材料和试剂

抗体
1. 大鼠抗小鼠CXCR5-生物素（BD Biosciences，Pharmingen TM，目录号：551960）
2. 山羊抗大鼠IgG-生物素（BD Biosciences，Pharmingen TM，目录号：554014）
3. 链霉亲和素-PE Cy7（BD Biosciences，Pharmingen TM，目录号：557598）
4. 大鼠抗小鼠B220-太平洋蓝450（eBioscience，目录号：48-0452-82）
5. 大鼠抗小鼠CD11b-太平洋蓝450（eBioscience，目录号：48-0112-82）
6. 大鼠抗小鼠CD4-APC eFluor 780（eBioscience，目录号：47-0042-82）
7. 仓鼠抗小鼠PD-1-PE（eBioscience，目录号：12-9985-82）
8. 小鼠Fc嵌段（BD Biosciences，Pharmingen TM，目录号：553141）
其他材料
1. 源自鼠脾样品的单细胞悬浮液
2. 胎牛血清（FBS）（Hyclone）
3. Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）（Life Technologies，Invitrogen TM）
4. 氯化铵（0.17M，过滤，高压灭菌）（pH7.4）
5. DAPI核酸染色（Life Technologies，Invitrogen TM）
6. FACS缓冲区（参见配方）

设备

BD LSR II流式细胞仪
圆锥管（Corning）

程序

收获脾脏，通过用5ml的DMEM中的一对显微镜载玻片的磨砂表面轻轻地捣碎脾脏片段来产生单细胞悬浮液。
转移细胞到50毫升锥形管，并在300 RCF下旋转5分钟在4℃的细胞。
弃去上清液，不要打扰沉淀。
用5ml 0.17M氯化铵重悬细胞，并将细胞在冰上保持5分钟
加入15毫升DMEM的细胞，并在300 RCF在4℃下旋转5分钟
弃去上清液并用20ml DMEM重悬细胞并计数细胞
在FACS缓冲液中，在50μl的1:200Fc块中重悬2百万个脾细胞，并在冰上孵育30分钟。
用200μlPBS洗涤细胞，并在300 RCF下，在4℃下旋转5分钟
弃去上清液，并用30μl抗小鼠CXCR5-生物素（在FACS缓冲液中1:50）重悬细胞，并在冰上孵育30分钟。
用200μlPBS洗涤细胞，并在300 RCF下，在4℃下旋转细胞5分钟
弃去上清液，并用30ul抗大鼠IgG-生物素（在FACS缓冲液中1:50）重悬细胞，并在冰上孵育30分钟。
用200μlPBS洗涤细胞，并在300 RCF下，在4℃下旋转细胞5分钟
弃去上清液并用30μl抗体3-7的混合物（在FACS缓冲液中1:50）重悬细胞并在冰上孵育30分钟。
用200μlPBS洗涤细胞，并在300 RCF下，在4℃下旋转细胞5分钟
重悬细胞在400微升DAPI（3微米在PBS中），并使用BD LSR II流式细胞仪分析细胞。

门控策略

在淋巴细胞门上的门
门对淋巴细胞门内的CD4阳性群体
从CD4阳性门中排除B220和CD11b阳性细胞
基于CXCR5和PD-1表达的Tfh群体的门控

食谱

FACS缓冲区
3％胎牛血清的PBS溶液中

致谢

该方案在Anne Davidson博士在Feinstein Institute for Medical Research，NY，USA的实验室中开发或修改。这项工作得到NY SLE基金会（RB），Rheuminations，NIH AI082037和AR 049938-01，NIH（PO1 AI51392和PO1 AI51392的流式细胞术和蛋白质表达和四聚体核）的赠予的支持。

参考文献

Liu，Z.，Bethunaickan，R.，Huang，W.，Lodhi，U.，Solano，I.，Madaio，M.P.and Davidson，A。（2011）。干扰素-α以T细胞依赖的方式加速小鼠系统性红斑狼疮。 arthritis Rheum 63（1）：219-229。
Ramanujam，M.，Wang，X.，Huang，W.，Liu，Z.，Schiffer，L.，Tao，H.，Frank，D.，Rice，J.，Diamond，B.，Yu，KO，Porcelli ，S.and Davidson，A。（2006）。鼠科SLE中选择性和非选择性BAFF阻断之间的相似性和差异。 Clin Invest 116（3）：724-734