材料和试剂

深孔96孔模块或用于从FPLC收集馏分的替代方法
0.22 微米过滤器
˚F Ø [R大容量：Millipore公司，目录号：SE1M179M6

小批量：密理博，目录号：SLGV033RS

流动室用玻璃盖玻片（Ibidi ，目录号：10812）
锡纸
铝箔
1.5 ml Eppendorf管
PCR试管（Sigma-Aldrich，目录号：CLS3744）
巴斯德塑料移液管或塑料管（Celltreat Scientific，目录号：229276）
塑料管
Superdex 200增加10/300 GL色谱柱（Sigma - Aldrich，目录号：GE28-9909-44）
HiPrep 26/10脱盐柱（GE Healthcare，目录号：45-000-266）
玻璃瓶（Thermo Fisher Scientific，目录号：B7800-2）
用钳子或坚固的电线从热水浴中转移Coplin 罐。
巴斯德移液器（Thermo Fisher Scientific，目录号：13-678-20A）
用于表达LOV2的质粒（pDT552; F rom Tischer and Wiener，2019）
该质粒表达融合蛋白10xHis-TEV-AviTag-KCK-LOV2（V529N）。在此，V529N表示来自Avena的全长wt phototropin 1蛋白的突变苜蓿。LOV2是指此蛋白质的第二个LOV域。TEV表示烟草蚀刻病毒蛋白酶的切割位点。AviTag 是一种15个氨基酸的标签，可以通过大肠杆菌生物素连接酶BirA 进行生物素化。KCK是使半胱氨酸成为更强亲核试剂的三肽标签；这有助于用马来酰亚胺偶联的染料在LOV2活性位点半胱氨酸上优先标记该位点。将该构建体克隆到修饰的pETM11-SUMO3质粒主链中。

用于表达Zdk的质粒（pDT482;来自Tischer and Wiener，2019）
该质粒表达融合蛋白10xHis-SUMO3-KCK-SpyCatcher-Zdk1。SUMO3是被SenP2蛋白酶识别的人SUMO3结构域，该酶在该结构域的C末端切割。KCK是使半胱氨酸成为更强亲核试剂的三肽标签；这使半胱氨酸对马来酰亚胺偶联的染料更具反应性。该抓间谍者域不用于当前应用程序，但允许翻译后融合到所需含目标间谍标签。Zdk1是LOV2的工程绑定伙伴。将该构建体克隆到修饰的pETM11-SUMO3质粒主链中。

液氮
LB肉汤（Sigma - Aldrich，目录号：L3522）
卡那霉素（Goldbio ，目录号：K-120-10）
异丙基-β-D- 硫代半乳糖苷（IPTG; Sigma - Aldrich，目录号：I6758）
生物素（Sigma - Aldrich，目录号：B4639）
黄素单核苷酸（FMN; Bio- R ad，目录号：161-0501）
甲醇（Sigma - Aldrich，目录号：179337）
流动室粘顶布（伊比迪（Ibidi），目录号：80608）
POPC（Avanti极性脂质，目录号：850457C）
PEG-PE（Avanti极性脂质，目录号：880230C）
生物素CAP PE（Avanti极性脂质，目录号：870277X）
Alexa Fluor 488 C5马来酰亚胺（Thermo Fisher Scientific，目录号：A10254）
磺基花青3 马来酰亚胺（Lumiprobe ，目录号：11380）
黄素单核苷酸（B io -R ad ，目录号：161-0501）
无水DMSO（Thermo Fisher Scientific，目录号：D12345）
氯仿（电子显微镜科学，目录号：12550）
D PBS（Thermo Fisher Scientific，目录号：14190144）
Hellmanex III（Sigma-Aldrich，目录号：Z805939）
丙酮（Sigma-Aldrich，目录号534064-4L）
190标准乙醇（Koptec ，目录号：V1101）
KOH（Fisher，货号：P251）
过氧化氢（Fisher Scientific，目录号：H325-500）
HCl（Acros ，目录号：42379-5000）
链霉亲和素（Rockland，目录号：S000-01）
ProLong Live Antifade试剂（Thermo Fisher Scientific，目录号：P36975）
Roche cOmplete Mini，不含EDTA的蛋白酶抑制剂片剂（Sigma - Aldrich，目录号：11836170001）
NaOH（Fis 她，货号：19232）
KH 2 PO 4 （Sigma - Aldrich，目录号：P5379）
K 2 HPO 4
NaCl（Sigma - Aldri ch，目录号：793566）
的β- 巯基乙醇（βME ;费舍尔，目录号：34461）
I 咪唑（Fisher，目录号：O3196-500）
N-（2- 羟乙基）哌嗪-N'-（2-乙磺酸）（HEP ES; Sigma-Aldrich，目录号：H3375-250G）
KCl （Fisher，目录号：S77375-1）
三（2- 羧乙基）膦（TCEP; Thermo，目录号：20491）
胰蛋白（（BD B iosciences，目录号：211705）
酵母提取物（BD B iosciences，目录号：288620）
甘油（Fisher，目录号：BP229）
β-酪蛋白（Fisher，目录号：11461422）
苯甲基磺酰氟（PMSF;皮尔斯（Pierce），目录号：36978）
的6xHis-TEV蛋白酶（来自重组制备的大肠杆菌。在房子商业替代品容易得到例如，西格玛- Aldrich公司，目录号：T4455-1KU）
蛋白质浓缩器（Vivaspin 20 MWCO 10,000; GE Life Sciences，目录号：28932360）
二硫苏糖醇（DTT; Sigma - Aldrich，目录号：D9779）
的6xHis-SENP2蛋白酶（来自重组制备的大肠杆菌。在房子的Comme rcial替代是可用例如，Novus公司Biologicals公司，目录号：E-710-050）
压缩惰性气体（压缩氮气；空气，目录号：NI 200）
乙二胺四乙酸（EDTA; Fisher Scientific，目录号：S80007-1）
钴（II）六水合物（氯化钴2· 6H 2 O；Sigma - Aldrich，目录号：255599）
透明指甲油
IMAC绑定缓冲区（请参阅食谱）
IMAC洗脱缓冲液（请参阅配方）
HEPES缓冲盐水（H BS；请参见食谱）
很棒的汤（TB ；请参阅食谱）
DPBS-BB（请参阅食谱）

设备

500毫升烧瓶
2.8升带挡板的烧瓶
热块
1 L玻璃烧杯
温控振荡器，温度范围为37°C至18°C
EmulsiFlex-C3（或其他细胞裂解方法）
AKTA纯25 （GE医疗集团，或类似的FPLC系统）
5 ml HiTrap 螯合柱（GE Healthcare，目录号：17040801）
Milli-Q净水系统（或类似设备）
汉密尔顿注射器（Hamilton Company，Gastight 1700系列，目录号：80265和81165）
玻璃Coplin广口瓶（Sigma-Aldrich，目录号：BR472800）
蠕动泵和管道
真空干燥器
杜恩斯均质机
浴超声仪
台式超速离心机
带有Ti-45转子的地面超速离心机（Beckman Coulter ，型号：Optima L-90 K ）
摆动斗式地板离心机
470 nm LED（Lightspeed Technologies Inc.，型号：HPLS-36）
倒置落射荧光显微镜，非常适合全内反射（TIRF）显微镜（Nikon Eclipse Ti 倒置显微镜）

软件

Microsoft Excel（Microsoft）
斐济（Schindelin 等人，2012年）
微观经理（Edelstein et al。，2014）

程序

LOV2纯化
在500 ml烧瓶中，向200 ml LB Kan（30μg / ml）中接种用表达LOV2和BirA （质粒pDT552）的双顺反子质粒转化的大肠杆菌BL21（DE3 ）。在225 rpm摇动下于37°C过夜生长（> 8 h）。
背稀将100ml过夜培养物到1L TB阚（30 μ 克/毫升）在一个2.8升挡板烧瓶。在37°C下以180 rpm的速度摇动，直到OD 600 （600 nm处的光密度）在0.5-0.6之间。
将温度降低至18°C，等待30分钟，使介质冷却至接近18°C，并诱导IPTG（250 μM ，终浓度）。从储备溶液中，使生物素的终浓度为50μM ，黄素单核苷酸（FMN）的终浓度为1 mM。过夜生长。

注意：在冰上或在4°C下执行所有以后的步骤。

在摆动式离心机（或类似装置）中将沉淀细胞预冷至4°C。丢弃上清液。典型的旋转是800 RCF，持续约10分钟。由于LOV2和FMN辅助因子的高表达，沉淀通常看起来明显为黄色。
使用磅秤和空的离心容器估计湿细胞沉淀的质量。每1 g湿细胞沉淀添加2 ml IMAC结合缓冲液，并剧烈上下移液以粗略悬浮大部分沉淀。
细胞悬液转移（一些块都还可以），以一个杜恩斯均化器是由冰包围并添加一个罗氏完全迷你，无EDTA蛋白酶抑制剂片剂。彻底重悬细胞沉淀，直至其完全匀浆（通常上下约10次下降）。
在EmulsiFlex-C3上裂解细胞之前，立即添加PMSF（苯甲基磺酰氟）至终浓度1 mM。PMSF在水性环境中的半衰期约为30分钟，因此在细胞裂解时添加PMSF非常重要。确保在无水甲醇中制备PMSF库存。如果您认为水可能已经进入您的库存，请制作新鲜的PMSF。可以选择（但不是必需）第二次将裂解液通过EmulsiFlex，以降低其粘度。这样可以使后续加载到IMAC列的速度更快。
在Ti-45转子中以40k rpm在超速离心机中将裂解物在4°C下旋转一小时。倒出并保留上清液。
使用蠕动泵使上清液在装有Co 2+ 并与IMAC结合缓冲液平衡的5 ml HiTrap 螯合柱上再循环。在再循环设置中，来自色谱柱的洗出液应轻轻滴回注入IMAC色谱柱的上清液容器中。确保蠕动泵的入口管在储液罐的底部，以使所有上清液均流过色谱柱。通过在20-30 s的间隔内捕获一些液体来估计流速。典型的是1.5-2.0 ml / min。加载色谱柱的持续时间应可使整个上清液两次通过色谱柱。当LOV2绑定该列时，该列将从上到下明显变为黄色。
将上样的色谱柱转移至AKTA，并用IMAC结合缓冲液洗涤，直到流出液的A 280 小于60 mAu 。以10列的体积梯度洗脱蛋白质（从IMAC结合缓冲液到IMAC洗脱缓冲液），并在96孔深孔板中收集1.5 ml馏分。洗脱后，在IMAC结合缓冲液中平衡色谱柱。
在96孔模块中合并可见的黄色馏分，然后使用HiPrep 26/10脱盐柱将缓冲液交换到IMAC结合缓冲液中。
加入纯化的6xHis-TEV蛋白酶1:10 w / w（重量对重量）TEV：LOV 2，并在锡箔覆盖的4°C下孵育过夜。
注意：TEV蛋白酶在纯化房子，B UT 可以商购获得。

像以前一样，用蠕动泵在HiTrap 螯合柱（可以是用IMAC结合缓冲液平衡后用于洗脱LOV2的柱）上循环消化的LOV2混合物，以除去TEV蛋白酶，游离的His标签和任何未切割的LOV2。在色谱柱上至少循环两次。
收集流出液，并用脱盐柱交换到HEPES缓冲盐水（HBS）中。
用Vivaspin 蛋白浓缩仪浓缩至约4 mg / ml 。
在无水DMSO中制作新鲜的10 mM Alexa Fluor 488 C5马来酰亚胺库存。
在冰上，以2：1 染料：LOV 2 的最终摩尔比将染料添加到蛋白质中，并使反应进行30 s。
用DTT淬灭，终浓度为10 mM。该程序优先在LOV2的活性位点半胱氨酸上标记N端KCK标签（65）。淬火至低于500限制后的最终体积微升是方便，因为可以继续凝胶过滤而不蛋白质进一步浓缩。
在AKTA上，将淬灭的染料/ LOV2混合物在用HBS平衡的Superdex 200增加10/300 GL色谱柱上运行。在一个深孔96孔块中收集1.5 ml馏分。
池级分具有较高（> 100 mAu ）A 280 ，明显呈黄色，并使用Vivaspin 蛋白浓缩器浓缩至约1.5 mg / ml 。
加入甘油至最终体积为10％。
使3分微升在PCR管中的等分试样并卡冷冻在液氮中。
储存在-80°C。等分试样在-80°C下保存> 2年后，未显示活性降低的迹象。

ZDK 净化
除以下更改外，以与LOV2相同的方式纯化和标记Zdk 。

不要在细菌生长培养基中添加生物素或黄素单核苷酸。
添加SUMO蛋白酶的6xHis-SENP2到IMAC在1洗脱的蛋白质：1 ，000瓦特/ w的代替TEV蛋白酶（的6xHis-SENP2在纯化的房子，但可以商购获得）。
用磺化花青3马来酰亚胺标记蛋白质，而不用Alexa Fluor 488 C5马来酰亚胺标记。

钴柱充电程序
该充电方案假定色谱柱开始存储在20％的乙醇中。在整个过程中，请确保捕获可能含有钴（II）的所有废水，以进行适当的废物处理。

将塑料管连接到蠕动泵上，并用ddH 2 O 冲洗该管。
将塑料管连接到IMAC色谱柱，注意不要引入任何气泡。
用5-10倍柱体积的ddH 2 O 冲洗色谱柱，以除去存储溶液。典型的流速是1.5-2.0ml / min。
暂停泵，将管路入口切换为已通过0.22 的100 mM CoCl 2 溶液 μ米过滤器。注意不要在管路中引入气泡。重新打开泵。
使钴溶液流过色谱柱，直到色谱柱和流出物明显呈粉红色为止。
暂停泵，将色谱柱在钴溶液中孵育10分钟。
将管路入口切换回ddH 2 O并打开泵。用至少10倍柱体积的ddH 2 O 洗涤色谱柱。重要的是要完全除去任何痕量的游离钴（II），因为在还原剂缓冲液中钴（II）易于还原，从而导致沉淀和阻塞。柱。
切换管道进气到所需的缓冲液（已经通过0.22传递μ 米过滤器），并用5个柱体积洗涤柱。
该列现在可以使用了。
色谱柱汽提，清洁和储存
在整个过程中，请确保捕获可能含有钴（II）的所有废水，以进行适当的废物处理。

将色谱柱连接到已用ddH 2 O冲洗过的蠕动泵和管道中。用10倍柱体积的ddH 2 O 清洗色谱柱。
管道进气切换到1种摩尔EDTA溶液（已经通过0.22传递μ 米过滤器），并流过该柱，直到它是明显白试。
将进样口切换为ddH 2 O，并洗涤5 倍柱体积。
切换管道吸入到20％乙醇溶液（已经通过0.22传递μ 米过滤器）和洗5个柱体积。
盖上色谱柱的两端并存放在4 ℃。
注意：为了更彻底地清洁色谱柱，可以选择将其用1 M NaOH 处理，以水解任何残留的蛋白质。后小号TEP d 3 的上方，与平衡1列1M的NaOH，静置1个小时。洗涤用的DDH的5倍柱体积2 O和前进到小号TEP d 4。

玻璃器皿清洗
SUV的制备和玻璃器皿清洁方案是根据先前发布的内容进行修改的（Taylor 等，2017）。

将8个玻璃小瓶（无瓶盖）和8个巴斯德移液器添加到1 L的玻璃烧杯中，并盖上3 M NaOH。将烧杯放在超声波浴中30分钟。
倒出NaOH（可将其保存以备将来清洗玻璃时使用），并通过填充烧杯并轻轻搅拌，用ddH 2 O 将玻璃器皿洗涤5次。
用5％（体积/体积）的Hellmanex III溶液覆盖玻璃器皿，并孵育过夜（> 8小时）。
倒出Hellmanex III溶液，并用ddH 2 O 彻底清洗玻璃器皿。从玻璃器皿中除去所有痕量的Hellmanex 洗涤剂至关重要。要用ddH 2 O 彻底清洗，请用塑料管将塑料巴氏移液器（或一些可以装在玻璃小瓶内的小管）连接到ddH 2 O源。颠倒并连续冲洗小瓶的内部，然后将塑料的巴斯德移液器放置在尽可能远离颈部的位置。冲洗大约30 s或直到水不再产生气泡为止。还要彻底清洗小瓶的外部。同样，用力清洗每个巴斯德移液器的内部和外部。可以通过将巴斯德玻璃移液器的末端穿入塑料巴斯德移液器末端的内部，来有效地冲洗巴斯德玻璃移液器的内部（您可能需要用剪刀稍微修剪一下塑料巴斯德移液器的末端），以确保用水连续冲洗。对于小瓶和巴斯德玻璃移液器，您可能必须在冲洗小瓶的内部和外部之间进行交替操作，以确保不会交叉污染Hellmanex 溶液。
用压缩氮气，空气或其他压缩惰性气体吹干以除去多余的水。
将玻璃器皿轻轻包裹在铝箔中（以防止灰尘），然后将其放在80°C的加热块上（或使用玻璃干燥箱）放置数小时，直到完全干燥。
将玻璃器皿存放在干净的装有铝箔的烧杯中，以防止灰尘进入。
要清洁塑料瓶盖，请在ddH 2 O 烧杯中超声处理30分钟，然后干燥并以与小瓶和巴斯德玻璃移液管相同的方式存储。

制备单层小囊泡（SUVs）
通过将大约500冲洗用氯仿一个的NaOH清洁4 ml玻璃管制瓶内微升氯仿用的NaOH清洗巴斯德吸管。旋转几次以覆盖小瓶的内部，并丢弃氯仿。再重复一次。
加入约500 微升Ò ˚F氯仿到冲洗小瓶中。
使用汉密尔顿注射器，以77.5％POPC，0.5％PEG-PE和2％生物素CAP PE 的摩尔比添加4μ 摩尔总脂质。专门使用一个汉密尔顿注射器处理每种脂质类型，以减少交叉污染的变化是有用的。
缓慢旋转氮气（或其他惰性气体）到顶部，同时旋转小瓶以除去氯仿。一旦所有可见溶剂蒸发掉（小瓶内部应有白色残留环），用预先清洗的盖子松开小瓶盖，然后放置在真空干燥器中过夜。
第二天，通过加入1.5毫升0.22再水合脂质微米过滤d PBS，牢固地拧上盖子，轻轻涡旋10分钟。可以将小瓶垂直放置在台式涡流器中，方法是将小瓶垂直放置在中间，然后从涡流头下方通过一条胶带穿过小瓶盖，然后再向下旋至涡流头另一侧的下侧。与第一条磁带成90度角重复另一条磁带。该涡旋速度是很重要的。它应该不会比使D PBS到达小瓶的颈部所需的速度快，这样所有脂质都可以重新水化。如果涡流10分钟后有气泡，涡流太快; 这有氧化脂质的风险。
一旦再水化，分割2支1.5毫升的微量管之间，靠近下在流动的氮气或其他同样的混合物ERT 气体。
进行20次冻融循环通过移动之间的管杜瓦瓶的液氮和42℃的水浴或加热块。混合物应从浑浊变成明显澄清。如果解决方案的清晰度没有提高，则可能意味着大型脂质聚集体和多层囊泡不会分解为SUV。由于PEG-PE可以帮助脂质聚集体分解为SUV，因此浑浊的溶液可能表明使用了太多或太少的PEG-PE或脂质已经变质。考虑订购新的PEG-PE和/或仔细检查使用的PEG-PE的正确摩尔量。
在台式超速离心机中，将脂质混合物在60°RCF下于4°C于40°C下旋转40分钟。管的底部可能会有小的玻璃状颗粒。
将上清液移至1.5 ml Eppendorf管中，并储存在液氮中直至准备使用。
RCA清洁显微镜盖玻片
将一个玻璃盖玻片放入玻璃Coplin广口瓶的每个插槽中，盖上丙酮，然后放入超声波浴中10分钟。
倒出丙酮，并用190标准乙醇重复。
倒出乙醇，并用ddH 2 O 重复。在ddH 2 O超声处理步骤之前和之后，用ddH 2 O 填充并倒出Coplin 罐5次，以去除多余的有机溶剂。
在微波炉（或加热板）中将1 L ddH 2 O加热至大约70°C。热水将有助于防止Coplin广口瓶在即将到来的洗涤过程中因温度应力而破裂。
另外，准备70-80°C的水浴，并用足够的水将大部分Coplin广口瓶浸没，而不会使唇部溢出。
将3.75 g KOH溶于45 ml加热的ddH 2 O中，并加到盖玻片上。然后加入15毫升30％过氧化氢。
用钳子或金属丝牢固地缠绕在Coplin广口瓶的脖子上，将其转移到水浴中，使其反应12分钟：溶液大约需要2分钟才能升至温度，反应需要10分钟。一旦加热，该溶液将不断产生许多小气泡。
从水浴中取出Coplin 罐。小心倾析基础溶液，并用温热的ddH 2 O 洗涤5次。
添加下列组分，以在科普林罐：38毫升温热的DDH 2 O，9.5毫升37％HC 升和12.6毫升30％过氧化氢。
如前所述，在水浴中孵育12分钟。溶液将像基本溶液一样起泡，但起泡的强度稍弱。
卸下科普林从水浴罐子，滗出溶液，并用温热的DDH洗5次2 O.盖上温热的DDH盖玻片2 O，所述添加科普林罐盖，并储存在室温下长达一周。

形成SLB
在干燥和准备玻璃盖玻片时，请注意仅握住边缘，并避免接触中央附近的任何部位。

使用镊子从Coplin广口瓶中的ddH 2 O中取出玻璃盖玻片。用一只戴手套的手捏住两个长边，立即用压缩氮气（或压缩空气或其他惰性气体）吹干。盖玻片上的反射应该是一尘不染的。
在两张纸巾上叠放一张显微镜镜头纸，然后将盖玻片放在上面。
将六孔的Ibidi 粘性腔室牢固地按到盖玻片上。使用非常牢固的压力以确保接触，尤其是通道之间以及通道末端与盖玻片侧面之间的接触。
用透明指甲油沿盖玻片的长边密封界面。密封件有助于防止长时间的显微镜时间间隔实验中通道中的任何溶液芯吸到侧面和蒸发。
稀释30 微升的SUV的等分试样用800 微升0.22 微米过滤d PBS和六个井之间均匀地分布。
在37°C下孵育1小时。一旦添加了SUV，请注意不要在随后的清洗和功能化步骤中使通道干燥。
进行SLB功能化

功能化SLB
官能井，用500排出多余的脂质微升的0.22 微米过滤d PBS。用移液器将液体一端推入，然后从另一端小心吸出（图2 ），这很有用。

D：\ Reformatting \ 2020-7-1 \ 1902649--1485 Orion Weiner 784707 \ Figs jpg \ fig 2.jpg

图2.在SLB准备和功能化期间交换解决方案。在伊比迪会议厅通道中如何交换溶液的示意图。为了在Ibidi 腔室的通道中进行有效的溶液交换，同时保持SLB处于水合状态，同时将新溶液推入一端并从另一端吸出是很有用的。将抽吸器的尖端保持在居间通道顶部上方的出口较高位置，有助于确保仅在移液器将新溶液推入时才除去液体。在吸气器的末端增加一个小直径的移液器吸头，可以帮助减轻吸力，避免过度吸出通道。

用200冲洗井微升的链霉稀释到d PBS-BB（2 微克/毫升终浓度）并在室温下孵育erature 5分钟。
用500冲洗井微升d PBS-BB。
用200冲洗井微升LOV2的稀释到d PBS-BB至所需浓度（典型地在20-200 纳米）和孵化在室温下5分钟。
最后，冲洗用500通道微升的d PBS-BB。现在，SLB已通过LOV2进行了功能化。

无论LOV2官能化SLB的预期用途是什么，重要的是实验进行时所用的溶液已用除氧剂进行了预处理。这有助于防止蓝光漂白LOV2发色团，并显着增加Zdk 募集和释放到LOV2的可能次数。一种有效的方法是将ProLong Live Antifade Reagent 1：100 稀释到将要进行显微镜操作的溶液中，并使其在室温下孵育至少90分钟，以消除溶解氧。在将SLB功能化之前开始除氧剂处理非常有用，这样在SLB完全功能化之前就可以准备溶液。

显微镜
具备TIRF（全内反射荧光）显微镜的显微镜对于定量Zdk 募集和从LOV2功能化的双层中释放是必不可少的，并且是对细胞信号或生化反应的结果变化进行成像的自然选择。

我们使用带有两层二向色性转塔的Eclipse Ti 倒置显微镜（Nikon）进行成像，以允许同时进行荧光成像和光遗传学刺激。显微镜还配备了电动激光TIRF照明装置，60倍复消色差TIRF 1.49 NA物镜（Nikon），iXon Ultra EMCCD相机以及配备405-，440-， 488、514和561 nm激光线。显微镜和相关硬件由MicroManager （Edelstein 等人，2014）结合定制的Arduino控制器（Advanced Research Consulting Corporation）进行控制。用于光遗传学刺激的蓝光来自由MATLAB单独控制的470 nm LED。

检查双层流动性
在进行实验之前，重要的是要确认双层已经被LOV2和液体功能化。通过光漂白（FRAP）实验后的荧光恢复可以轻松完成此操作。可以使用几乎任何荧光成像方式（例如TIRF，共焦，宽视场）来检查双层是否已被LOV2功能化。

将用饱和量的荧光标记LOV2功能化的SLB装入显微镜，并使用60倍或100倍物镜聚焦在玻璃水界面上。掺杂少量浓度的荧光珠可能会很有用，以使该界面的定位更容易。
关闭向下的落射场光阑所以视场的，只有一部分被照射。如果双层被荧光标记的LOV2功能化，则照明区域内的荧光应明显增加。
通常需要定性FRAP测量来评估双层流动性。尽管拥有合适的FRAP系统或高功率TIRF激光器很有用，但有时可能无法使用功率较低的光源（例如宽场落射荧光光源）。在这种情况下，用易于漂白的荧光团（如FITC（异硫氰酸荧光素））标记LOV2是有用的。不使用除氧剂处理成像缓冲液也会使荧光团更容易漂白。
用您选择的方法漂白视场的一小部分。如果未使用适当的FRAP系统（例如，使用激光TIRF或宽视场落射荧光光源代替），靠近下的落射场光阑所以只有视场的一小部分被照亮。如果使用TIRF激光，请将其指向正上方。对于非FRAP系统，可能需要将功率增加到最大。漂白目标区域所需的时间将取决于光源的强度，连接到LOV2的小分子荧光团和成像介质等因素。漂白时间长于30秒通常是无效的，因为双层中的扩散（如果是流体）会平衡照明区域和非照明区域之间的LOV2。
接下来的2-3分钟，每5-10秒钟对整个视场成像一次。（打开落射视场光阑，如果它是关闭）。A漂白孔的直径为〜5-10微米如果双层是流体应当基本上恢复在〜30-60秒（图3 和视频1 ）。原始漂白孔的边界应保持可见。

图3.用FRAP评估双层流动性。使用TIRF激光将一个小孔漂白到用荧光LOV2功能化的双层中。因为双层是流体，所以新的LOV2分子扩散到漂白区，在60 s内大体上恢复了其初始状态。非流体双层无法在这段时间内恢复。比例尺指示1μm 。

D：\ Reformatting \ 2020-7-1 \ 1902649--1485 Orion Weiner 784707 \ video1.jpg

视频1. FRAP实验的时间流逝，显示SLB处于流动状态并通过LOV2进行了功能化。将一个小孔光漂白到用荧光LOV2功能化的SLB中。在大约60 s的过程中，由于新的LOV2分子从漂白区域外部扩散而来，荧光信号得以恢复。未使用LOV2功能化的双层在开始时不会显示“空洞”。被功能化但不能流动的双层将在大约60 s内恢复。确切的回收率取决于漂白区域的直径。比例尺为1 μ 米。

测试LOV2功能
测试双层LOV2功能的最直接方法是使用TIRF来测量荧光标记Zdk 的募集和释放。在确认双层已被LOV2和液体官能化后，应执行此测试。

用饱和量的LOV2使SLB功能化，并在包含250nM Zdk的成像介质中流动，该成像介质已用除氧剂处理。最好使用打算用于实验的媒体，但D PBS可以作为一个很好的起点。确保Zdk 标记有被波长大于560 nm的光激发的染料，以便您可以连续成像而不激活LOV2。
设置一个10分钟的时间过程，其中每5秒钟用TIRF对Zdk 进行一次成像。每2分钟，将LOV2暴露在约470 nm的蓝光下1秒钟。任何种类的GFP成像设置通常都可以正常工作。根据蓝光的强度，Zdk 应在约1-10秒钟内从双层中快速释放出来，然后在接下来的2分钟内缓慢恢复。在接下来的10分钟内，应观察到类似的释放和募集周期（图4 ）。如果在10分钟内Zdk 募集减少了50％以上，则最可能的原因是除氧剂治疗无效。

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图4. Zdk 募集和从脂质双层释放的时间过程。招募荧光标记的Zdk ，并从LOV2功能化的双层中释放五个周期。LOV2 在被蓝光（LED发出的470 nm光）激发后迅速释放Zdk ，并在去除蓝光后缓慢重新结合。（垂直的蓝色条表示470 nm LED处于打开状态。）即使显微镜只能进行周期性的蓝光照明（而不是像我们这样的连续照明），Zdk 的募集和释放动力学也应该非常相似。

对于在细胞表面受体上使用Zdk 启动信号的方案，我们将感兴趣的读者介绍给我们之前的公开出版物（Tischer and Weiner，2019）。对于我们以前与T细胞信号转导有关的工作，我们能够从一个单一的视野进行数十个单细胞测量。通过三个生物学重复，我们在每种条件下记录了约50-100个单细胞测量值，为我们的实验中的统计意义提供了足够的数量。

菜谱

媒体和缓冲区：

IMAC绑定缓冲区
50毫米KH 2 PO 4

400毫米氯化钠

0.5毫米βME

pH值7.5

IMAC洗脱缓冲液
50毫米KH 2 PO 4

400mM氯化钠

500 mM咪唑

0.5毫米βME

pH值7.5

哈佛商学院
20毫米HEPES

100毫米氯化钾

0.5毫米TCEP

pH值7.5

很棒的汤（TB）
营养基础

12克try

24克酵母提取物

4毫升甘油

900毫升ddH 2 O

10 TB盐

170毫米KH 2 PO 4

720毫米K 2 HPO 4

分别高压灭菌营养盐和10x TB盐
然后将100 ml的10x TB盐添加到900 ml的营养基质中，制成1 L TB

用于SLB功能化和成像的缓冲液：

D PBS-BB
D PBS（Thermo Fisher Scientific）

1 mg / mlβ-酪蛋白

0.5毫米βME

使用0.22滤波器微米过滤器之前立即使用

Acknowledg 发言：

这项工作得到了Genentech奖学金（DT），NIH赠款GM118167和Novo Nordisk基金会（ODW）以及NSF 科学技术中心细胞建设中心（DBI-1548297）的支持。该协议改编自Tischer 和Weiner （2019）。

利益争夺

作者声明没有任何金融或非金融竞争利益。

参考文献

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Tischer ，DK和Weiner，OD（2019）。基于光的配体半衰期调节支持T细胞信号转导的动力学校对模型。网上生活8：42498。
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