材料和试剂

1. T-25培养瓶（Corning ，目录号：353109 ）。

2. 6 - 孔培养板（Corning公司，Costar公司，目录号：3516 ）

3. 96 - 孔平文化板（Corning ，Costar公司，目录号：3595）

4. Falco n 圆底聚丙烯14 ml管（Corning ，目录号：352059）

5. 1.5 mL Eppendorf管

6. 35毫米的培养皿中（Falcon ，目录号：351008）

7. 15毫米的培养皿

8. 3毫升注射器（BD ，目录号：309657）

9. 5毫升注射器

10. 18 G针（BD ，目录号：305185）

11. 10 Myueru 吸头

12. 瓶口过滤系统（0.22 MYU 中号孔径）

13. C57BL / 6男女

14. Arufa -MEM（粉末）（g ^ IBCO，目录号：11900-024）

15. 胎牛血清

注意：我们使用亚特兰大生物公司的FBS作为出版物，但是我们总是从5-10个测试FBS样品中进行批次检查，以找到最适合OP9维护文化的FBS。我们通常购买20瓶以保持2次相同的实验-3年。

16. 新鲜的Milli-Q水

17. PBS（Fisher Scientific，目录号：BP665-1）

18. 2-巯基乙醇（Fisher Scientific ，目录号：O3446I-100）

19.500 mM EDTA pH 8.0

20. IMDM（ģ IBCO ，目录号：12440061）

21. 肝素（Sigma ，目录号：H3149-100KU）

22. 内皮促分裂原50的Mg （生物医学科技，产品目录编号：BT-203）

23. 青霉素-链霉素10,000 U-10,000 µg / ml（G ibco，目录号：15140122）

24. X-VIVO 20（Lonza ，目录号：04-448Q）

25. 甲基纤维素的基础培养基小鼠前B淋巴样祖细胞（ Stemcell Technologies ，Methocult TM ，目录号：M3630 ）。

26. 重组鼠IL-7（Peprotech ，目录号：217-17）

27. 重组鼠Flt3- 配体（Peprotech ，目录号：250-31L）

28. 0.05％胰蛋白酶/ EDTA（Gibco公司，目录编号：25300054）

29. 0.25 Pasento I型胶原酶（干细胞技术，目录号：07902）

30. DNase I溶液（1mg / ml）（Stemcell Technologies ，目录号：07900）

31. 细胞解离缓冲液（汉克平衡）（Gibco ，目录号：13150-016）

32. 用于分类和检测B细胞集落的抗体（表1）

表1.流式细胞仪的抗体清单

名称

克隆

色泽

公司介绍

货号

CD144（VE-Cad）

11D4.1

亚历克斯面粉

蓝光

562242

CD201（EPCR）

eBio1560

聚乙烯

电子生物科学

12-2012-82

CD45

30-F11

FITC

电子生物科学

11-0451-82

Ter119

Ter119

PerCP-Cy5.5

生物传奇

116228

CD11b（Mac1）

M1 / 70

ACP-Cy7

生物传奇

101226

CD93（AA4.1）

AA4.1

装甲运兵车

生物传奇

136510

CD19

1D3

聚乙烯

生物传奇

152408

B220

RA3-6B2

PE-Cy7

生物传奇

103222

33. OP9 基质细胞（从Shin-Ichi Nishikawa博士（从日本神户市理研退休）获得，可以从ATCC CRL-2749获得（理想情况下<30代）]

34. 表达Akt的AGM-EC（AGM-EC）：建立了从小鼠胚胎的主动脉-中肾（AGM）区域获得的内皮细胞（EC），并由Fredon Hutchinson Cancer的Brandon Hadland博士诱导了Akt的过表达中心，美国西雅图）（Hadland 等，2015 ）。

35. 猪皮明胶（Sigma，目录号：G1890）

36. Arufa -MEM （见配方）

37. 2-巯基乙醇（2-ME）存量（0.1 M）（请参阅食谱）

38. OP9维护介质（α-MEM+ 20％FBS）（请参阅食谱）

39. AGM-EC维护介质（请参阅食谱）

40. 分化培养基（α-MEM+ 10％FBS + 5 x 10 -5 M 2ME）（请参阅食谱）

41. 染色缓冲液（PBS + 5个％FBS + 2mM EDTA）中（见配方）

42.0.1 ％明胶（请参阅食谱）

配套设备

P1000移液器
微量离心机
FACS分选仪和分析仪需要超过6个荧光探测器。 BD FACS Aria用于细胞分选，BD LSRII和BD LSR- Fortessa 用于分析
标准细胞培养CO 2 培养箱（CO 2 ：5％，O 2 ：20％）

程序

维持OP9基质细胞和AGM-EC基质细胞

维持OP9基质细胞

维持OP9基质细胞处于良好状态是获得成功结果的重要关键。每月从粉末中制成新鲜的OP9维持培养基。测试许多FBS以使OP9细胞良好生长。
用新鲜制得的OP9培养基将T25烧瓶中的OP9解冻，每3天，1：3分开。
注意事项：

细胞OP9扁圆形或方形的形状（图1）我˚F他们成为纺锤形，他们不擅长OP9了，因为梭形细胞往往是改造和丢失的B细胞保障能力。

D：\重新格式化\ 2020-3-2 \ 1902983--1369吉本桃子802297 \图jpg \图1.jpg

1.形态学图OP9细胞（100的X ）。红色箭头表示良好OP9和蓝色箭头表示为OP9。量表乙氩= 100 MYU 中号。

每3天将它们在T25烧瓶中融合的OP9分成3个烧瓶，如果3天内没有融合，则大量的FBS对它们不利。
OP9的密度必须合适（起始点约为4 x 10 5 / T25烧瓶）。当OP9细胞在T25烧瓶中融合时，细胞数约为1.0 x 10 6 -1.5 x 10 6 。
为了分裂，使用吸气培养基，用PBS洗涤2次，然后在37℃下用0.05％胰蛋白酶/ EDTA处理3分钟。 °C。将OP9细胞从烧瓶中剥离，并加入培养基和移液器，用5 ml血清移液器（重要）制成单细胞悬液。确保移液和单细胞良好，因为留下细胞团可能会诱发OP9的不良状况细胞在后来的通道。旋400 XG 为5 敏，吸取上清液，松开颗粒通过点击底部的管（重要），加1 毫升OP9维持培养基吸取非常好，P 1000吸管确保单细胞悬液。加入更多OP9培养基，将其放入3 x T25烧瓶中。
OP9必须在3天之内（通常每3天）进行维护。即使它们在3天内未汇合，也应通过（1比1或1比2以增加细胞密度）。，它们可以用于共培养，但不会再扩展。
如果OP9细胞状态不佳，则很难从胚胎的早期阶段获得B细胞（
OP9细胞不应维持超过1个月。
OP9细胞显示出良好的接触抑制作用，如果需要照射以阻止OP9的过度细胞生长，它们已经被转化，不再是优质的OP9。

维持AGM-EC基质细胞

涂0.1％明胶T25烧瓶30分钟以上。
在铺板细胞之前吸出明胶。
在AGM-EC维持培养基（5 x 10 5 / 瓶）中，用明胶包被的T25烧瓶解冻AGM-EC 。每3-4天以1-3：1的速度通过（Hadland 等，2015 ）。

收获胚胎组织
建立定时交配的C57BL / 从，女6直男3后：00 .. PM以下一些早期上午，检查阴道塞的女性和独立堵塞的女性成不同的笼子中午这一天被认为是胚胎（E）0.5天。
在收获胚胎前约7天，将OP9和AGM-ECs融化在T25烧瓶中并保持。
收获胚胎前一天，将准备OP9（1 X 10 4 /孔）和AGM-ECS（5 X 10 3 / 96孔）- 。孔板分别另外,,在T25保维护OP9烧瓶中的根据需要在镀敷甲基纤维素5-7天后。
定时交配十天后（在E10.5），从怀孕的母亲那里收获胚胎（按照您所在机构批准的AICUC协议中的步骤进行操作）（Morgan 等人，2008年）。
在立体显微镜下，打开子宫，从胚胎中分离卵黄囊（YS）（Morgan et al。，2008 ）。去除YS后，通过计数so体对来确认胚胎阶段，收集包含AGM区的一半胚胎的尾部。 14 毫升试管充满10毫升培养基。
的AGM组织离心机于培养基450 XG 5分钟，吸去上清液。挂起的AGM组织在0.25 Pasento I型胶原酶Tasu DNA酶I（最终20 Myug / ml）的分别[ 使用0.5-1毫升，每胚当量（的Ee ）] 。
将组织悬浮液在37 °C下孵育。每5分钟用移液管吸取并在显微镜下确认解离。一旦看到良好的单细胞，可通过添加相同体积的细胞解离缓冲液停止胶原酶反应。正常情况下，此孵育需要15-30分钟，具体取决于胚胎的年龄（胚胎越早，孵化时间越短）。
添加分化培养基并使用70μm滤网过滤，并以450 xg离心5分钟。
吸出克隆，将单细胞沉淀物悬浮在1 ml染色缓冲液中，并计数细胞数量，每只胚胎大约收集5 x 10 5个细胞。

HEC / HSC之前的分类和共培养
在检查HECs / HSC前的B淋巴造血潜能时，直接从这些细胞中检测B祖细胞集落形成能力具有挑战性，因为它们大多数是内皮表型。为了诱导造血祖细胞，请对HECs / pre进行分类-HSC并将它们接种在OP9（扩增的造血祖细胞）或AGM-EC上（让HSC之前的成熟成熟为HSC）。

染色和细胞分选

在1.5 ml Eppendorf管中的100μl染色缓冲液中悬浮多达1 x 10 7个细胞，首先取5％的体积用于阴性对照和FMO染色。
抗体添加;抗-小鼠CD45，CD144，C-KIT，EPCR（CD201）和TER119在的比率0.3 MYU L / 10 6 细胞，并培育他们30分钟冰上。
加入1 ml染色缓冲液进行洗涤，然后在微型离心机上以800 xg 的速度离心2分钟。
将细胞在挂起染色缓冲液和排序TER119 - CD144 Tasu 的c-kit Tasu EPCR Tasu 细胞在FACS 咏叹调（图茜2）。
（可选）将分选的Ter119 - CD144 + c-kit + EPCR + 细胞与1 x 10 5个OP9细胞在Methocult中与IL-7和Flt3-配体混合，然后将其铺在35 mm培养皿中，但是直接将其铺板细胞将仅产生少数B细胞集落。
100-200 TER119板- CD144 Tasu 的c-kit Tasu EPCR Tasu 细胞以一个井96 - 孔板汇合随着OP9在分化培养基中或AGM-EC细胞在X-20体内和增IL-7和FLT3-配体（最终浓度：两者均为10 ng / ml）。
共培养五至七天后，收获所有细胞并用抗小鼠CD45和CD11b抗体对其染色。
染色后，将细胞用染色缓冲液洗涤，并悬浮在染色缓冲液中，并从FACSAria 上的共培养细胞中分选出CD11b - CD45 + 细胞，如图2B 所示。

D：\重新格式化\ 2020-3-2 \ 1902983--1369吉本桃子802297 \图jpg \图2.jpg

2.门控STRA图Tegy用于分拣预造血干细胞（A）和CD45 Tasu CD11b的- 细胞船尾铒共培养AGM-EC的（B）

电镀半固态培养
在室温或4° C 过夜融化Methocu lt 。
始终准备N + 1个样品用于甲基纤维素测定。与1 x 10 5个OP9 细胞/ 培养皿共培养后混合200-600个CD45 + 细胞;一式三份，混合800-2个，400个CD45 + 细胞和4个10 5个OP9细胞将其倒入14 ml的圆底管中并旋转，吸出培养基，并通过敲打管使细胞沉淀松散。使用5 ml注射器和18 G针将4 ml Methocult M3630添加到细胞沉淀中（这样，您可以铺200 -35个培养皿中每600个CD45 + 细胞具有1 x 10 5个OP9细胞。）在这种规模下，预计每个培养皿将有20-80个菌落。
加入IL-7（最终10 ng / ml）和Flit3-配体（最终10 ng / ml），涡旋混合均匀，直至所有气泡消失。
使用18 ml针和3 ml注射器，将1.1 ml含细胞的甲基纤维素培养基（含细胞）倒入每个35 mm培养皿x 3个皿中。
3个将P ETRI菜含有METHOCULT和1个培养皿含有无菌ħ 2 O（防止该干燥出的介质）在一个15毫米的培养皿。
他们在一个孵育5 Pasento CO 2 培养箱中培养8-11天数和计数集落数。该照片在图茜3代表B细胞集落及其FACS分析。

D：\重新格式化\ 2020-3-2 \ 1902983--1369吉本桃子802297 \图jpg \图3.jpg

拾取保持的菌落。3. B细胞图菌落和FACS分析阿。B-1祖细胞（B-1-pro）的菌落。乙。B-2祖细胞（B-2-pro）的集落，在确认通过FACS分析下面。量表乙氩= 200 MYU M.C。。FACS分析的每个捡起菌落。基于所述门控BM B-2祖细胞，同门控被施加到分析每个样品的。

确定每个B-1或B-2祖细胞的菌落
在无菌的Eppendorf管中准备10μl 移液管和1 ml分化培养基，对于收集的菌落，准备1.5 ml含1 ml染色缓冲液的Eppendorf管，准备与菌落数相同的试管数。
收集菌落前，用移液器吸几次以分化培养基浸湿10μl 移液器吸头，以避免甲基纤维素粘在移液器吸头内部。设置8μl 吸取菌落。在显微镜下，用吸管吸取每个菌落用湿尖端吸取10μl移液器，并将每个菌落转移至含有染色缓冲液的1.5 ml管中。
将所有菌落收集到每个试管中后，将试管在微型离心机中以800 xg离心2分钟，然后吸出上清液。
加入50μl染色缓冲液并涡旋以使沉淀物成为单细胞悬浮液。
它们与抗体染色：抗小鼠AA4.1-APC，CD19-PE，B220-PEcy7和Mac1的-FITC在的比率0.3 MYU L / 10 6 细胞20-30分钟冰上。
用1 ml染色缓冲液洗涤，并以800 xg离心2分钟。
吸出悬浮液，并用PI或DAPI染色缓冲液悬浮细胞沉淀以排除死细胞，然后将样品应用于流式细胞仪。
确定菌落中是否含有B-1和/或B-2祖细胞（图3 ）（Kobayashi 等人，2019 ）准备成年BM细胞作为门控B祖细胞的阳性对照（Montecino-Rodriguez 等人， 2006年）。

资料分析

数据分析和预期结果

根据流式细胞仪分析，每个培养皿应包含1）仅B-1祖细胞，2）仅B-2祖细胞和3）B-1和B-2祖细胞。每板B-2或B-1和B-2祖细胞，并计算三个培养皿的结果的平均值和SD值。

通常，BM祖细胞仅预期B-2菌落.B-1祖细胞菌落是与OP9共培养的胚胎组织的显性，而B-1 + B-2祖细胞菌落在这些胚胎组织的共培养中则占优势。带有AGM-EC或培养的器官（发展为HSC）（Kobayashi 等，2019 ）。

注意事项

AGM-EC可以支持pre-HSC过渡到HSC，但是当它们在甲基纤维素培养物中一起铺板时，它们不支持B细胞集落形成。
B细胞集落形成细胞的数量取决于胚胎的年龄和OP9的状况。
Ter119 - CD144 + c-kit + EPCR + 细胞非常罕见，因此，Ter119 - CD144 + c-kit + 也应该能够在OP9的支持下产生B细胞集落。
请勿在共培养或甲基纤维素培养中添加SCF。良好的OP9支持不含SCF的B淋巴细胞生成，SCF可能会增强巨噬细胞分化。

菜谱

培养基：

阿尔法-MEM（具有青霉素/链霉菌CI Ñ50 ü - 50 亩克/ 毫升）
将粉末α -MEM 添加到1,000 ml 新鲜的Milli-Q水中，搅拌直至完全溶解
加入2.2 g H 2 CO 3 并搅拌直至完全溶解
加入5 毫升青霉素-链霉素
使用0.22过滤MYU 中号过滤系统
2-巯基乙醇（2-ME）库存（0.1 M）
70混合Myueru 2- ME至10ml Arufa -MEM和过滤使用0.22 MYU 中号针筒过滤器

OP9维护介质（α-MEM+ 20％FBS）
400毫升混合的α -MEM和100ml FBS和过滤用0.22 微米中号过滤系统

AGM-EC维护介质
IMDM 400 毫升

FBS（Hyclone，热灭活）100毫升

钢笔/链球菌（100 x ）5 毫升

肝素5毫升（在IMDM中新鲜制备的10毫克/毫升储备液）

L-谷氨酰胺（100 x ）5毫升

内皮细胞有丝分裂原50毫克

D 溶解在10毫升上述培养基混合物中
˚F ILTER使用0.22 MYU 中号过滤系统
分化培养基（α -MEM + 10％FBS + 5 x 10 -5 M 2 - ME）
450毫升α -MEM

50毫升FBS

250 Myueru 0.1 M 2 - ME

˚F ILTER使用0.22 MYU 中号过滤系统

染色缓冲液（PBS + 5％FBS + 2 mM EDTA）
500毫升PBS 500 毫升

2.5 ml FBS + EDTA（最终2 mM ）

˚F ILTER使用0.22 MYU 中号过滤系统

0.1％明胶
0.5 克明胶

Milli-Q水500 毫升

高压釜

致谢

这项工作得到了NIAID R01AI121197的支持。该协议源自最近的一份报告（Kobayashi 等，2019 ）。

竞争利益

没有利益冲突。

道德规范

步骤收获小鼠胚胎和其他相关动物作品沿用了动物福利委员会（AWC）Protoc 011批准通过该中心对实验动物医学和护理（CLAMC）在UTHealth （AWC16-0124，2016-2019）。

参考文献

1. Hadland，BK，Varnum-Finney，B.，Poulos，MG，Moon，RT，Butler，JM，Rafii，S.和Bernstein，ID（2015）。内皮细胞和NOTCH明确并扩增了源自主动脉-性腺-间苯二酚。。造血干细胞临床研究杂志125（5）：二零三二年至2045年。

2. M. Kobayashi，M.，Tarnawsky，SP，Wei，H.，Mishra，A.，Azevedo Portilho，N.，Wenzel，P.，Davis，B.，Wu，J.，Hadland，B.和Yoshimoto，M （2019）。造血干细胞可以在小鼠胚胎成熟期间通过B-1淋巴细胞偏向状态转变为造血干细胞。干细胞报道13（1）：21-30。

3. E. Montecino-Rodriguez，M. Fice，D. Casero，D. Berent-Maoz，Barber，CL和K. Dorshkind（2016）。独特的遗传网络编排特定的胎儿和胎儿潮汐成人B-1和B-2发育。免疫力45（3）：527-539。

4. Montecino-Rodriguez的，E.，皮革，H。和Dorshkind，K。（2006）。对于B-1 B细胞指定的祖的鉴定。纳特免疫学7（3）：293-301。

5. Morgan，K.，Kharas，M.，Dzierzak，E.和Gilliland，DG（2008）。从鼠卵黄囊和AGM中分离早期造血干细胞。J Vis Exp （16）：pii：789。

6. Yoshimoto，M.，Montecino-Rodriguez，E.，Ferkowicz，MJ，Porayette，P.，Shelley，WC，Conway，SJ，Dorshkind，K.和Yoder，MC（2011）。胚胎第9天卵黄囊及其内部。 -胚胎造血内皮细胞独立产生B-1和缺乏B-2电位的边缘区祖细胞 .Proc Natl Acad Sci USA 108（4）：1468-1473。