材料和试剂

1. 50米升离心管中（Corning，目录号：CLS430829）

2. 1.5 ml微型管（Axygen ，目录号：MCT150-CS）

3. 移液器技巧10 μ升，200 μ 升和1000 μ 升（爱思进，产品目录号：T-400，T-200-Y和T-1000-B）

4. FACS管（FALCON，目录号：352058）

5. 40 μ 米细胞滤网（FALCON，目录号：352340）

6. 细胞计数室（Nexcelom Bioscience，目录号：CHT4-SD100）

7. 0.2 μ 中号的Nalgene 注射器过滤器（赛默飞世尔科技，产品目录号：725-2520）

8. 50 毫升注射器（T ERUMO ，目录号：SS-50LE）

9. 1 毫升无针注射器（T ERUMO ，目录号：SS-01T）

10. 27克x ½英寸针头（T ERUMO ，目录号：NN-2713R）

11. 显微镜载玻片（Thermo Fisher Scientific，目录号：J1801ASH）

12. 玻璃盖（Thermo Fisher Scientific，目录号：102222和102240 ）

13. 用于制备供体细胞的三个月大的雌性FVB 小鼠（作为供体，由澳门大学健康科学学院动物设施核心提供）

14. 三周大的处女雌性裸鼠（作为受体，由澳门大学健康科学学院动物设施核心提供）

15. DMEM / F12培养基（Thermo Fisher Scientific，目录号：11330032）

16. 胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，目录号：26140079）

17. HBSS（Thermo Fisher Scientific，目录号：14140112）

18. 氢化可的松（Sigma-Aldrich，目录号：H0888）

19. 胰岛素（Sigma-Aldrich，目录号：91077C）

20. EGF（Thermo Fisher Scientific，目录号：PHG0313）

21. 霍乱毒素（Sigma-Aldrich，目录号：C8052）

22. 3型胶原酶（沃辛顿生物化学公司，目录号：LS004183）

23. 透明质酸酶（Sigma-Aldrich，目录号：H3506）

24. Dispase II（Roche，目录号：04942078001）

25. 脱氧核糖核酸酶I（沃辛顿生物化学公司，目录号：LS002145）

26. HEPES（1百万）（Thermo Fisher Scientific，目录号：15630080）

27. DPBS（Thermo Fisher Scientific，目录号：14190250）

28. 0.25％胰蛋白酶-EDTA（Thermo Fisher Scientific，目录号：25200056）

29. 1x RBC裂解缓冲液（Thermo Fisher Scientific，目录号：00-4333-57）

30. EasySeq 小鼠上皮细胞富集试剂盒（STEMCELL Technologies，目录号：19868）

31. 台盼蓝（STEMCELL Technologies，目录号：07050）

32. 抗小鼠CD24-PE-Cy7抗体（BD Biosciences，目录号：560536）

33. 抗小鼠CD29-APC抗体（Biolegend ，目录号：102216）

34. DAPI溶液（1毫克/毫升）（Thermo Fisher Scientific，目录号：62248）

35. 牛白蛋白（BSA）（VWR LIFE SCIENCE，目录号：VWRV0332）

36. EDTA（0.5 M），pH 8.0（Thermo Fisher Scientific，目录号：AM9260G）

37. DPBS（Thermo Fisher Scientific，目录号：14190250）

38. PBS片剂（Thermo Fisher Scientific，目录号：18912014）

39. 2,2,2-三溴乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：T48402）

40. 2-甲基-2-丁醇（Sigma-Aldrich，目录号：152463）

41. 乙醇（西格玛奥德里奇，目录号：E7023）

42. 氯仿（Sigma-Aldrich，目录号：C2432）

43. 乙酸（西格玛奥德里奇，目录号：A6283）

44. 胭脂红（Sigma-Aldrich，目录号：C1022）

45. 硫酸铝钾（Sigma-Aldrich，目录号：A7210）

46. 二甲苯（Sigma-Aldrich，目录号：214736）

47. DPX 封固（Sigma-Aldrich公司，目录号：O6522）

48. 植入缓冲液（请参见食谱）

49. 麻醉药（Avertin ，请参阅食谱）

50. Carnoy的修复缓冲区（请参阅食谱）

51. 胭脂红-铝染色液（请参见食谱）

设备

1. 无菌剪刀和镊子

2. 胶带（约束老鼠）

3. 伤口闭合器（RWD，目录号：12020-09 ）

4. 9毫米伤口夹（RWD，目录号：12022-09 ）

5. 保温垫（Lab Animal Technology Develop Co.，目录号：LAT-BW2）

6. 移液器

7. 用于细胞培养工作的生物安全柜

8. 化学罩

9. 带有适配器的离心机，用于室温下使用的50 ml离心管和FACS管。

10. EasySep 磁铁（STEMCE LL Technologies ，目录号：18000）

11. 细胞计数器（Nexcelom Bioscience公司，型号：Ç ELLO 米自动2000）

12. BD FACSAria III用于细胞分选

13. Leica-M165FC体视显微镜

14. 电磁搅拌器（IKA，RH基础）

软件

1. BD FACSAria III的BD FACSDiva 6.1

2. ImageJ

程序

准备供体MG细胞（详细信息请参见Sun 等人，2020年）
1. 牺牲供体雌性小鼠，并在清洁和无菌条件下取出第四只腹股沟MG。

2. 将MG消化成单个细胞。简而言之，将乳腺切碎，在DPBS中洗涤，然后在DMEM / F-12中消化，其中含有ed 300单位/ ml胶原酶III，100单位/ ml透明质酸酶，5％FBS，5μg / ml胰岛素，10 ng / ml EGF，20 ng / ml 霍乱毒素和500 ng / ml氢化可的松，在37°C，5％CO 2 下约1小时。将所得的类器官悬浮液依次重悬于补充有5 mg / ml 分散酶II和0.1 mg / ml DNase I的DMEM / F-12中，在37°C下悬浮5分钟，然后用0.25％胰蛋白酶-EDTA消化2分钟，并用RBC裂解缓冲液处理3 MI n至通过40-过滤之前取出的红血细胞μ 米细胞过滤器以获得单细胞悬浮液。

3. 根据制造商使用EasySeq 小鼠上皮细胞富集试剂盒富集上皮细胞，并用抗小鼠CD24-PE-Cy7抗体（1：200），抗小鼠CD29-APC抗体（1：200）对MG细胞进行染色）和DAPI（1 μ 克/毫升）的FA CS缓冲液I ñ冰上30分钟。

4.分别选出DAPI - CD24 Mid CD29 Hi （基底细胞）和DAPI - CD24 Hi CD29 Lo （腔细胞）细胞作为供体细胞。

5. 洗涤用DPBS，并将细胞重新悬浮细胞以给定的浓度（10 μ 升细胞/脂肪垫）与注入缓冲液（配方1）。

清除雌性小鼠的脂肪垫
1. 用Avertin（配方2）（腹膜内注射，剂量为250 mg / kg体重）麻醉一只3周大的雌性裸鼠。选择麦克风Ë那些AR Ë < 12克确保乳腺导管增长尚未启动。

2. 通过使用胶带将其四肢粘在泡沫表面上来牢固地束缚小鼠的腹部。（图1A）。

3. 用70％的酒精消毒腹部。

4. 用镊子在骨盆上方几毫米处抓住皮肤，然后将其从腹部提起。让AP arallel切口沿着鼠标的腹部（约10mm），而不刺破腹膜与SCI ssors和镊子。

5. 然后从中线切口的底部到腿上方的臀部区域进行Y型切口。使用镊子将皮肤从腹膜拉出，露出乳腺（图1B）。

6. 切断第四乳腺和第五乳腺之间的桥，以防止第五乳腺的上皮生长到第四块清除的脂肪垫中。

7. 用剪刀在结节腹侧（乳头侧）附近切开第四乳腺的脂肪垫。然后除去带有淋巴结和乳头的脂肪垫部分，并将其余部分留作清除的脂肪垫，以便以后用于MG细胞植入（图1B-1D）。

8. 将取出的乳腺切片放在显微镜载玻片上，以固定并在以后用胭脂红染色，以确认已除去整个基本的上皮芽。

9. 如果需要，在对侧乳腺上重复步骤B6-B8。

将供体MG 细胞植入清除的脂肪垫中
1. 清除乳腺脂肪垫后，直接注入MG细胞（10 μ 升从程序A制备成的脂肪垫的剩余部分）通过使用1 ml的注射器用27G X ½ ”针（图小号1E和1F）。

2. 用伤口夹闭合皮肤切口（图1G）。

3. 将鼠标放在加热垫上，直到恢复意识。并保持监视鼠标长达1周的任何感染或其他手术并发症的迹象。

D：\ Reformatting \ 2020-5-6 \ 1902806--1328 Heng Sun 828902 \ Figs jpg \ Figure.1.jpg

图1. 手术过程。答：麻醉的老鼠被约束在泡沫表面。B.暴露第四个乳腺（标明了淋巴结和切割线的位置）。C.示意图显示了乳头，淋巴结（标记为“ N”）和切割线的位置。D.将MG分为两部分，蓝色圆圈部分w 将被移除，绿色圆圈部分为清除的脂肪垫。E. Injecte 供体细胞进入清除的脂肪垫。F.将清除的脂肪垫植入MG细胞。G.用伤口夹闭合切口。

去除，修复和弄脏MG
1. 植入后约8至10周，处死受体小鼠，解剖第四个MG（与步骤B中的操作类似，只需除去所有的脂肪垫）。

2. 将整个MG转移到显微镜载玻片上，并用钝头镊子将MG尽可能分散在载玻片上，而不会损坏组织。

3. 在室温下将MG放在幻灯片上5分钟，以使MG粘附在玻璃表面上。

4. 将载玻片浸入装有Carnoy 固定缓冲液（配方3 ）的50 ml 离心管中，然后在室温下将组织固定过夜。

5. 用70％乙醇洗涤玻片30分钟，然后用50％，30％乙醇和PBS 洗涤玻片10分钟。

6. 用胭脂红-铝染色液（配方4）将MG 染色于4 ℃下过夜。

注意：染色可以持续数天。

7. 通过用梯度乙醇洗涤玻片使MG脱水（每种浓度分别为70％，95％，100％，15分钟）。

8. 将MG在室温下的化学通风橱中浸入二甲苯中过夜，以去除脂肪组织。

9. 将带有Permout的载玻片安装在化学防护罩中，以便长期保存。

评估MG的形成效率
1. 使用Leica-M165FC体视显微镜拍摄染色的整个安装座。

2. 通过使用ImageJ分析图片来测量重建的上皮和整个支架的大小。

3. 计算上皮树大小与整个安装大小的比率，以指示MG形成效率。

数据分析

乳腺形成效率可以通过乳腺上皮树的分支程度来评估。ImageJ可以分析染色的整个安装座的图片。门上皮树的面积，并计算大小为A（图2）；然后门安装装置整体的面积，并计算尺寸B.然后，MG形成效率可以通过A / B的比值，其范围从0至进行定量1 （0 米EANS没有MG形成和1只表示整个重建MG）。图2显示了具有不同功效。

D：\ Reformatting \ 2020-5-6 \ 1902806--1328 Heng Sun 828902 \ Figs jpg \ Figure.2.jpg

图2.重建乳腺的例子。MG形成效率计算为上皮树尺寸与整个支架尺寸的比率。上皮树的面积表示为黄色圆圈。顶部的2个MG是从2,000个基础细胞的植入中重建而来的，底部的MG在植入2,000个腔细胞后没有显示上皮树的形成。植入后将受体小鼠保持8周。

笔记

1. 受体小鼠的年龄和体重对于实验非常重要。选择体重小于12 g的3周龄纯种雌性小鼠，以确保尚未开始乳腺导管生长。

2. 该注入缓冲液和细胞类型可大大地影响MG形成效率。我们发现添加基质胶（30％-50％）代替FBS可以提高MG的形成效率。

3. 根据客户的要求调整MG细胞浓度，因为只有大约10-20 微升的细胞的可植入在清除脂肪垫中。例如，如果要植入2,000个细胞，请在植入缓冲液中将细胞浓度设为2 x 10 5个细胞/ ml ，然后每个吸盘注入10μl 细胞。

4. 根据MG 的厚度，在4 °C的条件下，用c型鼠血清染色剂将MG 染色过夜至几天。当红色染料穿透整个支架时，染色可能会终止。

菜谱

1. 植入缓冲液（1毫升）

0.6 ml DMEM / F12培养基

0.3毫升胎牛血清

0.1毫升0.4％台盼蓝

台盼蓝用于指示细胞是否成功注射，因为体积非常有限

2. Avertin（200毫升）

通过使用磁力搅拌器在黑暗中过夜，将2.5 g 2,2,2-三溴乙醇与5 ml 2-甲基-2-丁醇溶解
然后加入195 ml PBS并充分混合。通过过滤混合物0.2 微米的Nalgene 注射器过滤器
Avertin可以在4 °C 的黑暗环境中放置几个月
3. Carnoy的定型缓冲液（500毫升）

300毫升乙醇

150毫升氯仿

50毫升乙酸

4. 胭脂红染色液（500毫升）

将1克胭脂红和2.5克硫酸铝钾添加到500毫升软化的H 2 O中
煮沸混合物，使其冷却至室温后再使用
胭脂红染色液可以在室温下保存，最多可重复使用三次

致谢

该协议改编自我们之前的工作（Sun 等人，2018年），由中国澳门特别行政区澳门大学格兰特CPG教授2017-00016-FHS和Startup Research Grant SRG 2017-00045-FHS支持，澳门科技发展基金资助065/2015 / A2和094/2015 / A3，国家自然科学基金资助81602587。

利益争夺

作者声明，他们没有利益冲突。

伦理

澳门大学动物伦理委员会已根据协议UMAEC-050-2015 批准了涉及小鼠的实验方案。

参考资料

1. Hennighausen ，L.和Robinson，GW（2005）。乳腺信息网络。Nat Rev Mol Cell Biol 6（9）：715-725。

2. 普拉特（马里兰州），珀蒂（V.），阿拉斯加尔·拉塞尔（I.），吉拉迪（R.R.），谢哈塔（Hehata），M。，梅农（Me.N.），舒尔特（R.），卡拉伊奇奇（I.），拉特（N.），拉特（N.），奥尔森（MF）， Metzger，D.，Faraldo ，MM，Deugnier ，MA，Glukhova ，MA和Stingl ，J.（2014年）。乳干细胞具有肌上皮细胞特性。Nat Cell Biol 16（10）：942-950、941-947。

3. Sun，H.，Xu，X.和Deng，C.（2020）。从小鼠乳腺制备单个上皮细胞悬液。生物协议10（4）：e3530。

4. Sun，H.，Miao，Z.，Zhang，X.，Chan，UI，Su ，SM，Guo，S.，Wong，CKH，Xu，X. and Deng，CX（2018）。单细胞RNA-Seq揭示了小鼠乳腺上皮细胞的异质性和层次。生物化学杂志293（22）：8315-8329。

5. Van Keymeulen ，A.，Rocha，AS，Ousset ，M.，Beck，B.，Bouvencourt ，G.，Rock，J.，Sharma，N.，Dekoninck ，S。和Blanpain ，C。（2011）。不同的干细胞有助于乳腺的发育和维持。自然479（7372）：189-193。

6. Wang，D.，Cai C.，Dong，X.，Yu，QC，Zhang，XO，Yang，L. and Zeng，YA（2015）。通过蛋白C受体表达鉴定多能性乳腺干细胞。自然517（7532）：81-84。