材料和试剂

移液器吸头10 µl（Sartorius）
移液器吸头200 µl（Sartorius）
移液管头1 ，000微升（赛多利斯）
移液器套装（SARSTEDT，Nümbrecht ）
标准F 猎鹰管15 ml（DARSTEDT AG＆CO.KG，目录号：9042012）
标准F 猎鹰管50毫升（DARSTEDT AG＆CO.KG，目录号：9042211）
Polypyro 0.2 µm膜过滤器（Pall C 公司，目录号：32771646）
渗析膜（SERVA，透析管，MWCO 12 ，000 - 14 ，000 RC，直径21毫米目录号：44144.02）
超速离心管，30 ml （G- Kisker GbR 产品，UZ-PC- 38. 5- 2）
光度计比色皿（Semi-micro Q-VETTES，1.6 ml PS，Ratiolabs ，目录号：2712120）
一次性乙烯基手套（Semper保护罩）
塑料瓶，100-500毫升，当地供应商
Omnifix ® 独奏，B.Braun5毫升注射器
PD10柱（GE Healthcare ，目录号：28925232A）；2-3个二手
乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：STBJ2652）
十二烷基硫酸钠（SDS）
HEPES（Roth，目录号：9105.2）
EGTA（Roth，目录号：3054.3）
KCl（Apllicem，货号：7447.40.7）
NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：STB117768）
将NaOH（费希尔小号系统求解，目录号：1310.732）
二硫苏糖醇（DTT）
三或三氨基甲烷（ACROS ø - [R ganics，目录号：A0394024）
的Chelex 材料（的Chelex 100 ® 自Sigma-Aldrich钠）
盐酸胍（Roth，目录号：6069.3）
LB介质（Roth，目录号：X964.4）
氨苄西林（Roth，目录号：K029.2），储存在4°C
卡那霉素（全生命科学）存储在4°C。
硫酸铵（Roth，目录号：3746.1）
Bradford试剂（Bio-Rad，目录号：500-00069，储存于4°C。
肉豆蔻酸（Fluka ，目录号：BCBJ9925L），储存在4°C下。
Sigma-Aldrich的BAPTA（1,2双（2-氨基苯氧基）乙烷-N，N ，N'，N'- 四乙酸四钠盐）
钙标准溶液，10 g / L（WTW D - 82362 Weilheim; https://www.fishersci.de/shop/products/es/ca-model-standard-solution/10099770）
尿素（Roth ，目录号：X999.3）
Kimmwipes ® 精简版（金佰利-Clark）
甲醇（Sigma-Aldrich，目录号：STBH6784）
Decon 90（ITC系统清洁剂）（Decon Laboratories Limited ）
阴离子交换色谱缓冲液A（请参见配方）
阴离子交换色谱缓冲液B（请参见配方）
体积排阻色谱缓冲液（请参见配方）
ITC缓冲区（请参阅食谱）

设备

大小排阻层析柱（的HiLoad 26/60 的Superdex 75，GE，目录号：17-1070-01）
阴离子交换色谱柱（Hiload 26/10 Q sepharose High performance，GE，目录号：17-1066-09）
玻璃烧杯（100-200 ml，Schott Duran）
水浴（中号埃默特）
- 80 ℃下冷冻（保温瓶电子Ç orporation）
涡旋（Vortex Genie2）
离心机（Backman C oulter ，Avanti J - E离心机，转子：70Ti）
超速离心机（Kendro 实验室产品，转子：AT4）
超速离心机（SORVALL Discovery M120SE，转子：JA 25.50）
光度计（食品ALYT OMNILAB，122197）
紫外可见分光光度计（UV - Vis SpecORD 205，5BU1768）
AKTA 小号馅饼蛋白质纯化系统（GE Healthcare 大号IFE 小号cience，目录号：29003181）
溶剂过滤装置（Nalgene）。
脱气机（thermoVac microcal ）
等温滴定热分析系统（VP - ITC微量热分析法，Microcal ）

软件

产地® ，Microcal ，北安普顿，马萨诸塞州https://www.malvernpanalytical.com/en
WinASPECT 光谱分析软件https://www.analytik-jena.de/

程序

图1显示了工作流的总体视图。

D：\ Reformatting \ 2020-2-7 \ 1902844--1317 Karl-W。科赫744884 \ Figs jpg \ Figure 1.jpg

图1. ITC 确定Ca 2+ 与bGCAP1结合的实验步骤的工作流程摘要

蛋白表达
注意：蛋白的表达和纯化不是本报告的主要重点，请参阅以下一些步骤以进行一般性了解。

使用E. 大肠杆菌细胞（BL21-CodonPlus，Stratagene公司）具有用于过夜培养（V = 5毫升）牛GCAP1（bGCAP1）序列含有质粒。
将5 ml培养液放入500 ml LB培养基中，诱导后最多4 h 在细胞中表达蛋白质。
收获细胞，通过离心（5 ，000 × 克，10分钟，4℃）。在pH 7.5的50 mM Tris Buffer中重悬细胞沉淀（对于500 ml的细菌培养物，沉淀为20 ml）。
如前所述（Hwang and Koch，2002; Koch and Helten ，2008），使用两步色谱方案（尺寸排阻色谱和阴离子交换色谱）纯化蛋白质。

bGCAP1透析
经营的P olyacrylamide使用十二烷基硫酸钠（SDS）12％聚丙烯酰胺凝胶，以确认蛋白质纯度凝胶电泳（PAGE）（见下文凝胶，图2的图像）。
使用以下步骤用5 mM EGTA准备（激活）透析膜：
如有必要，将膜切开（应足够10厘米），将其放入装有双蒸馏水（ddH 2 O）的玻璃烧杯中，并在微波炉中煮沸直至水沸腾。
除去热水，加清水，加入5 mM EGTA，再次煮沸。
除去水含EGTA，并重复小号TEP B2 b 两次。
将此活化的膜保存在4 °C 的冷藏室中，用无EGTA的水在玻璃烧杯中保存。存储在此条件下，可以最多一个月。
注意：切勿在没有水的情况下存放活化的透析膜。切勿在没有手套的情况下触摸透析膜。

准备透析缓冲液（从现在起到ITC缓冲液，请参见下文“配方”下的内容），其pH值为7.5。
阴离子交换层析后取一小份新鲜纯化的bGCAP1蛋白（最大体积10 ml）。参见凝胶图像的分馏（图2 ）。

D：\ Reformatting \ 2020-2-7 \ 1902844--1317 Karl-W。科赫744884 \ Figs jpg \ Figure 2.jpg

图2. bGCP1馏分的SDS-PAGE分析。分析通过阴离子交换层析获得的级分，“洗”表示未结合的级分，1-5是洗脱的bGCAP1级分。2号样品纯度最高（≥95 ％），用于ITC实验。

戴上手套，拿走活化的膜。P UT在膜（也可以使用止动件，以避免蛋白漏出透析期间但这样做一个结是更有效的）的一侧上的结，用移液管10毫升bGCAP1蛋白填充膜。现在，在膜的另一侧再打一个结，然后在两端加塞子（见图3）。
放置蛋白填充膜进入ITC缓冲液过夜（至少3 大号b uffer 10毫升bGCAP1 溶液）。

D：\ Reformatting \ 2020-2-7 \ 1902844--1317 Karl-W。科赫744884 \ Figs jpg \ Figure 3.jpg

图3.透析膜的组装。显示了打结和塞子的位置。

准备chelex 色谱柱（用于去除阳离子的阴离子交换材料）
在使用之前，无论是否以前使用过或从供应商处新鲜获得的Chelex 材料都必须进行再生。为此，最适合使用溶剂过滤装置。该设备包含一个过滤器支架和一个位于其顶部的腔室。过滤装置通常用于通过泵过滤溶液。此外，需要0.2微米的聚焦高温膜过滤器。它被放置在保持器上（商业过滤装置的一部分），并保持CHELEX 在它上面的树脂中，当真空泵被接通和洗涤液通过过滤器吸入。因此，它防止了chelex 材料流入废物中。的是再生和洗涤过程的步骤如下：
˚F 生病上与过滤器保持器的顶部的腔室CHELEX 和洗涤用500ml双蒸水。
W¯¯ 灰CHELEX 用200ml的1M HCl。
W¯¯ 灰CHELEX 用500ml双蒸水。
W¯¯ 灰CHELEX 用200ml的NaOH。
W¯¯ 灰CHELEX 用500ml双蒸水一次。悬浮在双蒸馏水中，然后将chelex 材料转移到一个塑料瓶中。
准备一个塑料瓶以供Chelex 存储。用5 mM EGTA溶液洗涤瓶子。储存再生的蜡lex 之前，应先用水冲洗。
调整Chelex 悬浮液的pH值，它应该是中性的（大约7 ）。否则可能会损害bGCAP1的蛋白质功能。调节chelex 材料的pH 可能是非常困难且耗时的。请参阅注释以获取一些提示。
取出用过的PD10色谱柱，然后除去色谱柱材料（通常是凝胶过滤树脂）并丢弃。PD10色谱柱底部有一个小床。离开它的列中。使用6M尿素清洁的情况下，该列的流量为s 低。固定柱的柱支架，并用填充CHELEX 被存储在现在的水（图4）。让水流小号出来，所有CHELEX 材料停留内的列。您的chelex 台式色谱柱可以随时使用。

D：\ Reformatting \ 2020-2-7 \ 1902844--1317 Karl-W。科赫744884 \ Figs jpg \ Figure 4.jpg

图4.将chelex 材料填充到使用过的（“旧”）PD10色谱柱中。答：PD 10色谱柱由常规色谱柱固定器固定。Chelex 可以在移液器吸头中视为白色物质。它被填充到PD10列中。B. Chelex 正在重力流作用下沉降。水或缓冲液将通过底部的床或小平台，从而保留雪茄材料。任何类型的管都可用于收集流通量。

从bGCAP1中去除Ca 2+ （脱钙）
过夜透析后，使用移液器从透析膜中取出bGCAP1，并将其转移至15 ml F alcon管中。用Bradford蛋白质定量方法（Bradford，1976）检查蛋白质浓度。请注意，基于考马斯染料的蛋白质测定方法取决于用于校准的蛋白质的性质。
提示：ü 瑟蛋白质特定的校准曲线。通过使用您感兴趣的蛋白质作为标准来创建此曲线。制备标准浓度（1- 通过使用蛋白质测定例如测量UV吸光度的第二独立的方法10微克/毫升）。确定摩尔消光系数（Pace and Schmid，1997），并使用朗伯-比尔定律进行应用；参见下面的步骤E4 。

取Chelex 台式色谱柱并应用bGCAP1（如果色谱柱总体积为10 ml，则bGCAP1溶液应为5 ml，Chelex 物质为5 ml ）。混合CHELEX 与bGCAP1里面列有轻微手旋转。要么离开冷室中列半小时，或将其用于端到端的旋转冷室中保持bGCAP1直接接触CHELEX 。
注：我t是NEC 埃森那bGCAP1与直接接触CHELEX 去除钙材料2+ 。

从Eppendorf管（2 ml）的柱中收集bGCAP1，并在测量后用蛋白浓度标记管。

取消计算ITC缓冲区
准备另一CHELEX 板凳Ç 新鲜olumn CHELEX 和修复列一列架。
准备塑料瓶（Ca 2+ 污染也可能来自塑料材料）以收集脱钙的ITC缓冲液，如下所示：
拿起任何100-200 ml塑料瓶，然后用1 M HCl洗涤。
用水冲洗瓶子。
再次用5 mM EGTA清洗瓶子。
用双蒸馏水冲洗瓶子。
将不含Ca 2+的塑料瓶放在色谱柱下，并通过50 ml ITC缓冲液（为避免缓冲液不匹配，请准备更多的透析液/ ITC缓冲液）。
使用BAPTA作为指示剂，通过确定缓冲液中的游离Ca 2+ 来检查脱钙缓冲液中还剩下多少Ca 2+ 。安装WinASPECT spectroanalytical 软件，或使用任何其它正在运行的软件的一个分光光度计。打开程序和初始化个通过打开紫外灯C计划。将灯的波长设置为254 nm。从仅包含缓冲液的参考样品开始吸光度测量。然后，测量缓冲液与BAPTA混合3次（单独重复）的吸光度，然后计算平均值。
用于BAPTA测量的缓冲液制备：
取500 µl脱钙的ITC缓冲液进行参考测量。
取495 µl缓冲液，并与1 mM储备液中的5 µl BAPTA混合。
涡旋样品。
使用下面列出的公式计算缓冲液中的游离Ca 2+ ：总[BAPTA] = [ BAPTA f ] + [ CaBAPTA ]
[ CaBAPTA ] = [Ca 2+ f ] [ BAPTA f ] / K D （Ca）

K D （Ca）= 107 nM ; 在ITC缓冲液条件下（室温22±2°C；Tsien ，1980），Ca 2+ 与BAPTA结合的解离常数。

作为第一步骤，确定Ca的浓度2+ -free BAP TA（[ BAPTA ˚F 通过在254nm处测量吸光度。根据朗伯-比尔定律A =ε × Ç × 升，CA lculate C，浓度[ BAPTA ˚F ];另一个参数是消光系数ε= 1.6 × 10 4 中号-1 × 厘米-1 和l =试管的长度（例如，1厘米）用[ BAPTA ˚F ]和总的已知浓度[BAPTA] （例如，20μM）可以计算出[ CaBAPTA ]。

例如，吸光度的平均值可能是0.095。

当A =ε × c × l时，我们得到

0.095 = 1.6 × 10 4 M -1 × 厘米-1 × 1厘米

对于浓度c = 5.9 µM

与BAPTA结合的Ca 2+ 的浓度为

[ CaBAPTA ] =总计[BAPTA] - [ BAPTA f ]

= 10 µM-5.9 µM

= 4.1 µM

导致

[Ca 2+ f ] = 0.107 µM× 4.1 µM / 5.9 µM

[Ca 2+ f ] = 0.074 µM或74 nM

[Ca 2+ f ]的浓度为74 nM 可能是下限，可以实现。在不存在诸如EGTA之类的Ca 2+ 螯合剂的情况下，低于80 nM 的[Ca 2+ f ] 浓度可能足以满足大多数滴定的需要。可以重复执行整个缓冲区脱钙过程以达到此下限。

准备在ITC系统
用5％Decon （系统清洁剂）清洗样品池（ITC仪器内部的GCAP1蛋白腔）。从100 ml的5％开始Decon，然后加入400 ml双蒸馏水。通过插入上样注射器（图6）从样品池中除去残留的水，并用脱钙的ITC缓冲液洗涤样品池。然后，用脱钙的ITC缓冲液填充样品池，直到蛋白质样品准备就绪为止。这有助于平衡样品池，并去除游离的Ca 2+ 。
清洗属于ITC系统一部分的ITC样品注射器（图5），并由软件自动控制。在我们的案例中，它含有配体或Ca 2+ 。用小塑料管将5 ml的小注射器活塞（Omnifix 5 ml的小注射器或往复泵，请参见材料）连接到样品注射器端口（图5 A ）。用5％Decon 填充ITC仪器随附的特殊ITC管，并将其固定在ITC样品注射器下方的支架中（滴定过程中，ITC管会用水冲洗注射器）。通过样品注射器后，使用注射器活塞捕获5％的去污剂。至少用30 毫升水重复相同的步骤，以除去内部剩余的洗涤剂。
干燥ITC样品注射器。从注射器支架上取下ITC管，并使注射器尖端留在空气中。使用小注射器活塞将空气吸入样品注射器。重复此过程几次，以除去所有水滴。
提示：Ç 从软件舔吹扫和填充按钮，这个过程会带来所有的水在注射器尖端并放置一个金抹在尖端捕获所有的水。

C：\ Users \ Bio-Dandan \ Dropbox \ Refomatting \ 2020-4-05 \ 3580--1902844--1317 Karl-W。科赫744884 \ Figs jpg \ Figure 5.jpg

图5. ITC系统。A. Ť 他ITC样品注射器被连接到Omnifix 小注射器用于洗涤步骤（见正文）。该红色箭头表示包含样品和参考单元的腔的顶部。为了进行滴定，将整个样品注射器移至腔体的开口处，并以插入长金属尖端（右侧面板中的蓝色箭头）的方式定位。B．将Ca 2+ 溶液注入样品注射器的样品管。

D：\ Reformatting \ 2020-2-7 \ 1902844--1317 Karl-W。科赫744884 \ Figs jpg \ Figure 6.jpg

图6 。加载注射器的图像

准备用于样品池，注射器和参比池的蛋白质样品
样品池：计算一次测量需要多少bGCAP1（20 µM最终浓度s；有关配体与蛋白质的最佳比例的计算，请参见注释＃17），添加其余的脱钙ITC缓冲液以达到最终浓度。准备另一个内部至少含2毫升Chelex 材料的Chelex 色谱柱。将蛋白质样品添加到色谱柱中，然后放在冰上。
准备样品用于填充ITC样品注射器（CA 2+ 在我们的情况下）：使用钙标准溶液，即10 克/ 大号（WTW d - 82362 魏尔海姆）和稀有脱钙ITC缓冲以制备的Ca 2+ 与溶液最终浓度为0.5 mM。
收集从样品bGCAP1 第ê CHELEX 列在一个管（提示：每次洗管从柱收集bGACP1样品，以避免可能来自管壁游离钙的任何污染前与脱钙缓冲液）。将小型磁力搅拌棒放入试管中，并对两个样品（Ca 2+ 和bGCAP1溶液）脱气至少10分钟。将脱气机温度设置为25°C，因为实验也在25°C下进行。除气器也是ITC系统的一部分，由ITC供应商提供。
参比液（ITC仪器内部的第二个腔，用于盛放水或缓冲液作为参比液）：将双蒸馏水注入新管中，并脱气10分钟。用加载注射器将水转移到参比池中（加载注射器仅用于将蛋白质溶液加载到样品池中，将水或缓冲液加载到参比池中）。注射器还随附ITC仪器（非常小心，避免在细胞中添加气泡）。

加载样本
将装有Ca 2+ 溶液的试管固定在ITC样品注射器下，并非常小心地加载样品（图5 B ）。有时样品架内会残留一些气泡。为避免气泡残留，请单击软件中的关闭端口按钮，并同时非常小心地拉动活塞。（这样可以节省样品并避免增加气泡）。点击清除和重新填充在软件TWIC按钮E要释放整个样本回至管，让它慢慢地重新载入。这个技巧可以消除所有小的气泡。
用水冲洗加样注射器，并从样品池中移走整个脱钙的ITC缓冲液，该缓冲液用于洗涤样品池。取下缓冲的装载注射器，并确保没有缓冲留在样品池。此时，请勿用任何东西接触加样注射器，并在脱气后用bGCAP1样品填充。将加载注射器针头插入样品池并缓慢释放样品。（提示：与加载样品的装载注射器可以很容易地产生小的空气。气泡会影响测量结果，以避免加载气泡的步骤如下：当样品是在样品贮器，负载回小体积，并释放具有短可见压力脉冲，以便其所有的气泡出现在顶部，然后除去第EM）。从样品池中取出所有多余的样品。

开始滴定实验
握住ITC样品注射器在一只手中并用脱钙ITC缓冲液洗涤其末端（该注射器尖端是内部的钙2+ 溶液，我们需要防止任何污染用Ca bGCAP1样品2+ 开始实验之前）。至少使用1毫升脱钙的ITC缓冲液清洗注射器头。然后，除去多余的缓冲液滴与周围的注射器尖端的Kimwipes 和注射器放置到样品池。
注意：请非常缓慢地进行操作，并注意不要用容易弯曲尖端的任何东西撞击尖端。

装入样品池后，取少量（几微升）的bGCAP1来检查最终蛋白质浓度，以防可能由于先前步骤而改变了最终蛋白质浓度（GCAP1样品可能会由于通过Chelex 柱而被稀释）。在开始实验之前，必须在软件中提及正确的蛋白质浓度，这一点很重要。
设置程序参数如下：
注射总数= 50

电池温度°C = 25

参考功率（µ cal / s）=理想值在3-10之间

细胞浓度（mM）= 0.02

注射器浓度（mM）= 0.5

进样量（µl）= 5

初始延迟（秒）= 210

进样空间时间（s）= 60

反馈模式/增益=高

搅拌速度（rmp ）= 307

有关ITC仪器的更多详细信息，请参见以下链接。

https://ctrstbio.org.uic.edu/manuals/vpitc_manual.pdf

测量参考实验
参考experime NTS所必需的数据ANALY SIS到更正件ECT 的一个通过稀释NY热变化。这些可能是由于将配体稀释到缓冲液中或将缓冲液注入大分子（bGCAP1）溶液而引起的，因此配体在缓冲液中的稀释更为显着，因为配体的浓度通常是大分子浓度的20倍。

将Ca 2+ 溶液以与上述相同的浓度（0.5 mM）装入ITC样品注射器中，并在样品池中装入（填充）脱钙的ITC缓冲液。记录配体注入缓冲液后稀释液的热变化。
将蛋白质溶液以相同浓度的bGCAP1（20 µM）加载到单个细胞中，然后将脱钙的缓冲液加载到注射器中。记录稀释液从缓冲液到大分子滴定液的热变化，如上所述。

数据分析

结合等温线以kcal /配体摩尔数归一化，并相对于大分子的摩尔比作图（Pierce 等，1999）。为了进行数据分析，请使用Malvern MicroCal 提供的Origin软件，并从计算机的相应驱动器上载实验文件和参考文件。实验等温线包含稀释热的变化，并且还从搅拌的热变化的贡献。为了校正稀释热，重要的是从实验等温线中减去参考等温线。为此，在记录两个实验文件时，所有浓度都必须相同。例如，当bGCAP1浓度为20 µM，Ca 2+ 为0.5 mM时，在参考实验中，Ca 2+ 必须为0.5 mM，并且样品池中必须含有相应的缓冲溶液（在检测时，细胞浓度为0。实验）。现在，将细胞浓度更改为bGCAP1的20 µM。从实验中减去参考文件，该文件将纠正由稀释引起的热变化。然后，根据与测量单元中存在的分子结合的配体数量，选择适合ITC结合等温线的拟合模型。根据实验和理论证据，一个GCAP分子可在EF手Ca 2+ 结合位点EF2，EF3和E F4上最多结合三个Ca 2+ 离子（Hwang 等，2004；Peshenko 等，2006；Dell 'Orco 等，2010）。选择顺序结合模型以拟合数据将为两个以上的结合位点提供拟合参数。人们可以尽可能多的选择NU MBER 在配体的作为似乎是恰当的顺序装订模式。Origin软件提供了另外两个拟合模型（一个位点模型和两个位点模型），这些模型不考虑配体的单个结合步骤之间的推定协同性。
通过应用选定的拟合模型来处理原始数据，将生成一个集成的绑定等温线，如图7 的下部所示。装订处理的两个参数可以被提取，焓变Δ H和平衡常数K 甲（或1 / K 甲= K d ，解离常数）。这些参数允许根据
ΔG= - RT 墨甲和ΔG=ΔH - TΔS

提供自由能（ΔG）和熵（ΔS）的值。R 是气体常数，T 是温度。

对于bGCAP1 3滴定系列都是perfor 上配有从一个VP-ITC MicroCal （Northhampton ，MA），以确定的Ca 2+ 结合亲和力。在没有Mg 2+的情况下进行测量。bGCAP1的热反应既放热又吸热。

D：\ Reformatting \ 2020-2-7 \ 1902844--1317 Karl-W。科赫744884 \ Figs jpg \ Figure 7.jpg

图7 。Ca 2 + - 与bGCAP1结合。使用20 µM bGCAP1进行ITC滴定。上图显示了注入Ca 2+后的热释放，如上所述。下图显示了整合的结合等温线，拟合了三个位点顺序结合模型，并绘制为增加bGCAP1浓度的函数（另请参见注释＃19）。曲线拟合后的数据分析得出了平衡常数K A ，由K A 得出的解离常数K D 和焓变（ΔH），均示于表1。

表1 。热力学参数的钙2+ -结合到牛GCAP1

bGCAP1 Ca 2+ 滴定（三位点顺序结合模型）

表观解离常数K D （nM ）

焓变ΔH（kcal / mol）

ķ d 1

ķ d 2

ķ d 3

ΔH 1

ΔH 2

ΔH 3

76

48

900

-8.4

6.4

0.6

评论

热释放被DETE 被Ca反恐执行局2+ -结合到bGCAP1既放热（负峰值）和吸热（正峰值）。这类似于Lim 等人的ITC研究。（2015 ），但是从与人类GCAP1观察最近ITC数据不同（图7A 中Peshenko 等人，2019 ），其中观察到偶尔小得多吸热反应发生强放热反应。然而，Peshenko 等人。（2019）将他们的Ca 2+ 结合数据拟合到顺序结合模型中，产生两个表观解离常数。他们用人类GCAP1中的高亲和力结合位点解释了他们的发现，该位点在他们的实验中（90-200 nM ）在残留的游离Ca 2+ 存在下被部分或全部占据。物种差异可能考虑不同的Ca 2+ -affinities ，其也观察到有用于斑马鱼GCAPs此前公布的数据相比于哺乳动物GCAP形式（图5 中Sulmann 等人，2015 ）。

可以通过相同的方案研究与Ca 2+ 结合蛋白的Mg 2+ 结合（参见例如Sulmann 等人，2015和Peshenko 等人，2019）。

笔记

缓冲液不匹配会导致重大的实验错误，通过过夜的蛋白质透析以及对系统进行广泛而仔细的清洗，可以最大程度地减少或避免这种错误。
缓冲液的选择对于ITC实验至关重要。有些缓冲区（例如，TRIS）显示出电离的大焓变。因此，测得的焓值是来自配体和大分子的复杂形成的焓加上缓冲剂电离的焓的组合。使用磷酸盐缓冲液或HEPES缓冲液进行初始实验。的磷酸钠缓冲液中的离子化焓显著小于Tris缓冲液（1千卡/摩尔VS 。11千卡/摩尔）（皮尔斯等人，1999）。
将透析膜在水中煮沸两次，以确保膜活化后除去EGTA。
白色混浊的Chelex 表示何时可以在再生过程中使用。
为了调节chelex 悬浮液的pH，最好从高摩尔浓度的HCl或NaOH开始。当pH约为6或8时，请使用摩尔浓度较低的溶液，例如1 M HCl或NaOH。
如果用过的和回收的PD10色谱柱的床（或平台）被堵塞，缓冲液的流动真的很慢，请在色谱柱内添加6 M尿素，然后静置几分钟。然后用水彻底清洗色谱柱，直到流量增加。
在ITC缓冲液脱钙过程中，将相同的50 ml两次通过相同的色谱柱以除去最大量的Ca 2+ 。
打开系统后不久，请务必将ITC恒温器的温度设置为25 °C ，然后再执行该过程的其他步骤以节省时间。有时需要很长时间才能达到所需温度。
在ITC系统的安装过程中，请带入三个塑料烧杯，分别是装有双蒸馏水的烧杯A，装有双蒸馏水的烧杯B 和用于废物处理的烧杯C。保留两个烧杯中的水的原因是，每次清洗系统时，先在烧杯A中清洗注射器，然后从烧杯B中取水清洗系统。这样的处理避免了脏颗粒污染系统。
从未关闭的，当它运行时系统，ITC注射器将立即释放所有的注射器溶液到所述样品池。如果出了什么问题，可以使用初始延迟来停止反应并重新开始。
加载样品时要非常小心气泡，这就是为什么对样品进行两次脱气有效的原因。气泡可能会使用较差的基线，并且还会影响参比池和样品池之间的反馈电路。不要太频繁地上下吹打蛋白质样品，因为这会产生气泡。
从蛋白质中去除Ca 2+ 时，将蛋白质两次传递至Chelex 柱可提高效率。
参比池可以装满ITC缓冲液，也可以装满没有大分子的水。水是一个理想的选择，因为参比池的清洁是一个主要问题，而且经常被忽略。二次蒸馏水带来的污染少得多。
加载在新鲜的缓冲液或者水的上参考单元一个每周当仪器处于持续使用。这是没有必要改变缓冲液或水在所述每个实验后的参考小区。
样品制备之前，请务必校准移液器，并一直使用的相同的吸管集。ITC实验对于任何浓度失配都非常敏感。
完成实验后，按照上述说明洗涤系统，然后将300 µl 100 ％甲醇（HPLC级）填充到样品池中。ç 失去的加注口的关闭系统前注射器。
为了获得从ITC测量S形曲线š 总是检查蛋白和配体的浓度的组合。注射器配体应为20倍大于在蛋白质样品越浓的样品池。以下方程式可用于设计实验。无单位的值Ç 可以在范围从1至1 ，000始终提高蛋白质浓度或减少的配体浓度，如果Ç 值约为1.高Ç 值促进所述的判定的缔合常数（K 一）（怀斯曼等等（1989）。

[M]是大分子的浓度

K a 决定了感兴趣的蛋白质和Ligang 的结合常数，如果已经知道或可以猜测的话;

n确定与大分子结合的配体的数量。

确定缔合常数（K a ）时，以高精度测量配体和大分子浓度非常重要。
使用Origin软件将数据拟合到顺序的结合位点是基于Fisher和Singh（1995）和《ITC数据分析-起源指南指南》第7版（0）（2004）（参考文献10）。简要地：

结合常数K 1 ，K 2 ，K 3 …。K n 定义为

[M]是大分子在活性细胞体积V 0中的自由浓度。

[X]是配体的自由浓度。

具有n个键合配体的总大分子F n 的分数为

其中P定义为

第n 次注入后吸收或放出的热量为

M t 是大分子的体积浓度。

菜谱

阴离子交换色谱缓冲液A
20 mM Tris / HCl
2 mM EGTA
1 mM DTT
pH 7.5
阴离子交换色谱缓冲液B
20 mM Tris / HCl
2 mM EGTA
1 M NaCl
1 mM DTT
pH 7.5
体积排阻色谱缓冲液
20 mM Tris / HCl
2 mM EGTA
150 mM NaCl
1 mM DTT
pH 7.5
ITC缓冲液
20 mM HEPES
60 mM KCl
4 mM NaCl
pH 7.4 （用1 M或0.1 M KOH调节）

致谢

感谢德国的学术交流计划（DAAD）和德国的Forschungsgemeinschaft （DFG，授权号GRK1885）的财政支持。该协议是根据先前的工作进行修改的（Sulmann 等，2015; Peshenko 等，2019）。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

伦理

根据类别S1的安全规定对重组蛋白进行了实验。

参考文献

S.Abbas，V.Marino ，D.Dell'Orco和KW Koch（2019）。视紫红质激酶GRK1和recoverin的分子识别是通过切换内部和分子间静电相互作用来调节的。生物化学58（43）：4374-4385。
MM，布拉德福德（1976）。利用蛋白质-染料结合原理，快速而灵敏的定量蛋白质微克量的方法。肛门生物化学72：248-254。
Beccia ，MR，Sauge- Merle，S.，Lemaire，D.，Bremond，N.，Pardoux ，R.，Blangy ，S.，Guilbaud ，P.和Berthomieu ，C.（2015）。钙结合钙调蛋白N末端域的热力学，以评估位点特异性亲和常数和协同作用。Ĵ生物化学Inorg 化学20（5）：905-919。
Dell'Orco ，D.，Muller，M. and Koch，KW（2010）。通过表面等离振子共振定量检测钙传感器蛋白中的构象转变。Chem Commun （Camb ）46（39）：7316-7318。
Elbers，D.，Scholten，A.和KW，KW（2018）。斑马鱼Recoveryin亚型显示钙转换机制的差异。前沿摩尔神经科学11：355。
Fisher，HF和Singh，N。（1995年）。量热法用于解释蛋白质-配体相互作用。方法酶学方法259：194-221。
加西亚- 埃尔南德斯，E.，Zubillaga ，RA，Chavelas-亚当，EA，V á zquez-Contreras的，E.，罗霍-Dominguez，A。和科斯塔斯，M.（2003）。蛋白质与碳水化合物相互作用的结构能：从溶菌酶与其天然糖类抑制剂结合的研究中得出的见解。蛋白质科学12（1）：135-142。
Hwang，JY和Koch，KW（2002）。的豆蔻酰化的神经元的Ca 2+ -传感器鸟苷酸环化酶激活蛋白1和2。生物化学生物生物物理学ACTA 1600（1-2）：111-117。
Hwang，JY，Schlesinger，R.和Koch，KW（2004）。鸟苷酸环化酶激活蛋白1突变体的不规则二聚化导致靶标激活丢失。Eur J Biochem 271（18）：3785-3793。
《 ITC起源中的数据分析– 教程指南，版本7.0（2004）》。
Koch ，KW和Helten，A。（2008）。小伙子图6：感光细胞和视网膜中基于鸟苷酸环化酶的信号传导。在：视网膜中的信号传导。Fliesler ，SJ和Kisselev ，OG（编辑）。泰勒和弗朗西斯·CRC出版社，纽约州北托纳旺达。121-143。
Kozlov，AG和Lohman，TM（2012）。使用等温滴定量热法将SSB与ssDNA结合。方法分子生物学922：37-54。
Li，C.，Lim，S.，Braunewell ，KH和Ames，JB（2016）。结构和钙结合神经元的钙性能肉豆蔻开关蛋白，visinin 样蛋白3.公共科学图书馆的一个11（11）：e0165921。
Lim，S.，Peshenko ，I.，Dizhoor ，A.和Ames，JB（2009）。Ca 2 + ，Mg 2+ 和肉豆蔻酰化对鸟苷酸环化酶激活蛋白1结构和稳定性的影响。生物化学48（5）：850-862。
Linse ，S。（2002）。通过与发色螯合剂竞争研究钙与蛋白质的结合。方法分子生物学173：15-24。
Marino，V.，Scholten，A.，Koch，KW和Dell'Orco ，D.（2015年）。具有独特分子特性的GUCA1A中的两个视网膜营养不良相关的错义突变导致视网膜鸟苷酸环化酶的异常调节类似。哼哼Mol Genet 24（23）：6653-6666。
Marino，V.，Dal Cortivo ，G.，Oppici ，E.，马耳他，PE，D'Esposito ，F.，Manara ，E.，Ziccardi ，L.，Falsini ，B.，Magli ，A.，Bertelli ，M 。和Dell'Orco ，D.（2018）。GUCA1A中的新型p。（Glu111Val）错义突变与视锥细胞营养不良相关，导致钙受体受损，光感受器第二信使稳态受到干扰。哼哼Mol Genet 27（24）：4204-4217。
Mazzei，L.，Ciurli ，S.和Zambelli ，B.（2014）。热生物催化：等温滴定量热法表征酶促反应。Ĵ显示精通（86）。Doi：10.3791 / 51487。
佩斯，NC和施密德，FX（1997）。如何确定蛋白质的摩尔吸光系数。在：蛋白质结构–一种激活方法（第二版）中。Creighton，T 。E. （E d。）。牛津大学出版社，第253-259页。
佩申科，IV和迪佐尔，上午（2006）。GCAP-1的Ca 2+ 和Mg 2+ 结合特性。Mg 2+ 结合形式是光感受器鸟苷酸环化酶的生理激活剂的证据。生物化学杂志281（33）：23830-23841。
佩申科（Peshenko），IV，奇德恰恩（Cideciyan），AV，Sumaroka ，A.，Olshevskaya ，EV，Scholten，A.，Abbas，S.，Koch，KW，Jacobson，SG和Dizhoor ，AM（2019）。钙传感器蛋白GCAP1中的G86R突变会改变视网膜鸟苷基环化酶的调节并引起显性锥棒变性。生物化学杂志294（10）：3476-3488。
皮尔斯，MM，拉曼，CS和纳尔，BT（1999）。蛋白质相互作用的等温滴定热法。方法19（2）：213-221。
Sulmann，S.，Vocke，F.，Scholten，A.和Koch，KW（2015）。斑马鱼中的视网膜特异性GCAPs 通过肉豆蔻酰化和Mg 2+ 结合获得Ca 2+ 感知的功能选择性。科学代表5：11228。
Tsien ，RY（1980）。对镁和质子具有高选择性的新型钙指示剂和缓冲剂：原型结构的设计，合成和性能。生物化学19（11）：2396-2404。
Tsvetkov ，PO，罗马，AY，Baksheeva ，VE，Nazipova ，AA，Shevelyova ，MP，Vladimirov ，VI，Buyanova ，MF，Zinchenko ，DV，Zamyatnin ，AA，Jr.，Devred ，F.，Golovin ，AV，Permyakov ， SE and Zernii ，EY（2018）。锌结合调节神经元钙传感器1的功能状态。前沿分子神经科学11：459。
Vocke ，F.，Weisschuh ，N.，Marino，V.，Malfatti，S.，Jacobson，SG，Reiff ，CM，Dell'Orco ，D.和Koch，KW（2017）。钙传感器GCAP1中与黄斑营养不良相关的突变导致感光器中cGMP 信号功能异常。哼哼Mol Genet 26（1）：133-144。
Ward，WH和Holdgate ，GA（2001）。等温滴定量热法在药物发现中的应用。Prog Med Chem 38：309-376。
Wiseman，T.，Williston，S.，Brandts ，JF和Lin，LN（1989）。使用新的滴定热量计快速测量结合常数和结合热。肛门生物化学179（1）：131-137。
Weber，PC和Salemme ，FR（2003）。量热法在药物发现和蛋白质相互作用研究中的应用。Curr Opin Struct Biol 13（1）：115-121。