材料和试剂

24 - 孔细胞培养板（Corning公司，Costar公司，目录号：9761146）
100 mm细胞培养板（Corning，目录号：08-772-22）
15 ml 锥形离心管（Falcon，目录号：14-959-49D）
100％CO 2 储罐
DMEM（Lonza ，BioWhittaker ，目录号：BW12-604F）
热灭活的FBS（Corning，目录号：35011CV）
100x抗生素-抗真菌药（Gibco，目录号：15240-062）
注意：Thi s是可选的，我们以此作为防止细胞培养中细菌和真菌污染的额外保证，对于某些细胞系，这可能会阻碍细胞生长。

100x丙酮酸钠（Gibco，目录号：11360-070）
I型胶原蛋白，3 mg / ml （Gibco，目录号：A1048301）
胰蛋白酶（Lonza，Trypsin- Versene ，目录号：BW17161E）
PBS （Lonza ，BioWhittaker ，目录号：BW17516F）
MDA-MB-231（ATCC，目录号：CRM-HTB-26）
DMEM S + 介质（请参阅食谱）
胶原蛋白（10μg / ml）（请参阅食谱）

配套设备

血细胞计数器
活细胞成像环境室（Tokai Hit活细胞环境室）
离心（未冷藏）的15毫升试管（Sorvall ，Legend RT，SO-LEGRT）
细胞培养箱设置为37 °C和5％CO 2
水浴或干浴温度设置为37°C（Boekel Scientific，小型水浴，290100）
具有自动镜台控制的显微镜（具有Prior Scientific电动雄鹿的Olympus IX71反相）（图1）
显微镜用相机（滨松）
10倍物镜（奥林巴斯）

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图1. 使用Olympus IX71倒置显微镜，先前的机械化工作台和Tokai Hit环境室进行细胞跟踪的完整设置示例

软体类

与显微镜兼容的用于延时图像采集的软件（奥林巴斯，cellSens）
斐济ImageJ（https://fiji.sc/）
微软Excel

程序

细胞培养
将DMEM S +介质预热到37°C。
将MDA-MB-231细胞解冻至37°C。
将1 ml解冻的MDA-MB-231细胞转移至3 ml DMEM S +培养基中，并以300 xg 离心（适当平衡）3分钟。
吸出10 ml DMEM S +中的MDA-MB-231细胞中的鸡并重悬细胞，然后在10 cm的培养皿中平板接种。
在37°C和5％CO 2 下孵育细胞，直到70％融合（2-3天）。

单细胞迁移测定
将DMEM S +培养基，胰蛋白酶和PBS预热至37°C。
24大衣-好板带10MYU ģ / ml的I型胶原溶液（100 Myueru ）1个小时在室温和洗涤用PBS（PBS假中公以防止干燥）。
从MDA -MB -231细胞培养皿中吸出培养基。
用PBS和吸出PBS洗涤细胞。
加入1 ml的胰蛋白酶，并在37°C和5％CO 2中孵育5分钟。
用3 ml DMEM S + 提取经胰蛋白酶处理的细胞，并以300 x g的适当平衡离心3分钟。
吸出民意调查和重悬细胞在4毫升的DMEM S +。
10取MYU 大号细胞悬浮液，液吸入血球。
计数细胞。
PBS关胶原吸涂24 - 孔板。
通过颠倒几次试管或移液再次重悬细胞悬液。
将20,000个细胞置于24孔中，并在37°C和5％CO 2 下附着过夜。
活细胞成像允许环境商会热身在显微镜台上空24 - 孔板至少1 小时，下平衡显微镜温度。
空盘替换为细胞镀24 - 好吧，让平衡1 H.
用5-10 s的ingle单元（不触摸其他单元）选择多个场，并使用相衬将延时成像设置为每分钟1帧2 h。
启动延时成像并保存文件。

资料分析

如果将字段另存为单个图像（即每个时间点每个字段1个图像），请在斐济上导入图像序列以构建一个字段中所有图像的蒙太奇。如果将字段另存为单个文件（即每个字段1个文件）），直接在斐济打开。
播放电影并确定不与其他单元格接触或移出视场的单元格（尝试识别每个视场5-10个或更多单元格）。有关移动单元格的示例，请参见视频1。

C：\ Users \ Bio-Dandan \ Dropbox \ Refomatting \ 2020-4-20 \ 3586--1902750--1320 David Gau 782084 \ video 1.jpg

视频1.图2中的细胞迁移示例视频

候选细胞具有一旦被确定，打开手动跟踪插件斐济（图茜2 A，A窗口应该开）。
点击“添加轨道”（图2 B）。
开始单击单元格的质心（单元格的中心）并继续跟踪，直到已跟踪所有120帧（图2 C）。请注意，数据将添加到新窗口中（图2 D）。
单击“结束跟踪”，然后关闭手动跟踪窗口（图2 E）。

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FIGUR ê 2 。工作流程手动跟踪使用斐济。一。选择手动跟踪在插件; B 。点击添加轨道。Ç 。开始跟踪小区（连续按质心细胞，例如，如图所示的白色箭头。请注意，这是蝌蚪细胞在一起，就像那些在中间这个小组不应该被用于跟踪。d 。跟踪信息将产生通过ImageJ的。ê 。点击结束轨迹跟踪时完成。

保存结果窗口，其中每帧包含单元质心的X，Y坐标。
重复步骤3-7，直到所有单元格都已量化，然后进入下一个字段。
所有的细胞，一旦领域都得到了量化，打开Excel和粘贴X ，Y 坐标（图3 A）。
确定距离专程从点到点通过使用距离公式下面其中X 1 和Y 1 是当前轨道位置和X 2 和Y 2 是下轨位置。求d对于每个跟踪点（图茜3 B，将有是121个跟踪点，因为没有第一个跟踪点的先前点，您将最终得到d）的120个计算。

D：\重新格式化\ 2020-2-7 \ 1902750--1320 David Gau 782084 \图jpg \ 2.jpg

图3 ，使用Excel例数据分析的一个。复制在X和Y坐标从细胞跟踪到Excel中，阵容并排侧履带; B每一个细胞。在单独的一个部分，使用距离公式来计算距离旅行按单元格从点1到点2，点2到点3，点3到点4，依此类推。突出显示所用Excel函数的示例。

将每个像元所经过的所有距离相加并除以120（这是影片的持续时间（以分钟为单位，也是每个场的帧数））。
对所有单元格重复步骤10和11。
总结所需的细胞速度并进行适当的统计分析（t 检验2组，ANOVA进行事后分析> 2组）。
使用首选图表（即条形图，箱须图，散点图）绘制汇总信息。图4中显示了箱须图的示例。

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Figu 重4 。例子的速度结果绘制成盒和胡须图表使用Excel中。G1，G2，G3是通用的组名。蓝星代表均值和绿条表示的位数的数据。

菜谱

DMEM S +媒体
500毫升DMEM

50毫升FBS

5毫升100 x抗生素-抗真菌药

5毫升100x丙酮酸钠

胶原（10 MYU ģ / ml）的
10毫升DMEM

166.6 MYU 大号胶原I 3 毫克/毫升

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院（PR）的资助（2R01CA108607）。David Gau得到了美国国家科学基金会的博士前研究金（2012139050）和NIH心血管生物工程博士前研究资助（SG的2T32HL076124）的支持。。

竞争利益

作者没有竞争利益要报告。

参考文献

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