材料和试剂

1. C57BL6 / J雄性小鼠（8-16周大，意大利Charles River Laboratories，意大利）/遗传小鼠模型

注意：我t是也可以使用动情状态以及其它小鼠品系的评估后雌性C57BL6 / J小鼠（8-16周龄）没有任何机车运动障碍。

2. 食品增强剂（14毫克，5TUL，TestDiet，里士满，印第安纳州）

3. 乙醇10％

设备

T型迷宫装置
T型迷宫装置由透明的有机玻璃（0.5厘米厚；小巷的尺寸：40 x 10.2 x 17.5厘米）制成。光照强度为：主小巷为20±2 lux，侧面为10±2 lux小巷）。每个侧巷子的末端都有一个凹入的杯子，看不见食物强化物。此外，要小心删除动物可以用来指导选择的所有视觉线索：在没有任何视觉标志或窗户的房间内进行行为研究（图1）。

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图1. T型迷宫装置。照片显示了Leggio 等人使用的T型迷宫的俯视图（A），正视图（B）和侧视图（C）。（2019）。

软件

使用GraphPad Prism软件（美国GraphPad软件）进行统计分析和绘制图稿。

程序

在离散配对试验的可变时延T迷宫任务中，将小鼠暴露于一系列随机选择的强制奔跑中，每只小鼠随后进行一次选择奔跑，以便要求它们将在线保存的信息（强制奔跑）与所学习的规则相结合。（与样品不匹配）（Papaleo 等，201 2 ）。单身居住一周后，连续3天记录体重和24小时食物摄入量。然后在整个实验期间限制动物的食物，以保持其随意体重的90％。在禁食的第一周，每只动物还要连续三天习惯使用食物强化剂（14 mg，5TUL，TestDiet，Richmond，IN）。此后，使动物习惯于T型迷宫设备，连续10天/天以10分钟/天的速度恢复食物。此后，将动物暴露于10次强制交替运行的1天。将动物放在T型迷宫中，一只守门员臂关闭，最多需要2分钟的时间才能在敞开的胳膊中找到并吃掉食物强化剂。食用食物颗粒后，将每只小鼠在家庭笼子中进行至少20分钟的审判，然后放回迷宫中进行另一次强制奔跑。从第二天开始，离散试验延迟交替训练开始。在随机选择的强制运行以及在家用笼中有4 s的延迟间隔后，将鼠标放回迷宫中，可以接触到两只手臂。食物强化剂位于上一次强制试验中输入的对侧臂中。试用期为20分钟后，将动物放回迷宫中进行另一项强制选择选择配对试验，每天总共进行十次配对试验。每天使用不同的伪随机选择强制运行模式（例如RRLRLL-RL-RL），但在给定的一天，所有动物都使用相同的模式。每次试验后，必须用水和10％的乙醇清洁设备，并特别注意T迷宫的选择点。对小鼠进行4 s的运行间隔延迟和20分钟的试验间隔延迟进行训练，持续20天，或者直到鼠标连续3天成功执行10次每日试验中的8次正确（80％选择准确性）。达到此标准的动物将被淘汰。一旦鼠标以4 s的运行间隔延迟一致地运行，就开始以三个附加的运行间隔延迟（以随机方式呈现30、60和240 s）进行训练，并开始20 s的试验间隔延迟。在连续的4天测试中，对小鼠进行4次每个延迟的试验，每天总共进行16次试验。

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图2.离散成对的可变延迟T型迷宫任务的时间线。培训：每个离散试验都包括一个强制选择跑对（两次间延迟4 s，一次间延迟15-20 m）；评判标准：连续三天（每天10次配对试验）有80％的正确选择；最终阶段：审判内延迟4 s，30 s，60 s和240 s，审判间延迟20 s（连续四天每天16次配对/天）（Papaleo 等人，2012 ；Leggio 等人。，2019）。

分步协议

第1天：5 ：00 PM ：w ^ 八单独容纳每个鼠标。处理1分钟（H1）。更换笼子，水，过滤器和食物。
第2天：š ingly壳体习惯。
第3天：š ingly壳体习惯。处理1分钟（H2）。
第4天：š ingly壳体习惯。
第5天：š ingly壳体习惯。处理1分钟（H3）。
第6天：š ingly壳体习惯。
第7天：š ingly壳体习惯。
第8天：š ingly壳体习惯。
第9天：一个回合5:00 PM 权衡食品和每个鼠标。
第10天：甲回合5:00 PM ，称量每只小鼠和食（24小时摄入）
第11天：甲回合5:00 PM ，称量每只小鼠和食（24小时摄入量）。拿掉所有食物，放开水。更换笼子，过滤器和水。
第12天：5:00 PM ，动物是部分食品被剥夺，并保持整个实验的方式。摄入约其24小时摄入量的60％。检查嵌套状态。
第13天：5:00 PM 。摄入约其24小时摄入量的60％。达到其初始重量的90％。
第14天：5:00 PM 。摄入约其24小时摄入量的60％。达到其初始重量的90％。
还要放入有益的食物（约10粒5TUL 14毫克）。

15日：5:00 PM 。给予其24小时摄入量的60％。还要放入有益的食物（约10粒，每粒14毫克）。达到其初始重量的90％。
16日：5:00 PM 。给予其24小时摄入量的60％。还要放入有益的食物（10粒，每粒14毫克）。达到其初始重量的90％。

居住期：

第17天：允许所有老鼠抬起所有门，探索迷宫10分钟。将食物放入两个目标臂中。量化吃1个需要的时间ST 颗粒。他们必须吃掉所有提供的食物（最多16粒；每个目标臂2粒）。
第18天：允许所有老鼠抬起所有门，探索迷宫10分钟。将食物放入两个目标臂中。量化吃1个需要的时间ST 颗粒。他们必须吃掉所有提供的食物（最多20粒；每个目标臂2粒）。
第19天：将动物暴露于10次强迫交替的第1天。具体来说，将它们放在T形迷宫中，一个门臂闭合，最多2分钟即可在开放臂中运行并吃掉奖励（开放臂中只有一个药丸）。消耗完奖励后，将它们从迷宫中移出，每只老鼠进行一次试验。在大约10个笼子里进行实验。小鼠背对背进行测试。手臂末端有一颗药丸。
天20- d 着y 39：离散配对试验推迟交替训练
每个离散试验均包含一个强制选择运行对。
对于强制奔跑，必须限制动物进入随机选择的手臂。当他们在那条手臂上消耗了奖励（动物吃完食物后立即开始计时）和4 s的保留间隔（这4 s的时间被视为完成此过程所记录的时间的平均值，另请参见Kellendonk 等）等人，2006），将每只小鼠放回迷宫中，可以接触到两只手臂，但在先前的强制诱饵中只有另一只手臂进入。在强行诱饵下，胡同中有1颗药丸；在自由选择的条件下，诱饵诱捕2粒正确的胡同。在大约15-20分钟的试验间隔后，以避免来自上次试验的主动干预（Kellendonk 等，2006），将小鼠放回迷宫中进行另一次强制性奔跑。在房间中连续测试小鼠。
每天使用不同的，随机选择的强制运行模式（例如RRLRLLRLRL）。但是，在给定的一天，所有动物都使用相同的模式。对动物进行20天的运行间隔延迟训练，持续20天，或者直到它们连续3天成功执行了十分之八的试验（正确选择的80％）。不符合此标准的动物将被拒绝。
光周期：6-6。习惯约为8 ：45 AM 。从9测试：45 AM 〜5 ：00 PM 补料动物约5 ：00 PM。
第40天或更早：一旦动物在4 s 的跑步间隔内表现稳定，就开始以另外三个延迟（30、60和240 s）进行训练，而试验间的延迟仅为20 s。连续4天对小鼠进行所有4 次运行间延迟测试，连续16天每天进行16次配对试验（每天每次延迟4次配对试验）。

注意：由于对每只小鼠进行了至少45分钟的多次试验（16对配对试验），因此对动物造成压力。相反，在范式的训练阶段，每只小鼠每天进行10对配对试验，试验间隔为10分钟。

数据分析

所有数据通常都呈正态分布，然后接受参数测试（单向或双向方差分析（ANOVA）和双向ANOVA，并在适当时进行重复测量）。
可以执行Grubbs测试来识别异常值（Leggio 等人，2019，补充信息）。
延迟吃1个第一颗粒（在SE conds，d AY 小号17-18）经由双向重复测量（RM）方差分析典型地分析，以揭示主效应和相互作用（例如，基因型× 然后通过合适的日）交-hoc 测试，用于成对比较，例如Newman-Keuls测试。天达到标准（以天为单位，d AY 小号20-39）在训练阶段期间可通过不成对（两个取样值）t-检验或单向ANOVA揭示主效应（被分析例如根据，基因型或治疗）实验组的数量（两个以上）。最后，通常还会通过双向RM ANOVA分析最终阶段（第40天或更早）的正确选择的百分比（作为工作记忆的指标），以揭示主要影响和相互作用（例如，基因型× 延迟），然后进行适当的事后测试。
图3中的图表显示了进食延迟（A），达到标准的天数（B），以及在任务期间野生型（WT）和敲除小鼠同窝仔（此处为Dys +/- 小鼠）进行的正确选择（％，C）（改编自Leggio et al。，2019）。两组了解到类似奔驰进入迷宫来获取报酬，由延迟的显著降低所表明在第二天吃（d 着y 18）暴露于比第一天的奖励（d 着y 17）。此外，两组都需要相同的天数才能连续3天达到正确选择的80％的标准。然而，尽管两组都表现出延迟依赖性行为（随着延迟时间的延长，错误逐渐增加），但在运行内延迟时间为4和30 s时，Dys +/- 小鼠比WT小鼠表现出明显的工作记忆缺陷。

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图3. WT（n = 12）和Dys +/- （n = 10）小鼠在离散的成对配对可变延迟T迷宫任务中进行了测试。一。检索奖励的延迟（基因型F （1，20 ）= 4.982，P = 0.0372; 天F （1，20 ）= 68.04，P <0.0001，基因型× 天F （1，20 ）= 5.37，P = 0.031; 事后：** P <0.01，相对于。第17天）。乙。达到标准所需的天数（P = 0.88）。Ç 。正确选择的百分比，具有不同的随机出现的运行中延迟（4、30、60 和240 s）和审判间隔20 s（基因型F （1，20 ）= 5.95，P = 0.0241; 延迟F （ 3，60）= 14.93，P <0.0001，基因型× 延迟˚F （3，60）= 0.65，P = 0.58; 事后：* P <0.05，与。每个WT时间点）。这些数值是平均值±SEM （一个从Leggio dapted 等人，2019 ）。

图4中的图形显示了通过聚类不同实验而获得的C57B16 / J WT小鼠（n = 46）的数据分布。延迟吃（A），天数的标准（B），和正确的选择（％，C），该C57BL6 / J野生型任务期间执行（一个从帕帕莱奥dapted 等人，2008 和2014; Leggio 等。，2019）。

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图4. 通过对不同实验进行聚类获得的C57B16 / J WT小鼠（n = 46）的数据分布。一。检索奖励的延迟（配对t 检验； *** P <0.001）。乙。d AYS需要达到的标准。Ç 。P 的不同随机赠送帧内运行延迟（4，30，60，和240秒）和20秒的审间延迟（正确选择ercentage 延迟˚F （3，180）= 22.49，P <0.0001）。值是平均值± SEM 。（一个从帕帕莱奥dapted 。等人，2008 和2014; Leggio 。等人，2019 ）。

笔记

在整个实验过程中，动物都禁食以维持其90％的随意体重。维持90％的小鼠初始体重至关重要。不保持这种体重状况的小鼠趋向于减慢速度或不进入迷宫。
研究人员在此行为任务中应测试的理想小鼠数是10-12。在同一实验中测试更多的动物可能具有挑战性，因为日常过程的时间较长，主要是在测试的最后阶段（每只小鼠45-60分钟）。
在实验过程中，研究人员应避免将鼠标放在笼子的网格上。鼠标从家用笼中拿起并将其直接放置到迷宫的起始位置时，压力较小。

致谢

我们感谢M. Morini，D。Cantatore，R。Navone，G。Pruzzo，A。Parodi，A。Monteforte和C. Chiabrera的技术支持。这项工作得到了意大利技术大学，卡塔尼亚大学，脑与行为研究基金会（2015 NARSAD 23234）和西班牙圣保罗（2015-0321）的资助。所描述的方法先前已在Leggio 等人中使用。（2019）。

利益争夺

作者宣称他们没有竞争利益。

伦理

根据使用相关方法进行的研究选择动物样本大小，该样本大小与本领域中通常使用的大小相似。没有使用随机化将动物分配给实验组，研究者对动物的基因型视而不见。所有实验均根据欧盟指令2010/63 / EU以及卡塔尼亚大学和意大利理工学院（IIT）的机构动物护理和使用委员会进行。

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