材料和试剂

一次性半微量比色杯（品牌，目录号：759015）
50 ml锥形管（JET biofil ，目录号：CFT011500）
圆形油漆刷，ø6毫米
移液器提示：
10 µl（海王星，目录号：2340）

200微升（Eppendorf，货号：0030000870）

1,000 µl（Eppendorf，目录号：0030000927）

1.5 ml 微管（Deltalabs ，目录号：4092.3N）
7 ml螺旋盖小瓶，用于细胞裂解（BioSpec 产品，目录号：3205）
塑料色谱柱（Bio-Rad，目录号：7311550）
表达3x FLAG标签蛋白的囊泡细胞
BG-11液体培养基和琼脂平板（Rippka et al。，1979）
100-200 µm玻璃微珠（PRECIOSA ORNELA，晶体微珠B 134）
完整PROT 便于抑制剂混合物片剂（Sigma-Aldrich公司，目录号：11836145001）
（可选）具有合适截止过滤器的微浓缩器（例如，Amicon Ultra -0.5，Sigma-Aldrich）
液氮
碎冰
保丽龙盒或同等品，用于保存冰块
反渗透（RO）水
去离子水（默克（Merck），货号：1167545000）
甲醇（PENTA，目录号：21240-11000）
正十二烷基-β-D- 麦芽糖苷（DDM; BioChemica ，目录号：A0819,0005）
抗FLAG M2亲和凝胶（Sigma-Aldrich，目录号：A2220）
Proteus澄清微型旋转柱（Generon ，目录号：GEN-MSF500）
3x FLAG肽，20 mg，纯度> 85％（定制合成，Genscript ，美国）
ñ OTES：

另一种选择是购买3x FLAG肽（Sigma-Aldrich，目录号：F4799-4MG），但是定制合成的价格大约便宜6倍。
在去离子水中制备3 mg / ml的溶液，并以100-200 µl的等分试样形式存储在-20 °C下。Ť hawed肽可以被存储在4 ℃直至使用。
2-巯基乙烷磺酸（MES; 应用liChem，目录号：A0689，0250）
MgCl 2 ·6H 2 O（PENTA，目录号：16330-31000）
甘油（PENTA，目录号：14550-11000）
CaCl 2 ·2H 2 O（PENTA，目录号：16790-31000）
α-FLAG抗体（Merck，目录号：F7425）
MES缓冲液（1 L）（请参阅配方）
0.5 M MES-NaOH，pH 6.5（250 ml）（请参阅食谱）
1 M MgCl 2 （100毫升）（请参阅食谱）
1 M CaCl 2 （100 ml）（请参阅食谱）

设备

温控生长设备，配备定轨振荡器和光源
层流罩
金属接种环
煤气灶
500 ml锥形瓶
圆形培养瓶（10升）
Cimarec TM i Maxi磁力搅拌器（ Thermo Fisher Scientific，目录号：50088143）和磁力搅拌棒
分光光度计（WPA S1200 Spectrawave ）
离心机和转子：
离心机（Sigma Laborzentrifugen GmbH ，型号：Sigma 8KS，转子：12505-H）

离心机（Sigma Laborzentrifugen GmbH ，型号：Sigma 3K30，转子：12155-H [ +15 ml锥形管适配器，13081 ] 和12158-H ）

离心机（Eppendorf，型号：5418）

离心机（Eppendorf，型号：5415 R）

离心瓶：
500 ml（Nalgene，货号：3141-0500）

80 ml（Sigma Laborzentrifugen GmbH，目录号：15080）

27 ml（Sigma Laborzentrifugen GmbH，目录号：15032）

低温冷冻箱
普通冰柜
配备7毫升样品瓶适配器的Mini-Beadbeater-16（BioSpec Products，目录号：607）（BioSpec Products，目录号：607TC8）
Vortex V-1 Plus（Biosan ，目录号：BS-010203-AAG）
1 ml汉密尔顿注射器（Hamilton，目录号：81330）
自动移液器：
0.5-10微升（Eppendorf，目录号：3120000020）

10-100微升（Eppendorf，货号：3120000046）

100-1 ，000微升（的Eppendorf，目录号：3120000062）

Multi-Bio RS-24旋转器（Biosan ，目录号：BS-010117-AAG）
冷藏室或冷藏室，10 °C
脱水缸架和环形夹
25毫升玻璃烧杯

程序

细胞培养和收获
在层流罩的工作，接种集胞藻使用金属接种环成五个细胞，500ml锥形烧瓶，每个含有200ml BG-11培养基。在28 岁时培养细胞在设定为150 rpm的旋转振荡器上，以°C和40 µmol / m 2 / s的光合作用光子通量密度设定，直到培养物达到对数生长期的中/末期。
注：W 母鸡的培养物在750度纳米达到0.6-0.8的光密度，这对应于9-12×10 7 集胞藻细胞/ ml。

将您的培养物（OD 750〜0.8 ）收集到10 L的烧瓶中，并稀释至4 L最终体积以获得OD 750〜0.2 密度。生长培养物，直到有磁性搅拌器（转速240rpm）和空气鼓泡对数生长期的中期/结束在所述相同的条件如上述。
将细胞培养物分成500 ml离心瓶，并通过在4 °C 的冷却离心机（Sigma 8KS，转子12505-H）中以10,000 x g 离心20分钟来沉淀细胞。
将细胞沉淀悬浮在总共30 ml的MES缓冲液中。
笔记：

用于制备细胞培养物的所有培养基和设备均应灭菌。使用燃气燃烧器对金属接种环进行消毒，并在使用前对所有玻璃器皿和生长培养基进行高压灭菌。
蓝细菌培养物在750 nm处的吸光度可忽略不计；因此，在此波长下的OD主要取决于光散射（浊度）。不同的分光光度计的各种光学特性差异很大，因此OD 750 的光散射值可能会变化。因此，重要的是通过先验测量生长曲线来确定培养物处于对数生长期中/末期的OD 。在我们的标准条件下，集胞藻的倍增时间约为12小时；因此，OD 750 = 0.2 的培养物将在大约一天内达到所需的OD 750 。
根据我们的经验，更大的蓝藻文化（即卷，4 L）一般增长较慢，可能是由于气体交换的限制。因此，期望通过空气强烈鼓泡培养物。
在小号TEP 甲4你可能会冻结的细胞在液氮中，并存储它们在- 80 ℃直至使用。

细胞裂解和类囊体分离
在10,000 x g （Sigma 3K30，转子12155-H ）在4 °C的80 ml离心管中将细胞沉淀10分钟。
丢弃上清液，并用湿油漆刷将细胞重悬于5 ml MES缓冲液中。向离心管中添加30 ml MES缓冲液，然后如上所述沉淀细胞。
将细胞重悬于12 ml MES缓冲液中，并添加蛋白酶抑制剂：将1片药片溶解于1 ml去离子水中以获得50x储备液，并吸取相应的溶液以达到1x工作浓度。你可以存储在在-20抑制剂的其余℃下用于以后使用。
将3 ml玻璃珠和3 ml细胞悬液添加到四个7 ml螺帽小瓶中（图1A），合上盖子并用封口膜密封（图1B）。管中应该有大约1厘米的自由空间，您可以添加一些缓冲液以达到所需的体积。
用Mini-Beadbeater-16将电池破碎60秒。让试管在避光的冰上冷却5分钟，并重复5次破碎循环。
裂解后，将磁珠在4 °C 下以500 x g的转速旋转10 s （Sigma 3K30，装有用于15 ml锥形管的适配器的转子12155-H）。将上清液收集到27 ml离心管中。用一倍床体积的MES缓冲液洗涤磁珠（图1C）三到四次，直到上清液和磁珠呈浅绿色（图1D-1E）。
合并来自S tep B 6的所有上清液，并通过在4 °C下以35,000 x g （Sigma 3K30，转子12158-H）离心20分钟来沉淀类囊体。
此时，如果您仅对膜蛋白的分离感兴趣，则可以丢弃上清液。否则，将上清液收集到新的离心管中（标记为：SP，“可溶性蛋白”），并使用湿油漆刷将沉淀重悬于10 ml MES缓冲液中（标记为管：TM，类囊体膜）。如上离心管。
将上清液从“ SP”管中收集到50 ml锥形管中，并保存在冰上。丢弃“ TM”管中的上清液，然后将两个管（“ SP”和“ TM”）中的沉淀重悬到MES缓冲液的1/3可溶性级分中。如果仅继续使用膜部分，请使用总计10 ml的MES缓冲液，然后将沉淀物合并到50 ml的锥形管中。
在液氮中冷冻300 µl等分的可溶性蛋白和100 µl类囊体的等分试样，并储存在-80 °C下以通过凝胶电泳进一步分析。
笔记：

沉淀细胞后，由于冷冻和解冻后细胞的部分破裂，上清液可能会略带蓝色。
从小号TEP 乙5 起它是进口蚂蚁保持在样品冷却（4-10 ℃），保护它的光，以防止所述激发叶绿素分子和反应性氧物质的随之形成。我们建议在昏暗的绿色灯光下工作。
类囊体在添加其余缓冲液之前更容易先重悬至数ml体积。
在小号TEP 乙10也可能会冻结可溶性蛋白和类囊体样品的其余部分在液氮中，并将它们存储在-80 ℃直至随后的溶解和纯化。

D：\ Reformatting \ 2020-3-2 \ 1903040--1374 816046 \ Figs jpg \图1 .jpg

图1.裂囊藻细胞的破裂。A. 螺帽管中装有3 ml玻璃珠和3 ml蓝细菌悬浮液；B. Ť 他管密封用石蜡膜和细胞使用珠打浆机裂解。C.破坏细胞后，将珠子旋转到底部，并收集上清液。D.用MES缓冲液洗涤珠；E. 在每个洗涤步骤之后，收集上清液。

类囊体溶解
用MES缓冲液将类囊体的叶绿素浓度调节至0.5 µg / µl。
加入1％的正十二烷基β-D- 麦芽糖苷（DDM）到类囊体悬浮液和我ncubate在管1个小时10 ° 下在所述暗（例如，可能会用铝箔覆盖的管）在旋转器上混合器设置为10 rpm。
将悬浮液转移到27 ml离心管中，在4 °C下以46,000 x g （Sigma 3K30，转子12158-H）沉淀不溶物30分钟。
将上清液收集到50 ml锥形管中，弃去沉淀。
在液氮中冷冻100 µl溶解的类囊体，并储存在-80 °C进行进一步分析，尤其是用于识别蛋白质溶解性的潜在问题。

FLAG亲和纯化
先用1 ml的RO-水，再用1 ml的去离子水洗涤纯化柱。
关闭该柱，然后一个DD1毫升MES缓冲液和600微升的1：1的反- FLAG - M2琼脂糖使用切割移液管尖端树脂（视频1）。

D：\ Reformatting \ 2020-3-2 \ 1903040--1374 816046 \ video1.jpg

视频1. 专栏准备

打开色谱柱，让缓冲液流过。洗涤树脂与另外的1毫升MES缓冲液（轻轻吸管缓冲器上的树脂的顶部，并允许它以通过流动;图2A;视频2）。

C：\ Users \ Bio-Dandan \ Dropbox \ Refomatting \ 2020-5-20 \ 3616--1903040--1374 816046 \ video 2.jpg

视频2 。轻柔洗涤的列

将蛋白质悬浮液加载到色谱柱中，并将流通液收集到玻璃烧杯中（图2B；视频3）。

D：\ Reformatting \ 2020-3-2 \ 1903040--1374 816046 \ video3.jpg

录像3 。样品上样

用1 ml MES 缓冲液洗涤色谱柱。丢弃流通液。
第二次将来自S tep D 4 的流出物上样至色谱柱，并收集流出物。再次重复绑定。
从最终流通液中取出0.5 ml样品，将其在液氮中冷冻，并储存在-80 °C进行进一步分析[ 图3，流通液（FT）] 。
用1 ml MES缓冲液洗涤色谱柱[ 图2C; 图3，先洗（W1）] 。
关闭柱子并添加1 ml MES缓冲液：以足够高的速度吸移缓冲液，以使其与树脂充分混合（图2D；视频4）（您可以通过上下移液，轻轻地将缓冲液与树脂混合移液器吸头，但有些树脂可能会粘在吸头上而丢失）。打开色谱柱，让缓冲液流干[图3，第二次清洗（W2）] 。

D：\ Reformatting \ 2020-3-2 \ 1903040--1374 816046 \ video4.jpg

视频4 。大力清洗树脂

用1 ml MES缓冲液洗涤色谱柱，而不要混合树脂。重复此洗涤步骤3次。总共用20倍柱体积的MES缓冲液洗涤树脂（图2E）。

D：\ Reformatting \ 2020-3-2 \ 1903040--1374 816046 \ Figs jpg \图2.jpg

图2. 使用亲和色谱法从集胞藻中分离3x FLAG标签的蛋白。上图和下图分别显示了可溶性蛋白和去污剂溶解的膜蛋白的单独纯化步骤。A.将抗FLAG树脂填充到塑料色谱柱中。B.将可溶性蛋白质级分（上图）或去污剂溶解的类囊体（下图）上样至色谱柱。C.使样品流过色谱柱，并收集流过液。加载可以重复多次。D.第一步清洗（W1）是通过将缓冲液轻轻移液到树脂顶部进行的。E.洗涤继续在面板d 直到所述柱被完全从过量颜料蛋白洗涤。FLAG树脂在面板A和E中用黑条表示。

将树脂重悬于一床体积的MES缓冲液中，然后将其转移到Proteus Clarification Mini Spin Column中。
加入3x FLAG肽至终浓度300 µg / ml。用封口膜密封管的顶部，并用铝箔覆盖整个管。在转子混合器组混合以10rpm下为30 分钟，在10 ℃。
在4 °C下以600 x g （Eppendorf 5415 R ）旋转色谱柱3分钟。将洗脱液1收集到1.5 ml微量管中，并保存在冰上。
重复与FLAG肽一起孵育并按上述离心方法进行洗脱2。
将所得到的洗脱可被合并，并在总洗脱体积（通常为〜800微升）可以使用立即集中microconcetrators （例如，的Amicon 超0.5，Sigma-Aldrich公司）与所需的截止，以实现用于下游分析较高浓度（蛋白质凝胶电泳，免疫印迹[见图3，洗脱液（E）] ，蛋白质质谱，单颗粒分析，尺寸排阻色谱法等）。
笔记：

当使用溶解的类囊体时，请在所有步骤中使用补充有0.04％DDM的缓冲液。处理可溶性蛋白质时，请使用不含去污剂的缓冲液。
在纯化过程中，切勿让FLAG树脂变干。
使用前，将FLAG树脂在冰上解冻并彻底混合。
FLAG树脂以50％的溶液形式存储在缓冲液中，这意味着吸取600 µl充分混合的溶液将产生300 µl的树脂床体积。
对于丰度低的蛋白质，可以增加结合步骤（S tep D 6）。
纯化的严格性可以通过增加洗涤步骤的数量来改变。

D：\ Reformatting \ 2020-3-2 \ 1903040--1374 816046 \ Figs jpg \图3.jpg

图3.纯化带有3x FLAG-tag（FLAG- ChlP ）的geranylgeranyl还原酶的酶后的免疫印迹分析。根据该方案，从集胞藻中纯化FLAG-ChIP 。这是在装载蛋白悬浮液小号TEP d 4（L; 0.5微克叶绿素的溶解的类囊体膜），第一通流在小号TEP d 4（FT ;等体积到L），在所述第一洗涤小号TEP d 5（W1; 1/25体积的洗涤级分），步骤6中的第二次洗涤（W2; 1/25体积的洗涤级分）和在S tep D 15中获得的洗脱液（E; 1/250体积的总洗脱液，非浓缩洗脱液通过SDS凝胶电泳（A）和随后的免疫印迹（B）进行分析。在PVDF膜上进行Western印迹之前，将凝胶用SYPRO Orange（Sigma）染色以检测总蛋白（A）。用α-FLAG 抗体（Merck ）（A）探测印迹在膜上的蛋白; 显示了代表分离的FLAG-ChIP 的蛋白带。

笔记

缓冲含Mg体系的pH 6.5的MES 2+ 和Ca 2+ 在此过程中使用的离子已被优化以最大化PSII复合物的稳定性（杜伯á KOVA 等人，2009）。不同蛋白质复合物的稳定性可能需要不同的缓冲液组成。
在可溶性级分中的蛋白质浓度可以评估例如。，通过BCA分析或其他标准方法。但是，为了评估膜级分的浓度，将其叶绿素含量与[叶囊藻类囊体中的蛋白质浓度（μg/μl）大约比叶绿素高出十倍] 更为相关。
叶绿素浓度的测量：吸取10 µl类囊体移入1.5 ml微管中，并使用汉密尔顿注射器添加990 µl甲醇。涡流和孵化在管的黑暗中在室温下搅拌5分钟。通过在室温下以16,800 x g （Eppendorf 5418）离心5分钟来沉淀细胞碎片。测量665.2 nm处的叶绿素吸光度和750 nm处的样品浊度，并计算类囊体的叶绿素a 浓度（µg / µl）：（（（A 665.2 - A 750 ）/α）x 100 x 1 cm -1 （α= 79.95 L g -1 cm -1 ；Porra 等，1989）。
始终使用野生型菌株进行对照纯化，以从结果分析中排除污染物。例如，少量的集胞藻三聚体光系统I和色氨酸-tRNA合成酶是我们FLAG标签纯化的典型污染物（Knoppová 等人，2014; Bučinská 等人，2018; Skotnicová 等人，2018）。
如果纯化失败或蛋白质产量非常低，请确保您感兴趣的蛋白质在体内或制备细胞级分过程中表达且未降解（使用商业化的抗FLAG抗体进行SDS- PAGE和免疫检测（Merck ）。代表性的SDS凝胶电泳以及随后的纯化（S teps D 7- D 9 ）和洗脱（S tep D 15）的免疫印迹分析如图3所示。对于膜蛋白，将未溶解和可溶解的级分与检查蛋白质的溶解度（所需蛋白质复合物的溶解度或稳定性可能需要使用性能与DDM不同的去污剂）。此外，将原始的SP和/或溶解的TM样品与在S tep D 7中获得的流通量进行比较（图3）。与负载的材料相比，流过的蛋白质的相对数量应显着降低；否则表明与树脂的结合存在问题。为了纯化需要金属辅因子的蛋白质，应使用不含EDTA的蛋白酶抑制剂。

菜谱

MES缓冲液（1 L）
25 mM MES-NaOH，pH 6.5（50 ml的0.5 M库存）

10 mM MgCl 2 （10 ml的1 M库存）

10 mM CaCl 2 （10 ml的1 M库存）

25％克lycerol（250毫升）

在量筒中用去离子水将体积调节至1 L
膜蛋白溶解后，所有纯化步骤均应使用添加了0.04％DDM的缓冲液
0.5 M MES-NaOH，pH 6.5（250毫升）
24.41 g MES（2-Morpholinoethanesulfonic酸）（AppliChem ）

溶解于约200 ml去离子水中，并用10 M NaOH将pH设置为6.5
在量瓶中将体积调节至250 ml
1 M氯化镁2 （100毫升）
20.33 g氯化镁2 ·6H 2 O

溶解到去离子水和调整的体积至100ml在测量FLAS ķ

1 M CaCl 2 （100毫升）
14.70克CaCl 2 ·2H 2 O

溶于去离子水，并在量瓶中将体积调节至100 ml

致谢

这项工作是由捷克科学基金会（17资助- 由捷克教育部08755S）教育（项目LO1416）。

利益争夺

在一个uthors宣称没有利益冲突。

参考文献

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