。黑线是肿瘤体积分布图，蓝线是观察到的平均肿瘤体积。

笔记

尸检后的肿瘤组织和器官可用PBS冲洗并立即固定，或在无血清的情况下在冰上临时储存在无血清的培养基中，在进一步处理前应少于30分钟。
幻灯片评估可能需要病理学家的帮助。

致谢

这项研究得到了美国癌症协会机构研究拨款IRG-85-001-25（MC）的支持；肯塔基州肺癌研究计划（MC）；美国国家卫生研究院转化科学国家推进中心UL1TR000117（MC）；肯塔基大学癌症与新陈代谢中心[P20GM121327]通过成像核心提供服务，并获得试点资金[无授权号，给MC]）；和美国国立卫生研究院R01 CA109136（KLO）。美国国立卫生研究院支持Markey Cancer Center生物样本采购和转化病理学，生物统计学和生物信息学以及癌症研究信息共享资源设施[P30 CA177558]。简要描述了该协议，并最初在Liu 等人的文章中发表，2019年。

竞争利益

作者报告没有利益冲突。

伦理

根据肯塔基大学动物保护与使用委员会（IACUC）批准的程序进行动物研究。

该协议是从Liu 等人（2019）和Morton 等人（2007 ）修改而来的。

参考文献

D'Antonio ，C.，Passaro ，A.，Gori，B.，Del Signore，E.，Migliorino ，MR，Ricciardi，S.，Fulvi ，A.和de Marinis ，F.（2014）。肺癌的骨和脑转移：治疗策略的最新进展。疗法进阶医学ONCOL 6（3）：101-114。
Dutt ，A。和Wong，KK（2006）。肺癌的小鼠模型。Clin Cancer Res 12（14 Pt 2）：4396s-4402s。
Gomez- Cuadrado ，L.，Tracey，N.，Ma，R.，Qian，B. and Brunton，VG（2017）。转移小鼠模型：进展和前景。Dis Model Mech 10（9）：1061-1074。
Heist，RS和Engelman，JA（2012）。SnapShot：非小细胞肺癌。癌细胞21（3）：448 e442。
Justilien ，V. and Fields，AP（2013）。人类非小细胞肺癌（NSCLC）的原位模型在评估新型和新兴癌症治疗方法中的实用性和应用。Curr Protoc Pharmacol 62：第14单元27。
卡纳（Khanna）和亨特（Hunter）（2005）。建模体内转移。致癌作用26（3）：513-523。
Liu L.，Qi L.，Knifley ，T.，Piecoro ，DW，Rychahou ，P.，Liu，J.，Mitov ，MI，Martin，J.，Wang，C.，Wu，J.，Weiss， HL，巴特菲尔德，DA，Evers，BM，O'Connor，KL和Chen，M.（2019）。S100A4通过上调线粒体复合体I蛋白NDUFS2来改变新陈代谢并促进肺癌细胞的侵袭。生物化学杂志294（18）：7516-7527。
莫顿，CL和霍顿，PJ（2007年）。在免疫缺陷小鼠中建立人类肿瘤异种移植物。Nat Protoc 2（2）：247-250。
Okada，S.，Vaeteewoottacharn ，K.和Kariya ，R.（2019年）。高度免疫受损的小鼠在建立患者源异种移植（PDX）模型中的应用。单元格8（8）。
斯蒂格· PS（2016）。靶向转移。Nat Rev Cancer 16（4）：201-218。
Whitsett，TG，Inge，LJ，Dhruv，HD，Cheung，PY，Weiss，GJ，Bremner ，RM，Winkles，JA和Tran，NL（2013）。肺癌转移至中枢神经系统的分子决定因素。Transl 肺癌研究2（4）：273-283。
Zheng，S.，El-Naggar，AK，Kim，ES，Kurie ，JM和Lozano，G。（2007）。具有生存性别差异的转移性肺癌的遗传小鼠模型。癌基因26（48）：6896-6904。