材料和试剂

盖玻片
玻璃钨微电极（阻抗：〜5MΩ；尖端直径：〜1μm ）：
这些电极是自制的，有关电极构造程序的详细说明可以在以前的文章中找到（Li Et Al。，1995 ）。简而言之，用钨丝（直径为200的Myuemu，上海的钨和钼）制备玻璃中的钨电极。产品公司，型号：S-EST6135）和毛细管玻璃（内径：0.3 毫米，外径：1 毫米，硼硅酸盐玻璃，上海玻璃厂，型号：SGW-95）。测量到的所需阻抗约为5MΩ（Ωmega -Tip-Z，世界精密仪器公司，美国），对应的钨尖端长度为〜10 µm，尖端直径为〜1 µm（图1）。

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1图。照片的钨-在-玻璃微电极。1网格Mark是2.5 Myuemu图像显示了电极头长度的中〜10 Myuemu和末端直径为〜1 Myuemu。

动物
这些程序是使用16只麻醉的成年猫进行开发的，以下程序也可以应用于其他物种的视觉皮层。

盐酸氯胺酮
1％硫酸阿托品滴眼液
琼脂
巴比妥酸盐

设备

神经数据采集系统（Blackrock Microsystems Inc.，Cerebus ，Cerebus 32）
摄像机（Andor Technology，Andor ，型号：iXon DU897）
镜头（尼康，尼克尔，D = 50毫米，f = 1.2）
视觉刺激发生器（剑桥研究系统有限公司，ViSaGe MKII）
立体定位仪（成茂，SN-3N）

软件

Matlab（Mathworks ，ww2.mathworks.cn），并将matlab代码作为补充文件

程序

动物准备程序
有关动物手术和麻醉程序的详细说明，请参见以前的研究（Song和Li，2008年）。

术前用盐酸氯胺酮（30 mg / kg）麻醉猫，然后进行气管插管和静脉插管。 20毫克/千克/小时），麻痹（加拉明三乙10毫克/公斤/小时），和血糖和流体（葡萄糖200毫克/公斤/小时在林格氏溶液3米升/公斤/小时IV ）。连续监测心脏速率，心电图，脑电图（EEG），呼气末CO 2 和直肠温度。当EEG表现为以睡眠梭形为特征的稳定的睡眠样状态时，麻醉被认为是足够的。包括角膜，眼睑和退缩反射定期进行测试。
眼睛已准备好进行视力实验：收缩眼膜并使用1％硫酸阿托品滴眼液扩张瞳孔。戴上隐形眼镜并使用其他矫正眼镜将视网膜聚焦在动物面前的计算机显示器上。
在第17区（V1）上方进行颅骨切开和硬膜切开术，并在周围颅骨上固结一个不锈钢腔室，以抑制皮层脉动，用盖玻片密封腔室并填充硅油，或用4％琼脂和a盖住皮层盖玻璃。
在实验结束时，通过静脉注射过量的巴比妥酸盐（剂量为5 ml，6 ％的巴比妥酸盐）处死动物。

光学成像程序
将相机和镜头放置在光学窗口上，使用自制的相机臂粗略地定位相机，并使其具有100毫米自由度的微操纵器（手动调整x，y，z位置）。使用微操纵器平台调整x，y，z位置（自由度10毫米）和偏角α（45度自由度）。光学仪器是14位视频摄像机（北爱尔兰安道尔科技公司），配有两个前置摄像头，前置连接的50毫米尼康镜头。
使用绿光（546 nm）照明尽可能均匀地照亮皮质表面，获取血管图样的参考图像（见图2A）。
将照相机聚焦在〜400 微米的皮质的表面下方，并收集用红光照明（605纳米，最佳波长为血流动力学血氧饱和度信号）的光学图像。
获得方向偏好图，响应双目全屏高对比度（100％）正弦波光栅记录内在信号，主要的刺激包括漂移光栅，在两个方向上均以8个等距方向呈现（16每个刺激进行20次，持续9 s，然后间隔16 s，由Cambridge Systems VSG图形板产生视觉刺激，并在高分辨率监视器屏幕（40×30 cm）上显示刺激）在垂直方向上以100 Hz的频率刷新。以与刺激斑块相同的平均亮度（10 cd / m 2 ）固定屏幕背景。显示器离动物的眼睛57厘米。
通过8个方向的像素逐像素矢量求和生成彩色编码的方向偏好图（图2B）（Bonhoeffer和Grinvald ，1991年）。在一些实验中，在16个等距方向（11.25 ° 间隔）处给出了漂移光栅。）。
仔细选择仅高度准确且可重现的地图，即首先从不同的试验子集生成地图，然后仅选择没有位移的地图（偏移不超过13-26 μ米风车中心），这些被认为是可接受的（马里ñ ö 等人，2005 ）。

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图2 ，高精度的定量测定PC位置。一个。血管模式的皮质表面，乙，颜色编码的方位图的皮质（A）。Ç 。两个相邻的风车中心（PC，位置1和2 ）和方向域中的三个均匀间隔的插入点（DP，域点，位置3； DM，域中途，位置4和5）。八个刺激方向以22.5°的间隔进行颜色编码。（B）：500 微米。比例尺在（C）：100 微米。

电生理记录程序
单机隔离
将电极插入并推进穿过皮质，并使用Cerebus 系统记录信号。
尖峰信号在250-7,500 Hz处进行带通滤波并以30 kHz采样。只有完全隔离的单元格才能满足单个单位记录的严格标准（动作电位的形状固定，并且在绝对不应期没有尖峰）选择并保存以供进一步分析。
单单元功能表征
记录的所有细胞都位于代表视野中心10°的皮层区域，当分离出单细胞动作电位时，确定了每个细胞的首选方向，SF和TF，每个细胞都被单眼刺激为了定位CRF的中心，连续移动了一个狭窄的矩形正弦波光栅片（0.5°至1.0°宽，3.0°至5.0°长，对比度100％）来定位CRF的中心沿垂直于或平行于单元最佳方向的轴的位置，并测量对其漂移的响应。
将光栅设置在最佳方向和SF处，并以最佳速度在记录的单元的最佳方向上漂移，将两个轴的响应曲线的峰值定义为CRF的中心，我们确定CRF的大小通过进行遮挡测试，在背景漂移光栅上，由圆形空白补丁组成并位于CRF中心的掩模的尺寸逐渐增大（Song和Li，2008年）。
LFP记录
获得LFP信号的方向调整。
LFP记录的当前视觉刺激（对比度为50％的10°正弦波光栅），以及方向和空间相位不同的光栅的伪随机序列，每次闪烁32 ms。
要分析刺激引起的LFP响应，请过滤3 Hz至100 Hz之间的记录，并通过平均各个试验的响应来计算z得分（更多详细信息，请参见Katzner 等人[ 2009 ]的图1 ）。

准确确定风车中心的步骤
以下3个步骤可确保针对PC的高精度：（1）根据血管图确定PC的初始位置；（2）确保电极的垂直度；以及（3）基于“非正弦” LFP的位置。

根据对准方向图的表面血管图案初步识别风车中心（请参见图2A和2B）。
请确保电极贯穿垂直于皮质表面。为了确保电极渗透垂直于皮质表面，额外的努力必须消耗（图URES 3A -3 C）.Firs 吨，以确保摄像机的角度为精确地垂直于平面皮层，图像的大视场（的例如，1cm）的与场的窄深度（〜50 微米，由前至前透镜与F1.2 [ 拉茨拉夫和格林瓦尔德，1991 ]）。然后，我们得到α偏角值（α ，如图3D 所示）。调整了Narishige 立体定位仪（其机械精度约为10 µm）中的夹紧装置（夹紧电极）的偏角，使其等于α 值，以确保电极平行恰好光学imaging.Using此过程的轴线，我们估计，从电极的垂直偏差小于2度（图中所示的URE 3D）。

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3.插图图电极的背离垂直作者一个。黄点是10个穿凿的位置。橙色框是ROI（关注区域）的硼。硼。用细尖电极，有一个非常小的皮层。变形当电极插入比例尺在（A）和（B）：500 Myuemu 。ç 。我们设计了一个镜头（105毫米），近距离管生产工作距离17厘米，这使得有足够的距离为了使电极穿透获得images.D 。电极被保持平行于光轴正好在相同的角度CCD照相机holder.The对准电极轴的光轴与线之间的夹角垂直于皮质（Δα ）是Δα = actan （field_depth / field_length ）。由于我们的景深约为50μm，并且视场为几毫米，因此我们估计Δα小于2度。

基于“非正弦” LFP选择站点。
在表层（深度< 600 Myu M ）内的近似PC处或附近穿透，并记录LFP方向调整曲线并拟合正弦波函数，然后计算该正弦波的非正弦指数（NSI）。分析重复此操作在非常局部地区有几个穿凿（约200-500 MYU 中号直径周围区域初步PC），直到非类正弦曲线LFP得到（NSI> 0.10）。说明：根据我们最近的工作（李等人，2019 ），我们证明了真正的电脑有“非正弦像”个LFP（NSI> 0.1），虽然位置远离电脑展品“类正弦”个LFP （李等人，2019）。图图4A 和图4 B显示了一个错误的PC站点。记录的LFP方向调谐曲线（4A）是正弦形（NSI = 0），并且该穿透（4B）中的几个单个单元记录的方向散射较低（MOS = 18度）。图小号4C 和4个d节目a'true” PC site.The记录LFP取向调谐曲线（图4C）是非正弦状（NSI = 0.34）和几个单独的单元记录（4D）具有较高的方向散射（MOS = 65°），是PC的一致标记（Maldonado et al。，1997）。在26个站点中，我们发现NSI和MOS之间存在很强的正相关关系（如图所示）URE 1F在参考文献[ 李等人，2019 ];当NSI> 0.1时，MOS> 60°）因此NSI的LFP> 0.1提供了风车状中心的精确定位。

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4.对比图LFP和单一单位录音在真PC网站及假PC站点。阿。的类正弦LFP取向调整实施例在假PC站点（NSI = 0，高类正弦）。乙。单机记录（四神经元）相同渗透作为A的MOS在这些细胞中18 ° 。ç 。一个例子的非类正弦LFP取向的调谐曲线在真PC网站（NSI = 0.34）。d 。单机记录（四个神经元）的渗透率与C相同。这些细胞中的MOS为65 ° 。

记录非正弦位置的位置。这是第一个PC位置（图2C中的点1）。
重复步骤d 3 一- D3B ，并获得（在图2C中2点）相邻的PC的位置。

确定DP和DM位置的步骤
通过计算在步骤D中确定的两台PC的几何中点来确定域点（DP）（请参见图2C）。
通过计算PC和DP的几何中点来确定域中点（DM）（请参见图2C）。
注意：DM和DP是非PC站点，并且都具有类似正弦的LFP。

进行定向子域的电生理研究
一旦确定了这些关键的定向域锚点（PC，DP，DM ），就可以继续进行定向子域的电生理表征。

数据分析

计算LFP曲线的NSI
放置电极，记录一个单位并定位其接收场，通过在8个方向上显示光栅来确定LFP在该位置的方向调谐曲线（见图4A和4C ）。将LFP曲线拟合为正弦模型。ç 0 表示LFP取向的调谐曲线，其由k个Samplepoints ，即，（X 1 ，ç 0 （X 1 ）），（X 2 ，ç 0 （X 2 ）），...，（X ķ ，ç 0 （X ķ ））。拟合曲线被表示为通过C' 0 。
计算拟合误差（q 0 ）。

获取替代曲线（c ^ 1 至ç 1000 通过随机洗牌的LFP曲线的K个样本点1000次，并）calutating 替代曲线（的拟合误差q 1 到q 1000 ）。
Calulate 的NSI.The 被定义为p-value.It 为高度正弦状和1作为高度非正弦like.The百分比范围从0到1，其中0 q Ĵ 其是小于q 0 。

其中n是小于q 0 的q j个值的数量。

致谢

这项工作得到了国家重大研究计划（2018YFB1305101、2015AA020515、2013CB 329401）和中国自然科学基金（81430010、91420302和31627802）的支持。

利益争夺

作者宣称他们没有竞争利益。

伦理

本研究严格按照《美国国家卫生研究院实验动物的护理和使用指南》中的建议进行，并经中国科学院上海生物科学研究所动物实验伦理委员会批准。科学（许可证号ERSIBS-621001C）。

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