材料和试剂

1. 35毫米培养皿（Tritech Research，目录号：T3500）

2. 60毫米培养皿（Tritech Research，目录号：T3315）

3. 100毫米培养皿（Tritech Research，目录号：T3361）

4. 14毫升聚丙烯圆底管（VWR，目录号：60819-761）

5. 15毫升离心管（VWR，目录号：21008-216）

6. 10毫升注射器（BD，Bacto TM ，目录号：309604）

7. 0.2 微米的无菌针筒过滤器（VWR，目录号： 28145-501 ）

8. 大肠埃希菌OP50菌株（秀丽隐杆线虫遗传学中心（CGC））

9. 含有对照RNAi质粒（L4440）的大肠杆菌HT115菌株（来源BioScience ，Ahringer C. elegans RNAi集合）

10. 表达任何目的基因的dsRNA的大肠杆菌HT115菌株（来源：BioScience ，Ahringer C. elegans RNAi Collection）

11. 铜绿假单胞菌PA14菌株（Liberati 等，2006 ）。

12. 秀丽隐杆线虫野生型布里斯托尔N2菌株和/或任何目的突变体（CGC）

13. 异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）（Anatrace 产品，目录号：I1003 100 GM）

14. 氯化钠（Fisher Bioreagents，目录号：BP358-1）

15. 氯化钙（CaCl 2 ）（Sigma-Aldrich，目录号：746495-500G ）

16. 无水硫酸镁（MgSO 4 ）（Mallinckrodt，目录号：A31H10 ）

17. 磷酸二氢钾（KH 2 PO 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：P0662-2.5KG）

18. 磷酸氢二钾（K 2 HPO 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：P3786-2.5KG）

19. 胆固醇（Sigma-Aldrich，目录号：C8667-25G）

20. 氨苄西林钠盐（EMD密理博，目录号：171254-25GM）

21. Bacto 琼脂（BD，Bacto TM ，目录号：214030）

22. Bacto 蛋白ept （BD，Bacto TM ，目录号：211677）

23. Luria-Bertani（LB）肉汤（Sigma，目录号：L3022-1KG）

24. 95 ％乙醇（EMD密理博，目录号：EX0280-3）

25. 5 mg / ml胆固醇（请参阅食谱）

26. 氨苄西林原液100 mg / ml（请参阅食谱）

27. 1 M磷酸钾缓冲液（pH 6）（请参阅食谱）

28. 1 M CaCl 2 （请参阅食谱）

29. 1 M MgSO 4 （请参阅食谱）

30. LB（请参阅食谱）

31. 含和不含氨苄青霉素的LB琼脂平板（请参阅食谱）

32. 线虫生长培养基（NGM）琼脂板（请参阅食谱）

33. RNAi板（请参阅食谱）

34. 慢速杀灭（SK）检测板（请参阅食谱）

设备

500 ml锥形烧瓶（VWR，目录号：89091-420）
1,000 ml锥形烧瓶（VWR，目录号：29136-106）
2,000 ml锥形烧瓶（VWR，目录号：89090-858）
移液器仪（Eppendorf ，型号小号：P20，P1000）
20℃和25 ℃下 Ç 。线虫培养箱（ThermoForma ，型号：3920）
离心机（VWR，型号：Clinical 50）
铂丝蜗杆镐（如Wollenberg 等人所述，在实验室制造，2013年）和酒精燃烧器（VWR，目录号：470199-936）
轨道振荡器（Thermo Fisher Scientific ，目录号：SK4000）
高压灭菌器（联合灭菌系统，型号：SR-24D）
立体显微镜（莱卡，米Odel等：MZ7.5）

软件

微软Ë Xcel公司
GraphPad棱镜

程序

铜绿假单胞菌草坪回避测定

第一天

线虫的同步
描述了针对基因被RNAi敲除的条件的测定（有关详细信息和突变体测定，请参见注释）。从大肠杆菌OP50平板转移妊娠成年N2动物到对照RNAi平板（每个RNAi平板15-20只动物）以及任何感兴趣基因的RNAi平板。每个基因敲低使用一个RNAi板。
在室温（22 °C ）下孵育平板2小时。
从RNAi板上移走妊娠母，并在20 °C 下孵育板72 h，以获得同步的成年动物。

第二天

从-80 °C 取出一小瓶冷冻的铜绿假单胞菌PA14，然后立即在LB琼脂平板上划线。在37 °C下孵育平板12-14小时。

第三天

挑选一个铜绿假单胞菌PA14的菌落，接种在14 ml聚丙烯圆底试管中的2 ml LB中，垂直放在摇床上，并在250 rpm和37 °C 下生长10-12 h 。
将20 µl接种物放在改良的NGM（3.5％代替2.5％蛋白ept）平板的35 mm SK平板（图1A）的中心。让接种物在室温下干燥（20-30分钟）。将板倒置颠倒（以防止琼脂的裂纹变干），并在37 °C 下孵育12小时。

D：\ Reformatting \ 2020-3-2 \ 1405--2003089 Jogender Singh 847750 \ Figs jpg \图1.jpg

图1.板s的示意图。A.回避测定板的中央有一个病原菌斑点。B.二选偏好分析板包含对角相对放置的两种细菌的斑点。两项选择偏好分析板中间的叉号（× ）表示秀丽隐杆线虫转移的位置。C.训练板的表面完全覆盖有病原细菌。

第四天

将铜绿假单胞菌板从37 °C 冷却到室温30分钟。
在SK板上的铜绿假单胞菌草坪外转移30只同步的成年动物。每个线虫菌株/条件使用三个铜绿假单胞菌板。使用铂金丝虫镐从SK板上的铜绿假单胞菌草坪外部刮去残留的大肠杆菌。
将板与动物在25 °C下孵育。
在不同的孵化时间（2、4、8、12和24 h或根据需要），计算草坪内，草坪外并在板的侧壁上爬行的动物的数量。

幼稚的两种选择偏好分析
第一天

按照避免草皮试验中所述同步线虫（步骤A，第1天），并在20 °C 下孵育72小时。

第二天

从-80 °C 取出一小瓶冷冻的铜绿假单胞菌PA14，然后立即在LB琼脂平板上划线。在37 °C下孵育平板12-14小时。
从-80 °C 在含100 µg / ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上划线RNAi细菌（大肠杆菌HT115）。在37 °C下孵育平板12-14小时。

第三天

挑选一个铜绿假单胞菌PA14的菌落，接种在14 ml聚丙烯圆底试管中的2 ml LB中，垂直放在摇床上，并在250 rpm和37 °C 下生长10-12 h 。
挑选一个RNAi细菌菌落（大肠杆菌HT115），在15 ml管中的100 ml / ml氨苄青霉素中接种10 ml LB，水平放置在摇床上，并以250 rpm的速度培养10-12 h和37 ℃ 。
生长后，浓缩物的RNAi细菌10-20在5倍离心，000rpm下，在室温下5分钟。
将每对接种物20 µl对角地放在35 mm SK板上（图1B）。让接种物在室温下干燥（20-30分钟）。将板倒置，在37 °C 下孵育12小时。

第四天

将两选偏好分析板从37 °C 冷却至室温30分钟。
将30只同步成年动物转移到与两个草坪等距的两选偏好板的中心（图1B）。每个秀丽隐杆线虫菌株/条件使用3个两选偏好分析板。
使用蠕虫镐（如步骤A，第4天中所述）从两选偏好分析板的中央刮下残留的大肠杆菌。
将板与动物在25 °C下孵育。
在不同的孵化时间（2、4、8、12和24 h或根据需要），计算在大肠杆菌草坪，铜绿假单胞菌草坪，草坪外并在其上爬行的动物的数量。板的侧壁。

训练有素的两种选择偏好分析
第一天

按照避免草皮试验中所述同步线虫（步骤A，第1天），并在20 °C 下孵育54小时。
从-80 °C 取出一小瓶冷冻的铜绿假单胞菌PA14，然后立即在LB琼脂平板上划线。在37 °C下孵育平板12-14小时。

第二天

挑选一个铜绿假单胞菌PA14的菌落，接种在14 ml聚丙烯圆底试管中的2 ml LB中，垂直放在摇床上，并在250 rpm和37 °C 下生长10-12 h 。将铜绿假单胞菌板保存在4 °C下。
将20 µl接种物放在35 mm SK平板上，并将其铺在平板的整个表面上，以获得铜绿假单胞菌的完整草坪（图1C）。将板倒置，在37 °C 下孵育12小时。
从-80 °C 在含100 µg / ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上划线RNAi细菌（大肠杆菌HT115）。在37 °C下孵育平板12-14小时。

第三天

在第2天从4 °C 的平板中挑选一个铜绿假单胞菌菌落，接种在14 ml聚丙烯圆底试管中的2 ml LB中，垂直放置在摇床上，使其生长10-12 h在250 rpm和37 °C下。
挑选一个RNAi细菌菌落（大肠杆菌HT115），在15 ml管中的100 ml / ml氨苄青霉素中接种10 ml LB，水平放置在摇床上，并以250 rpm的速度培养10-12 h和37 ℃ 。
冷却充分草坪绿脓杆菌p 从37拉泰什℃下至室温下至少30分钟。
将生长在20 °C的54 h老同步线虫（来自D ay 1）转移到铜绿假单胞菌的完整草坪上，并在25 °C 孵育18 h。这将构成训练有素的动物群。
对于未经处理的对照动物，将其放在相应的RNAi板上，并与训练组一起在25 °C 下孵育18 h。
如上述在纯朴的二选偏好分析（程序B，第3天）中所述，准备二选偏好板（图1B ）。在VERT板倒置，并培育在37 ℃下12小时。

第四天

将两选偏好分析板从37 °C 冷却至室温30分钟。
将30只同步成年动物从完整的草坪绿脓杆菌板转移到与两个草坪等距的两选偏好分析板的中心。每个秀丽隐杆线虫菌株/条件使用3个两选偏好分析板。这将是训练有素的动物。
同样，将30只同步成年动物从RNAi平板转移到与两个草坪等距的两选偏好分析平板的中心。每个秀丽隐杆线虫菌株/ 条件使用3个两选偏好分析板。这将是幼稚动物的对照组。
使用蠕虫镐（如步骤A，第4天所述）从两选偏好分析板的中心刮下残留细菌。
将板与动物在25 °C下孵育。
孵育1小时后，计算在草坪外的大肠杆菌草坪，铜绿假单胞菌草坪上爬过板侧壁的动物数量。

数据分析

草坪占用率计算：计算细菌草坪内外的动物数量。计算Microsoft E xcel中的草坪占用百分比为：

其中，N on 是草坪上的动物数量，N off 是草坪外的动物数量。在计算的侧壁上爬行的动物不包括在内。使用GraphPad Prism绘制草坪占用百分比的时间过程。图2A中的代表性数据表明，具有基因aex-5 和nol -6的敲低的动物分别具有增强的和减缓的铜绿假单胞菌草坪的避免率。

选择指数计算：计算两种细菌性草坪上的动物数量。计算Microsoft E xcel中的铜绿假单胞菌选择指数（P. aeruginosa CI）为：

在铜绿假单胞菌CI测量动物的偏好铜绿假单胞菌具有值范围从- 1比1的值1，- 1，且0表示所有的动物都在铜绿假单胞菌，所有的动物都远离铜绿假单胞菌，并且铜绿假单胞菌和大肠杆菌上分别有相同数量的动物。在铜绿假单胞菌CI可以被绘制为单时间点（训练两选择偏好测定）或一段时间场（幼稚双选择偏好分析使用GraphPad Prism）。图2B中的代表性数据显示，已敲除aex-5 和nol -6 基因的幼稚动物分别具有从铜绿假单胞菌到大肠杆菌的优先切换，速度更快和更慢。

使用GraphPad Prism 8进行数据统计分析。合并来自三个独立实验的数据，并计算平均值和标准差（SD）。使用多个t 检验–每个时间点一个，并计算相对于对照样品的基因敲低的p值。当P <0.05 时，判断数据具有统计学意义。

D：\ Reformatting \ 2020-3-2 \ 1405--2003089 Jogender Singh 847750 \ Figs jpg \图2.jpg

图2.避免病原体和细菌偏好变化的时间过程。A. 铜绿假单胞菌草坪上动物的占有率的时程。B. 在两种选择偏爱分析中，幼稚动物的铜绿假单胞菌CI的时程，其中每个铜绿假单胞菌和大肠杆菌都带有一个草坪。有关aex-5 和nol -6的详细信息，请参见Singh和Aballay （2019b ）。误差棒表示来自三个独立实验的SD。在每个时间点使用t 检验，并计算相对于对照RNAi 的基因敲低（aex-5 或nol -6 ）的P 值。*** P <0.001，** P <0.01和* P <0.05。ns 。，无关紧要。

笔记

描述了对铜绿假单胞菌的测定。但是，这些协议可以用于其他病原体，例如粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）Db11。
描述了针对RNAi敲除基因的条件的测定。可以对不使用RNAi的突变动物的检测方法进行调整。对于此类检测，请在大肠杆菌OP50板上进行动物同步，并准备大肠杆菌OP50和铜绿假单胞菌PA14的草皮，以进行两项选择。
所述测定可以在低氧室中在不同的氧气水平下进行。
在动物接触之前，接种铜绿假单胞菌的平板的孵育时间对于避免草坪的动力学至关重要。潜伏时间的不同导致规避动力学的不同（Singh和Aballay ，2019b）。
两种选择偏好分析的训练方案有多种修改。在某些情况下，从L1幼虫阶段开始在含有大肠杆菌和铜绿假单胞菌的平板上进行训练（Zhang 等人，2005）。
铜绿假单胞菌是机会病原体，并且PA14菌株是来自人类患者的高毒性临床分离株。铜绿假单胞菌PA14的处理应按照2级生物安全实验室标准（BSL-2）进行。

菜谱

100 mg / ml氨苄青霉素原液
在15 ml试管中加入1 g氨苄西林钠盐，并充满dH 2 O至10 ml
搅拌直至溶解并过滤灭菌（0.22 微米）
在-20 °C下以1毫升等分试样保存长达1年
5 mg / ml胆固醇
将500毫克胆固醇添加到100毫升95％乙醇中
搅拌直至完全溶解和过滤灭菌（0.22 微米）
将胆固醇溶液储存在室温下
1 M磷酸钾缓冲液（pH 6）
添加23克ķ 2 HPO 4 ，118克KH 2 PO 4 为1 ，000毫升刻度瓶中并填充卫生署2 O最多1 ，000毫升
搅拌直至完全溶解
保持瓶盖松动并在121 °C下高压灭菌30分钟
室温保存
1 M氯化钙2
将11.1 g CaCl 2 溶于100 ml dH 2 O
在121 °C下高压灭菌30分钟
室温保存
1 M硫酸镁4
将12.0 g MgSO 4 溶于100 ml dH 2 O
在121 °C下高压灭菌30分钟
室温保存
磅（100毫升）
在500 ml锥形瓶中将2 g LB肉汤添加到100 ml dH 2 O中
在121 °C下高压灭菌30分钟，并在室温下保存
不含氨苄青霉素的LB琼脂平板
在1000毫升的锥形烧瓶中，将10克LB肉汤，7.5克琼脂添加到500毫升dH 2 O 中
在121 °C下高压灭菌30分钟，然后冷却至55 °C
将25毫升每个倒入100毫米培养皿中，并在室温下孵育2天
存放在4 °C 的盒子中，使用3个月
LB带有氨苄青霉素的琼脂平板
在1000毫升的锥形烧瓶中，将10克LB肉汤，7.5克琼脂添加到500毫升dH 2 O 中
在121 °C下高压灭菌30分钟，然后冷却至55 °C
在搅拌的同时添加500 µl 100 mg / ml氨苄西林
将25毫升每个倒入100毫米培养皿中，并在室温下孵育2天
存放在4 °C 的盒子中，使用3个月
线虫生长培养基（NGM）琼脂接种与板大肠杆菌OP50
在一个2,000 ml锥形烧瓶中，将2.3 g Bacto 蛋白ept，2.8 g NaCl，20.4 g琼脂添加到960 ml dH 2 O 中
在121 °C下高压灭菌30分钟，然后冷却至55 °C
在搅拌的同时添加25 ml 1 M磷酸钾缓冲液，1 ml 1 M CaCl 2，1 ml 1 M MgSO 4 和1 ml 5 mg / ml胆固醇
分别倒入8毫升60毫米培养皿中，并在室温下孵育3天
在500 ml锥形瓶中的100 ml LB肉汤中接种大肠杆菌OP50 的单个菌落，并在37 °C下以225 rpm的转速孵育18-20 h
点400微升大肠杆菌上在室温下温育，对于3天（从板的中心OP50培养小号TEP 9D）
生长的大肠杆菌OP50上在室温下将板3天
将板在4 °C 的盒子中存放，使用3个月
RNAi板（具有3 mM IPTG和100 µg / ml氨苄青霉素的NGM板）
在一个2,000 ml锥形烧瓶中，将2.3 g Bacto 蛋白ept，2.8 g NaCl，20.4 g琼脂添加到960 ml dH 2 O 中
在121 °C下高压灭菌30分钟
将715 mg IPTG溶于5 ml dH 2 O
搅拌下将介质冷却至55 °C
加入25毫升1M的磷酸钾缓冲液，1毫升的1M的CaCl 2 ，1毫升的1M硫酸镁4 ，1毫升5毫克/毫升胆固醇的，上面制备的5毫升的IPTG溶液（由小号TEP 10C），并1毫升100毫克/毫升氨苄青霉素，同时搅拌
分别倒入8毫升60毫米培养皿中，并在室温下孵育3天
将板在4 °C 的盒子中存放，使用3个月
慢速杀灭（SK）检测板
在一个2000毫升的锥形烧瓶中，将3.2克Bacto 蛋白ept，3.0克NaCl，20克琼脂添加到960毫升dH 2 O 中
在121 °C下高压灭菌30分钟，然后冷却至55 °C
在搅拌的同时添加25 ml 1 M磷酸钾缓冲液，1 ml 1 M CaCl 2，1 ml 1 M MgSO 4 和1 ml 5 mg / ml胆固醇
将每份3.5毫升倒入35毫米培养皿中，并在室温下孵育3天
将板叠用塑料袋包装，在4 °C 的盒子中存放并使用3个月

致谢

NIH授予GM0709077和AI117911（授予AA）支持这项工作。本研究中使用的野生型Bristol N2菌株由秀丽隐杆线虫遗传学中心（CGC）提供，该中心由NIH研究基础设施计划办公室（P40 OD010440）资助。该协议已根据先前的工作进行了改编（Singh和Aballay ，2019b）。

利益争夺

作者宣称他们没有利益冲突或利益冲突。

参考文献

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