材料和试剂

150 mm组织培养板（TPP，目录号：93150）
细胞刮刀（TPP，目录号：99003）
猎鹰管（TPP目录号：91015）
手术刀片（Swann-Morton，目录号：0103）
96 深孔板（Thermo ，目录号：95040450）
2 ml蛋白质LoBind 管（Eppendorf，目录号：0030108132）
1.5 ml蛋白质LoBind 管（Eppendorf，目录号：Z666505）
0.5 ml蛋白质LoBind 管（Eppendorf，目录号：0030108094）
12道移液器，30-300 μ升仪（Eppendorf，目录号：3122000060）
10 ％NP-40（Thermo Fischer Scientific，目录号：85124）
PBS（Gibco，目录号：10010-015）
戊二醛（默克，目录号：111-30-8）
甘氨酸（Fluka ，目录号：15527H）
蛋白酶抑制剂cOmplete ，Mini，无EDTA（罗氏（Roche），目录号：04693159001）
DTT（Merck，目录号：3483-12-3 ）。
Superase -In（Ambion ，目录编号：AM2694）
恒星生物素化探针（由Biosearch 根据目标基因定制）
MagReSyn ® 链霉亲和结合/捕获生物素化的生物分子（AEC-AMERSHAM SOC公司，目录号：MR-STV002）
Precision Plus蛋白双色标准液（Bio-Rad，目录号：161-0374）
4个Laemmli 样品缓冲液（Bio-Rad，目录号：1610747）
考马斯亮蓝R-250（Bio-Rad，目录号：1610436）
牛血清白蛋白组分V（罗氏（Roche），目录号：10735078001）
LC-MS水（霍尼韦尔，目录号：LC365）
碳酸氢铵（Fluka ，目录号：09830）
甲醇（霍尼韦尔，目录号：LC230）
乙腈（霍尼韦尔（Honeywell），目录号：LC015）
碘乙酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：I1149）
胰蛋白酶（Promega，目录号：V511A）
甲酸（Thermo ，目录号：28905）
的Tris-HCl（Sigma-Aldrich公司，目录NUM BER ：T1503-250G）
氯化钾（Sigma-Aldrich，目录号：P9333-1KG ）
Triton X100（Sigma-Aldrich，目录号：X-100-100ML ）
NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：s7653-1KG ）
SDS（Sigma-Aldrich，目录号：L3771-100G ）。
甲酰胺（Thermo Fischer Scientific，目录号：17899）
20x SSC（Sigma-Aldrich，目录号：S6639-1L）
RNase A（Sigma-Aldrich，目录号：10109142001）
RNase H（Sigma-Aldrich，目录号：10786357001）
DNase 1（Invitrogen，目录号：EN0521）
裂解缓冲液（请参见食谱）
杂交缓冲液（请参见配方）
洗涤缓冲液（请参阅配方）
DNase缓冲液（请参见配方）
洗脱缓冲液（请参阅配方）
染色缓冲液（请参见配方）
脱水缓冲液1（请参阅配方）
还原缓冲液（请参见配方）
烷基化缓冲液（参见配方）
脱水缓冲液2（请参阅配方）
消化缓冲液（请参阅食谱）
胰蛋白酶溶液（请参阅食谱）
提取缓冲液（请参见配方）
加载溶剂（请参见配方）
梯度溶剂A（请参见配方）
梯度溶剂B（请参见配方）

设备

冷藏微量离心机（贝克曼库尔特，型号：22R）
摇床（TCS科学公司Nutator）
旋转器（Intelli -mixer RM-2L）
磁选机（Resyn Biosciences）
Deepwell 平板式热混合器（Eppendorf，目录号：5355）
Deepwell 板真空干燥系统（凝胶瓶在真空干燥罐中通过安捷伦DS 102双级旋片泵进行干燥，目录号：9499315）
真空浓缩器（Labconco ，目录号：7310035）
水浴声波发生器（班德林，目录号：301）
Dionex Ultimate 3000 RSLC系统（Thermo，目录号：IQLAAAGABHFAPBMBEZ）
脱盐柱（Thermo，目录号：164567）
分离柱（Thermo，目录号：164534）

软件

蛋白质试验（Sciex ，https : //sciex.com/products/software/proteinpilot-software ）

程序

细胞交联
在150 mm平板中（在30 ml培养基中）以所需的条件培养〜1 x 10 7个细胞。
注意：可以使用更多的单元格，我们发现1 x 10 7个单元格是获取高分辨率数据所需的最小数量。

用20 ml 1x PBS洗涤。
在室温下在摇床上用20 ml 1％戊二醛的1x PBS溶液使板中的细胞交联10分钟。
注意：可以使用替代的交联剂代替戊二醛，包括紫外线和甲醛，必须相应地调整方案。

在室温下，在摇床上用20 ml 0.125 M甘氨酸淬灭5分钟。
用20 ml冰冷的1x PBS洗涤。
刮擦细胞并转移到15 ml猎鹰管中。
在4°C下以2,500 xg ，5 min 离心细胞，并弃去浓缩。
速冻沉淀物并储存在-80°C或立即使用。

细胞裂解
重悬沉淀在250-300 微升裂解缓冲液+ 1×蛋白酶抑制剂。
再转印悬浮细胞一ñ的Eppendorf，拌匀，并培育在室温下25分钟的摇床上。
在10,000 x g 下于4°C离心细胞10分钟。
将骨料转移到新的Eppendorf并丢弃颗粒。
在4°C下以12,000-14,000 x g的速度将上清液离心至10分钟。
收集骨料（在此阶段沉淀并不总是可见的）。

探针杂交
准备杂交反应：
200 微升溶胞产物

100 微升杂交缓冲液

0.3 微升的1M DTT（至最终为0.1mM）

1x蛋白酶抑制剂

1.5 微升的20U / 微升Superase （至最终为0.1U的/ 微升）

添加生物素化探针至每个反应的终浓度为100 pmol 。

注意：我们建议使用一组加扰的生物素化单分子探针作为阴性对照，此外，可以使用靶向反义链的一组探针。此外，我们建议进行平行反应，应将实验数据集与这些对照数据集进行比较，以消除倾向于以非特异性方式聚集或结合的蛋白质。

旋转37°C孵育杂交反应4小时。

链霉亲和素珠的制备（视频1）
注：我n中的视频管，其中反应将出现标有“反应”随后，有三个试管标“1X PBS”，“1毫克/毫升BSA”和“ HYB ”（杂交缓冲液）。

洗40 微升浆料链亲和素珠（等于〜10-15 微升固体链亲和素珠）在〜250 微升1×PBS×3。
块珠250-500 微升1mg / ml的在1×PBS中的BSA在室温下1个小时，摇动。
弃去封闭液并用杂交缓冲液洗涤磁珠，重复洗涤3次。

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视频1. 链霉亲和素珠的制备

生物素-链霉亲和素反应
将杂交反应添加到珠子中，并在37°C下孵育30-60分钟，旋转。
丢弃未结合的反应。
洗涤珠40X固体珠体积（〜400-600 微升的洗涤缓冲液）。
重复洗三遍。

洗脱选项I：

在3倍重悬珠子的固体珠的原始体积（〜30-45 微升DNA酶的）缓冲器。
加入100μl 洗脱缓冲液，并在37°C下孵育30分钟，旋转。
加入样品上样缓冲液，在9 5°C下煮沸5分钟。

图1. RNA和相关蛋白的生化下拉示意图以及通过LS-MSMS表征

洗脱选项II：

添加〜50 微升2×样缓冲液并煮沸，在95℃下5分钟。
在SDS-PAGE页面上运行样品，用考马斯染色并切割条带进行质谱分析。代表性的SDS-PAGE凝胶如图2所示。

图2用Coomassie染色的SDS-PAGE的代表性图像代表在3T3小鼠成纤维细胞中的下拉实验：使用了一组针对目标mRNA的探针，阴性对照由一组加扰的非特异性探针组成。

- 凝胶消化In（基于R Eference 19）
用手术刀片将相关的凝胶泳道切成多个切片（在这种情况下，沿着泳道的长度约8个水平切片，分别切出大的高强度蛋白条带，以最大程度地减少低丰度蛋白的潜在掩盖）。
将每个凝胶切片切成小块（1 x 1 mm），然后放入深孔板。
加入〜200 微升（或足以覆盖）的脱色缓冲液，并在热混合器中涡旋（最大800 rpm）20 分钟，并丢弃上清液。
重复步骤F 3。
加入100μl （或足以覆盖）脱水缓冲液1，在热混合器中涡旋20分钟（最大800 rpm）。
去除并丢弃印迹。
真空吸干凝胶片，使其完全干燥（10-20分钟）。
向干燥的凝胶中添加25μl （或足以覆盖凝胶碎片）还原缓冲液。
涡旋并短暂旋转（最大800 rpm）。
使反应在60°C下进行1小时。
将试管冷却至室温（22-23°C）。
加入500 微升脱水缓冲器1。
孵育10分钟（22-23°C）。
删除删除并丢弃。
加入25μl （或足以覆盖凝胶碎片）的烷基化缓冲液到凝胶碎片上。
涡旋并短暂旋转（最大800 rpm）。
使反应在室温（22-23°C）下在黑暗中进行20分钟。
删除删除并丢弃。
用100μl 消化缓冲液洗涤凝胶，涡旋振荡10分钟，旋转。
删除删除并丢弃。
用100μl （或足以覆盖凝胶碎片）的脱水缓冲液2脱水凝胶，涡旋振荡5分钟，旋转，除去补充剂并丢弃（最大800 rpm）。
重复步骤F 21。
用真空吸尘器将凝胶片完全干燥（约20分钟，使时间最少）。
将深孔板放在冰上。
添加新鲜制备的胰蛋白酶溶液，以刚好覆盖凝胶片（〜5-50 微升）。
30分钟后，检查是否所有的胰蛋白酶溶液均已吸收，并在必要时添加更多（凝胶碎片应完全用胰蛋白酶覆盖）。
将凝胶块在冰上或在4°C下再水化1小时。
根据需要添加消化缓冲液以覆盖凝胶碎片。
在37°C下孵育18小时。
将消化液（水提取液）转移到2 ml Protein Lo-Bind管中。
向凝胶碎片中加入30μl （足以覆盖）提取缓冲液。
涡旋20-30分钟。
在超声浴中超声处理5分钟。
将水提取物添加到步骤F 30中获得的溶液中。
重复步骤F31-F33 。
加速消化液至干。

液质联用
20添加微升装载溶剂，干燥的肽消化和涡旋1分钟。
将18μl 转移至玻璃HPLC小瓶或0.5 ml Eppendorf Protein LoBind 管中，并置于自动进样器中。
注入2-5 微升上捕获柱（PepMap 75 微米以5×2厘米）微升使用加载溶剂/分钟和5分钟后开关内联用分析柱（PepMap 75 微米×15厘米）。
用15分钟线性梯度洗脱的肽以300 nl / min的浓度在6 ％至35 ％的梯度溶剂B中使用
向纳米喷雾器施加2.0-2.5 kV的电喷雾电压。
在数据相关性采集（DDA）模式下采集数据，其中使用单个250 ms 扫描以400-1,500 m / z的范围采集前体离子，并在50 ms 扫描时间以100-1,800 m / z的范围内进行50次产物扫描。被自动触发。

数据分析

数据使用Paragon搜索引擎（Sciex ）的Protein pilot v5.0.1进行处理，并使用Uniprot Swissprot Mouse数据库补充了常见污染蛋白的序列，在PSM，肽和蛋白水平上采用了1％FDR截止值。对照样品清单中没有的样品被选作进一步分析。

配方小号

裂解缓冲液
50 mM的Tris-HCl pH 7.5

150 毫米氯化钾

1毫米EDTA

0.5％的Triton X100

杂交缓冲液
500毫米氯化钠

1 ％SDS

100 mM Tris-HCl，pH 7.0

10毫米EDTA

15％甲酰胺

使用前加入新鲜：1mM的DTT，蛋白酶抑制剂，U / μl的Superase

洗涤缓冲液
2个SSC

0.5 ％SDS

加入新鲜的1 mM DTT

DNase缓冲液
10毫米氯化钠

0.1 ％NP-40

洗脱缓冲液
100 微克/ ml的RNA酶A

0.1 U / μl的RNA酶H

100 U / ml脱氧核糖核酸酶1

以下所有凝胶内消化缓冲液均使用LC-MS水制备

染色缓冲液
50 ％甲醇

50 mM碳酸氢铵

脱水缓冲液1
100％乙腈

还原缓冲液
10 mM二硫苏糖醇

25 mM碳酸氢铵

烷基化缓冲液
55 mM碘乙酰胺

25 mM碳酸氢铵

脱水缓冲液2
50 ％乙腈

25 mM碳酸氢铵

消化缓冲液
25 mM碳酸氢铵

胰蛋白酶溶液
10 ng / μl 胰蛋白酶

25 mM碳酸氢铵

提取缓冲液
50％乙腈

5％甲酸

加载溶剂
2％乙腈

0.2％甲酸

梯度溶剂A
0.1％甲酸

梯度溶剂B
80％乙腈

0.1％甲酸

致谢

我们感谢山姆博士Barichievy 和斯蒂芬妮博士Fanucchi 刺激和富有成果的discussions.We 也感谢尼古拉博士波美他用的制作协助video.This 研究已经得到了以下的资金支持：到V2YGE81 AFS，PG- V2KYPO7，TA 2011 011，由工业和科学研究理事会（南非CSIR）授予MMM，并获得科学技术部新兴研究区计划（南非DST）科学技术中心的资助能力补助金，SA医学研究委员会SHIP补助金，CSIR议会补助金。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考文献

Abdelmohsen ，K.，Panda，AC，Kang，MJ，Guo，R.，Kim，J.，Grammatikakis ，I.，Yoon，JH，Dudekula ，DB，Noh，JH，Yang，X.，Martindale，JL和Gorospe ，M.（2014）.7SL RNA通过与HuR竞争而抑制p53翻译.Nucleic Acids Res 42（15）：10099-10111。
Abdelmohsen ，K。，Tominaga，K.，Lee，EK，Srikantan ，S。，Kang，MJ，Kim，MM，Selimyan ，R。，Martindale，JL，Yang，X.，Carrier，F.，Zhan，M. ，Becker，KG和Gorospe，M。（2011）。核仁蛋白通过靶mRNA编码区和非编码区中富含G的元件增强翻译， Nucleic Acids Res 39（19）：8513-8530。
Baltz，AG，Munschauer ，M.，Schw A Nhausser ，B.，Vasile ，A.，Murakawa ，Y.，Schueler ，M.，Youngs，N.，Penfold-Brown，D.，Drew，K.，Milek ， M.，Wyler，E.，Bonneau，R.，Selbach ，M。，Dieterich，C.和Landthaler ，M。（2012）.mRNA 结合的蛋白质组及其在蛋白质编码转录本上的整体占有情况。Mol Cell 46 （5）：674-690。
Castello，A.，Fischer，B.，Eichelbaum ，K。，Horos ，R。，Beckmann，BM，Strein ，C。，Davey，NE，Humphreys，DT，Preiss，T.，Steinmetz，LM，Krijgsveld ，J。和Hentze ，MW（2012）。从哺乳动物mRNA结合蛋白图谱洞悉RNA生物学。细胞149（6）：1393-1406。
Chu，C.，Quinn，J. and Chang，HY（2012）。通过RNA纯化（ChIRP）分离染色质。J Vis Exp （61）。
Chu，C.，Qu，K.，Zhong，FL，Artandi ，SE和Chang，HY（2011）。长期非编码RNA占用的基因组图揭示了RNA-染色质相互作用的原理。分子细胞44（4）：667-678 。
迪Tomasso ，G.，米勒詹金斯，LM和Legault，P.（2016）。ARiBo上拉下来Riboproteomic研究了基于无标记定量质谱法。 RNA 22（11）：一七六〇年至1770年。
Glisovic 。，T，Bachorik ，JL，庸，J。和Dreyfuss的，G。（2008）.RNA 结合蛋白和转录后基因regulation.FEBS快报582（14）：1977-1986。
Grammatikakis ，I。，Zhang，P.，Panda，AC，Kim，J.，Maudsley，S.，Abdelmohsen ，K。，Yang，X.，Martindale，JL，Motino ，O。，Hutchison，ER，Mattson，MP and Gorospe，M.（2016）。HNRNPH1 / H2调控的神经元分化因子TRF2的可变剪接。Cell Rep 15（5）：926-934。
Gumireddy ，K。，Li，A.，Yan，J.，Setoyama ，T。，Johannes，GJ，Orom ，UA，Tchou ，J。，Liu，Q.，Zhang，L.，Speicher，DW，Calin，GA and Huang，Q.（2013）。在翻译步骤鉴定长调控RNA的RNP复合物调控转移， EMBO J 32（20）：2672-2684。
Kar，A.，Fushimi，K.，Zhou，X.，Ray，P.，Shi，C.，Chen，X.，Liu，Z.，Chen，S. and Wu，JY（2011）。RNA解旋酶p68 （DDX5）通过调节5'剪接位点的茎环结构调节tau外显子10剪接。Mol Cell Biol 31（9）：1812-1821。
Kar，AN，Vargas，JNS，Chen，CY，Kowalak ，JA，Gioio ，AE和Kaplan，BB（2017）。细胞色素C氧化酶IV mRNA轴突运输的分子决定因素。摩尔细胞神经科学80：32-43。
权，SC，易，H.，艾歇尔鲍姆，K。，˚F ö 小时，S。，费舍尔，B.，你，KT，城堡，A.，Krijgsveld ，J。，Hentze ，MW和Kim，VN（2013）。该RNA结合蛋白剧目胚胎干细胞纳特STRUCT分子生物学杂志20（9）：1122至1130年。
Lunde，BM，Moore，C。和Varani ，G。（2007），RNA结合蛋白：有效功能的模块化设计， Nat Rev Mol Cell Biol 8（6）：479-490。
McHugh，CA，Chen，CK，Chow，A.，Surka ，CF，Tran，C.，McDonel ，P.，Pandya-Jones，A.，Blanco，M.，Burghard ，C.，Moradian ，A.，Sweredoski ，MJ，Shishkin ，AA，Su，J.，Lander，ES，Hess，S.，Plath，K。和Guttman，M。（2015年）。XistlncRNA直接与SHARP相互作用，通过HDAC3沉默转录。自然521（ 7551）：232-236。
McHugh，CA和Guttman，M.（2018）.RAP-MS：一种鉴定与细胞中特定RNA分子直接相互作用的蛋白质的方法，方法Mol Biol 1649：473-488。
Ng，SY，Bogu ，GK，Soh，BS和Stanton，LW（2013）。长非编码RNA RMST与SOX2相互作用以调节神经发生。Mol Cell 51（3）：349-359。
Ramanathan，M.，Porter，DF和Khavari，PA（2019）。研究RNA-蛋白质相互作用的方法。Nat Methods 16（3）：225-234。
舍甫琴科，A.，托马斯，H.，Havli 小号，J.，奥尔森，JV和Mann，M。（2006）。在凝胶内消化用于质谱表征蛋白质的蛋白质组和。纳特Protoc 1（6）：2856- 2860。
西蒙，MD，Wang，CI，哈尔琴科，PV，西，JA，查普曼，BA，Alekseyenko ，AA，Borowsky ，ML，Kuroda，MI和Kingston，RE（2011）。非编码RNA的基因组结合位点.Proc Natl 科学院科学USA 108（51）：20497-20502。
Slobodin ，B。和Gerst ，JE（2010）。一种新的MRNA亲和纯化技术用于鉴定相互作用的蛋白质和成绩单在核蛋白复合物。 RNA 16（11）：2277至2290年。
富永，K.，Srikantan ，S。，李，EK，Subaran ，SS，马丁代尔，JL，Abdelmohsen ，K。和Gorospe，M。（2011）通过的HuR和miR-494。核仁表达的调控.Competitive分子细胞生物学31（20）：4219-4231。
Yoon，JH，Abdelmohsen ，K。，Srikantan ，S。，Yang，X.，Martindale，JL，De，S.，Huarte ，M。，Zhan，M.，Becker，KG和Gorospe，M.（2012）。LincRNA-p21抑制靶mRNA的翻译。分子细胞47（4）：648-655。
Yoon，JH和Gorospe，M.（2016）。交联免疫沉淀和qPCR（CLIP-qPCR）分析以绘制长的非编码RNA与RNA结合蛋白之间的相互作用图，方法 Mol Biol 1402：11-17。
曾，F.，Peritz 。，T，Kannanayakal ，TJ，Kilk ，K，。Eiriksdottir ，E，。Langel ，U和。Eberwine ，J（2006）。.A 协议PAIR：RNA的PNA辅助鉴定结合蛋白在活细胞中。纳特Protoc 1（2）：920-927。
张，W.，解，M.，舒，MD，施泰茨，JA和DiMaio ，D。（2016）。一种接近依赖性测定对于RNA特异性蛋白质相互作用在完整细胞中。 RNA 22（11）：1785至1792年。