材料和试剂

动物
NIH裸鼠幼崽（Charles River Laboratories，RRID：RGD_2312499 ）（出生后第1天，P1）用于移植对象。这些无胸腺裸鼠是T细胞缺陷的，并且在外周淋巴器官的胸腺依赖性区域中显示出耗尽的细胞群。根据美国国家卫生研究院（NIH）的《实验动物的护理和使用指南》以及机构动物护理和使用委员会的规定，对动物进行饲养和维护。

文化产品
常规6孔板（Thermo Fisher Scientific，目录号：140675）
超低附件6孔板（Corning，目录号：3471）
层粘连蛋白/聚-D-赖氨酸涂层板（Corning，目录号：354595）
的hiPSC 的DsRed-SC1014细胞系（约翰霍普金斯杂志升机构）（SC1014细胞系是表征的人iPSC系，其通过非整合型仙台病毒和慢病毒重新编程。稳定的DsRed-SC1014细胞系通过用核转染建立的piggyBac转-dsRED 转座子和背back 转座酶）
小鼠胚胎成纤维细胞（MEF中，GIBCO，Ç atalog编号：S1520-100）
Dulbecco氏改进的Eagle培养基（DMEM，赛默飞世尔科技，Ç atalog号：10569010）
胎牛血清（FBS），ESC-合格（赛默飞世尔科技，Ç atalog号：10439024）
Dulbecco改良的Eagle培养基/营养混合物F-12（DMEM / F12，Thermo Fisher Scientific，目录号：11320033）
剔除血清替代品（KSR，Thermo Fisher Scientific，目录号：10828028 ）
成纤维细胞生长因子2（FGF2; 4 ng / ml; PeproTech ，目录号：100-18B）
1 mM Glutamax （Thermo Fisher Scientific，目录号：35050061）
100 μM 非必需氨基酸（赛默飞世尔科技，产品目录号：11140050）
100 μM 2-巯基乙醇（赛默飞世尔科技，产品目录号：21985023）
头胶（50 ng / ml，R＆D系统，货号：6057-NG-025）
Dorsomorphin（1μM ，Tocris ，目录号：3093）
SB431542（10 μ 中号，Tocris ，目录号：1614）
1％的N2补充（Thermo Fisher Scientific，目录号：17502001）
肝素（2μg / ml，Millipore Sigma，目录号：H3149 ）
神经基础培养基（Thermo Fisher Scientific，目录号：21103049）
B27减去VitA （Thermo Fisher Scientific，目录号：12587001）
维甲酸（RA，Millipore Sigma，目录号：R2625 ）
声波刺猬（SHH，50 ng / ml，R＆D系统，目录号：1845-SH-025）
紫吗啡（2μM ，研究与开发系统，目录号：4551/10）
脑源性神经营养因子（BDNF，20 ng / ml，PeproTech ，目录号：450-02）
胶质细胞系衍生的神经营养因子（GDNF，20 ng / ml，PeproTech ，目录号：450-10）
抗坏血酸（0.2 mM，Millipore Sigma，目录号：1043003 ）
二丁酰cAMP（0.5 mM，Millipore Sigma，目录号：D0260）
胶原酶（1 mg / ml，Millipore Sigma，目录号：C9722）
Matrigel（Corning，目录号：354230）
Accutase （Corning，目录号：25-058-Cl）
不含钙和镁的Dulbecco PBS（DPBS）（Thermo Fisher Scientific，目录号：14190144）
人胚胎干细胞（ESC）培养基（请参阅食谱）
小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）培养基（请参阅食谱）
N2感应介质（NIM）（请参阅食谱）
神经分化培养基（请参阅食谱）

免疫染色
氯胺酮（Henry Schein，目录号：1049007）
赛拉嗪（Rompun ，目录号：321350RX）
Tissue-Tek OCT化合物（樱花，目录号：4583）
2-甲基丁烷（Fisher Scientific，目录号：03551-4）
驴血清（Abcam，目录号：ab7475）
Triton X-100（Millipore Sigma，目录号：T8787）
抗人特异性NES（Millipore，MAB532 6 ，RRID：AB_11211837）
抗TBR1（Abcam，目录号：ab31940，RRID：AB_2200219）
抗CTIP2（Abcam，目录号：ab18465 ，RRID：AB_2064130）
抗BRN2（圣克鲁斯生物技术，目录号：sc-6029，RRID：AB_2167385）
抗SATB2（Abcam，目录号：ab51502，RRID：AB_882455）
Anti-PROX1（Abcam，目录号：ab37128 ，RRID：AB_882189）
Anti-TUJ1（Millipore ，目录号：MAB1637 ，RRID：AB_2210524）
抗MAP2（Millipore Sigma，目录号：M2320 ，RRID：AB_609904; Millipore ，目录号：AB5 622，RRID：AB_91939）
PHO sphate缓冲盐水（PBS），1 X，pH为7.4（参见食谱）
4％多聚甲醛（PFA）（请参阅食谱）
氯胺酮/甲苯噻嗪溶液（请参见食谱）

电生理记录
异氟烷（Henry Schein，目录号：1182097）
NaCl（Millipore Sigma，目录号：71380）
氯化钾（Millipore Sigma，目录号：31248）
MgSO 4 （Millipore Sigma，目录号：63138）
NaH 2 PO 4 （Millipore Sigma，目录号：S5011）
NaHCO 3 （Millipore Sigma，目录号：S5761）
CaCl 2 （Millipore Sigma，目录号：C7902）
D-葡萄糖（Millipore Sigma，目录号：G6152）
HEPES（Millipore Sigma，目录号：H6147）
EGTA（Millipore Sigma，目录号：E8145）
MgATP （Millipore Sigma，目录号：A9187）
Na 3 GTP（Millipore Sigma，目录号：G8877）
葡萄糖酸K（Millipore Sigma，目录号：G4500）
CsCl （Millipore Sigma，目录号：203025）
河豚毒素（TTX，1μM ，Tocris ，目录号：10-691）
四乙铵（TEA，10 mM，Tocris ，目录号：30-685-0）
微小毒素（10μM ，Tocris ，目录号：11-281）
Bicuculline（Bic，10μM ，Tocris ，目录号：25-031-0）
6-Cyano-7-nitroquinoxaline-2，3-dione（CNQX，20μM ，Tocris ，目录号：10-451-0）
d-2-氨基-5-膦酰基戊酸（d-AP5，50 μM ，Tocris ，目录号：01-061-0）
ACSF（请参阅食谱）
内部解决方案（请参阅食谱）

设备

CO 2 培养箱（美国纽约州豪珀格，埃彭多夫）
37 °C水浴
离心机（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）
自动纳升注射器（德拉蒙德，型号：Nanoinject II ）
低温恒温器（Leica ，型号：CM3050 ）
LSM880共聚焦激光扫描显微镜（德国卡尔蔡司）
振动刀（Leica ，型号：VT1200S ）
火焰棕色微量移液器（萨特仪器，型号：P -1000 ）
HEKA EPC10放大器（HEKA Elektronik ，Lambrech ，德国）

软件

ZEN lite（卡尔·蔡司，https：//www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html）
PatchMaster （HEKA Elektronik ，https ://www.heka.com/downloads/downloads_main.html ）
Clampfit （分子设备，https://www.moleculardevices.com/products/axon-patch-clamp-system/acquisition-and-analysis-software/pclamp-software-suite#gref）
MiniAnalysis （Synaptosoft ，http://www.synaptosoft.com/MiniAnalysis/）

程序

hiPSC的文化和传承
培养的hiPSC 的DsRed-SC1014细胞对人胚胎干细胞（ESC）培养基（见配方）灭活的MEF中定期6孔板中。每天更换培养基。
当细胞达到80-90％融合时，以1：6至1:12的比例传代细胞。
制备MEF平板以下小号TEP 小号甲4- 甲6一个或传代前两天的hiPSC 培养。
用2％Matrigel（在DMEM / F12中）覆盖培养皿的整个表面，并将其在室温下孵育至少1小时。
抽吸基质胶，并在MEF培养基中的血管中接种30,000个细胞/ cm 2 的有丝分裂失活的MEF（请参见食谱）。
将MEF板保存在37 °C ，5％CO 2的培养箱中。
从含有灭活的MEF的板中吸出MEF培养基，并在铺板hiPSC 之前3-4 h加入预热的人类ESC培养基。
去除需要在解剖显微镜下传代的hiPSC 菌落。
将胶原酶（在DMEM / F12中为1 mg / ml）溶液添加到含有hiPSC的培养板中，然后在37 °C ，5％CO 2的培养箱中孵育30-60分钟。
当菌落的边缘开始从板中拉开时，停止孵育。
小心去除胶原酶，以免干扰附着的细胞层。
将人类ESC培养基添加到板中，轻轻吹出hiPSC ，然后将hiPSC 收集在新的锥形管中。确保减少泡沫。
以200 x g 离心5分钟，然后从hiPSC 沉淀中去除上清液。
用人类ESC培养基重悬沉淀。
向每个MEF板中添加适当体积的细胞悬液，然后将板返回培养箱。每天更换培养基。
hiPSC的神经分化
如下所示，基于玫瑰花形神经聚集体（称为RONA）方法将hiPSC 与神经元区分开（Xu et al。，2016）。
在培养箱中用胶原酶（在DMEM / F12中为1 mg / ml）将hiPSC 集落孵育约5-10分钟，然后用培养基轻轻冲洗掉胶原酶。
生长分离的hiPSC 菌落悬浮液embyroid 体（EB）（100-200 微米直径，10〜的EB / ml的培养基）在人类ESC培养基中没有FGF2用于超低附件6孔板2天（Corning）中。
从第2天到第6天，在人ESC培养基（不含FGF2）中添加Nog gin（50 ng / ml，R＆D系统）或Dorsomorphin（1μm ，Tocris ）和SB431542（10μM ，Tocris ）。
在第7天，将自由漂浮的EB转移至预先涂有Matrigel的培养板中（如上所述），以使EB聚集体与N2诱导培养基（NIM，请参见食谱）的完全结合。
连续地供给培养物用N 2培养基每隔一天从d AY 小号7至12。
从第12天起每天更换N2诱导培养基。
附着的EB聚集体在第8至9天分解形成单层菌落，并形成典型的神经特异性玫瑰花结。随着神经诱导的扩展，高度紧密的三维柱状神经聚集体RONAs在附着菌落的中心形成。手动微隔离RONAs，要特别小心以最大程度地减少对扁平细胞和RONAs下方细胞的外围单层污染。
在第17天，在含有B27减去VitA （Thermo Fisher Scientific ），1 mM Glutamax （Thermo Fisher Scientific ）的神经基础培养基（Thermo Fisher Scientific ）中收集和维持RONA簇作为神经球，持续一天。典型的RONA如图1所示。

D：\ Reformatting \ 2020-7-1 \ 1903012--1517西泠印837248 \图jpg \图1.jpg

图1.第17天的典型RONA。PAX6 和NKX2.1的免疫染色显示了神经祖细胞中与皮层模式相关的转录因子（转自Xu 等人，2016）。

在第18天，在S tep s B 11至B 19 之后，将神经球解离为单个细胞。
从培养板上取下神经球悬液，并转移到15 ml锥形管中。
让神经球在试管中静置2-5分钟，然后小心地除去培养基，使〜100μl的培养基留在神经球中。
在5 ml DPBS（Thermo Fisher Scientific）中重悬神经球。
让神经球在管2-5定下来分钟，并除去DPBS仔细离去〜100个微升与剩余的DPBS 神经球。
向神经球中加入1 ml Accutase （Corning），并在室温下孵育10分钟。
上下吸移，直到所有神经球都在单个细胞悬液中。
向试管中加入4 ml神经分化培养基（请参阅食谱），并以200 x g 离心5分钟。
轻轻去除上清液。
将细胞在神经分化培养基中重悬至所需的细胞密度，然后将细胞铺在层粘连蛋白/聚-D-赖氨酸包被的平板上（Corning）。
从第24 天到第30 天，将RA（2μM ，Millipore Sigma），SHH（50 ng / ml，R＆D系统）和Purmorphamine （2μM ，R＆D系统）应用于神经分化培养基中，以维持神经祖细胞的身份。提供适当百分比的代表人类大脑皮层的兴奋性神经元（〜80-85％）和抑制性神经元（〜15-20％）。
的hiPSC 衍生的在d神经祖细胞AY 小号31-32注入如下（方法C）中所述，和表征是10周移植后进行新生大鼠皮质。
在培养条件下，hiPSC 衍生的神经元在10周后显示出成熟的人类皮质身份（图2）。

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图2。hiPSC 衍生的神经元在分化10周后在培养物中显示出人类皮质身份。A.培养物表达皮质层特异性标记物TBR1，CTIP2，BRN2和STAB2。B.一些细胞表达海马标记物PROX1 （从Yin 等人复制，2019）。

动物移植
从细胞培养到移植的整个过程如图3所示。

D：\ Reformatting \ 2020-7-1 \ 1903012--1517西陵银837248 \图jpg \图3.jpg

图3.轮廓显示了从hiPSCs 移植fo rebrain祖细胞（转载自Yin 等人，2019）。

胰蛋白酶化的hiPSC 衍生的神经祖细胞在DA ý 小号在培养31-32，并用移液管充分解离。然后，将细胞以300 x g 离心3分钟。
小心除去上清液，然后将沉淀重悬于冰冷的1x PBS中，终密度为2 x 10 6 细胞/ μl 。
填1.0 微升细胞的成拉玻璃微量移液管（0.5毫米内径1毫米OD）通过抽吸，然后贴合玻璃微量给自动纳升注射器（Nanoinject II，德拉蒙德）。使用纳米注射器可以最大程度地减少组织损伤，并以相对较慢的速率注射少量。
轻轻和深度麻醉新生大鼠幼崽。
在1分钟内将细胞注入右皮质（后2.0毫米，前reg外侧1.9毫米，硬脑膜以下2.6毫米）。退出前，将微量移液器吸头再固定2分钟。

脑切片免疫染色
用氯胺酮/甲苯噻嗪溶液（0.5 ml / kg，请参见食谱）麻醉大鼠（10周大，移植后也要10周）。
用1x PBS灌注大鼠的心脏左心室直到肝脏变白。
继续用新鲜制备的4％PFA灌注。
解剖大脑和后固定它们在4％PFA 2-3天，在4 ℃下。
将大脑转移到30％的蔗糖中，直到当蔗糖溶液饱和时它们沉入底部。
从蔗糖溶液中取出大脑，然后将它们放在2-甲基丁烷（Fisher Scientific）中，该容器已在液氮中冷却30 s至1分钟。
将一些OCT化合物（SAKURA）放在已经放在干冰上的低温恒温器纸架上。
将脑组织放在支架的中央，并在脑周围添加更多的OCT化合物，直到其固化。
将OCT脑块保存在-80 °C，直到进行连续切片处理。
使用低温恒温器（CM3050，Leica）准备脑冠状切片（25μm ）。
抗原回收步骤是可选的，应根据每种抗体的指南进行标准化。对于本研究中使用的抗体，抗原修复不是必需的。
在室温下，继续用1％PBS中的10％（v / v）驴血清和0.2％（v / v）Triton X-100 封闭1 小时。
将切片与感兴趣的一抗在4 °C下孵育过夜。
用PBS清洗切片，每次3次，每次5分钟，然后在室温下与适当的荧光标记的二抗孵育1小时。
在室温下孵育1小时后，用PBS清洗切片3次，每次5分钟，然后将它们安装在干净的载玻片上。完全干燥玻片，然后用共聚焦显微镜成像（图4和视频1）。
视频1是使用Z-Stack图像生成的。设置在Z-Stack的，第一个和最后一个位置，即，该部分的深度。当前研究中的间隔使用1.01 µm。另外，选择间隔可以通过单击最佳设置切片数来完成。

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图4.表达RFP 与成熟神经元标记MAP2 共同定位的人类神经元，表明hiPSC 衍生的神经元整合到大鼠大脑中。A.低倍放大图像显示大鼠脑中RFP阳性人类细胞。B.脑切片我mmunostained 与MAP2和DAPI （从阴再现等人，2019）。

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V 记意1. 的hiPSC 衍生的神经元在大鼠脑中如图RFP / MAP2双阳性细胞。（摘自Yin 等人，2019）

急性脑切片的电生理记录
麻醉大鼠（10周龄，也10周移植后）用异氟烷（300 微升在滴罐麻醉的500ml容器）的d迅速取出大脑。
制备350层的横向脑切片微米使用振动机（Leica VT1200S）的厚度。
将切片在ACSF溶液中孵育切片（请参见第4章），该切片应先在34°C下持续30分钟，然后在室温下连续通入95％O 2 和5％CO 2 。
将单个切片转移到不断充满经碳原平衡的ACSF的浸没式记录室中。
通过荧光和DIC光学镜（Carl Zeiss），在40倍水浸物镜下可视化表达RFP的注射人类神经元。
使用装有内部溶液的玻璃移液器（3-5MΩ）进行全细胞膜片钳记录（请参见食谱）。随机选择RFP阳性的人神经元，用于记录300 微米到1000 微米，从移植位点。
通过一系列超极化和去极化阶跃电流来感应动作电位。
以一系列电压步长（从–100 mV到+60 mV以20 mV的步长）激发钠和钾电流。
以–70 mV的电压钳位记录自发性兴奋性突触后电流（sEPSCs ）和自发性抑制性突触后电流（sIPSCs ）。获得sEPSCs 在印防己毒素存在（100 μM ），并sIPSCs 在CNQX（20的存在μM ）和d-AP5（50 μM ）。
记录结果表明，嫁接hiPSC的神经元在功能上与大鼠大脑整合，并且能够激发并显示出兴奋性和抑制性突触活性（图5）。

D：\ Reformatting \ 2020-7-1 \ 1903012--1517西陵银837248 \图jpg \图5.jpg

图5. hiPSC 衍生的神经元在功能上整合到大鼠脑的突触电路中。A. hiPSC 衍生的神经元的AP激发模式。B. 从移植细胞记录的全细胞Na + （向内）和K + （向外）流的代表性迹线。C.sEPSC 和sIPSC的代表性痕迹（从Yin 等人复制，2019）。

数据分析

研究了使用这些方案获得的hiPSC 培养物和人类神经元，并通过一系列测定使用一系列皮质特异性标记物比较了它们的人类皮质身份（Xu 等人，2016; Yin 等人，2019）。使用公布的Clampfit 10.5软件（Molecular devices）和MiniAnalysis 软件（Synaptosoft ）（Yin et al。，2019）分析电生理记录数据。因此，这里不讨论数据分析。

笔记

在步骤A4中，在菌落边界开始从培养皿上剥落而菌落中心仍保持附着状态后，应使用生长培养基轻轻地将胶原酶从培养皿中冲洗掉，然后将菌落选择性地分离而不会受到干扰。
在步骤A8，请注意，附着的聚集体通常在第8到9天分解形成单层菌落，并形成典型的神经特异性玫瑰花结。随着神经诱导的扩展，高度紧凑的3维列状神经聚集体RONAs将在附着菌落的中心形成。
在步骤A10中，在收集RONAs时，应在显微镜下进行隔离，并要特别小心以最大程度地减少对扁平细胞和RONAs下方细胞的外围单层污染。
准备急性脑切片时，应尽快摘除大脑。
实验前每天应新鲜配制ACSF溶液。同样，在记录过程中，使切片在ACSF溶液中连续充满95％O 2 和5％CO 2 也是非常重要的。这些将有助于保持脑片处于健康的生理状态。

菜谱

1x PBS，pH 7.4
氯化钠8克（0.137 M）

氯化钾200 mg（0.0027 M）

Na 2 HPO 4 1.44 g（0.01 M）

KH 2 PO 4 240毫克（0.0018 M）

用M illiQ 水补足至1 L ，将pH调节至7.4

PFA 4％
将2 g PFA溶于50 ml 1x PBS

人类胚胎干细胞（ESC）培养基
DMEM / F12（赛默飞世尔科技）

淘汰20％的血清替代品（KSR，Thermo Fisher Scientific ）

4 ng / ml FGF2（PeproTech ）

1 mM Glutamax （Thermo Fisher Scientific ）

100 μM 非必需氨基酸（赛默飞世尔科技）

100 μM 2-巯基乙醇（赛默飞世尔科技）

小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）培养基
DMEM（赛默飞世尔科技）

10％FBS，ESC合格（Thermo Fisher Scientific ）

100 μM 非必需氨基酸溶液（赛默飞世尔科技）

100 μM 2-巯基乙醇（赛默飞世尔科技）

N2感应培养基（NIM）
DMEM / F12

1％N2补充

100 μM MEM非必需氨基酸溶液

1 mM的Glutamax

2 微克/ ml肝素

神经分化培养基
Neurobasal / B27（赛默飞世尔科技）

BDNF（20 ng / ml，PeproTech ）

GDNF（20 ng / ml，PeproTech ）

抗坏血酸（0.2 mM，Millipore Sigma）

二丁酰cAMP（0.5 mM，Millipore Sigma）

氯胺酮/甲苯噻嗪溶液
氯胺酮（100毫克/毫升）

赛拉嗪（20毫克/毫升）

将它们混合在无菌盐水（0.9％NaCl）中进行麻醉

联合会
氯化钠125 mM

氯化钾2.5 mM

硫酸镁4 1 mM

NaH 2 PO 4 1.2 毫米

碳酸氢钠3 26 mM

氯化钙2 2 mM

D-葡萄糖10 mM

内部解决方案
葡萄糖酸钾126 mM

氯化钾8 毫米

HEPES 20 毫米

EGTA 0.2 毫米

氯化钠2 mM

镁ATP 3 毫米

Na 3 GTP 0.5 毫米

调节pH值至7.3，重量克分子渗透压浓度为290 -300 mOsm

致谢

该协议是在MSCRF和NIH 的资助下开发的。我们感谢博士金-Chong许，Gun-博士植Cho和博士朱兰Kown 帮助规范的协议。该方案在2016年和2019年发表的两项独立研究中使用（Xu 等人，2016; Yin 等人，2019）。

利益争夺

作者声明没有任何竞争性的金融或非金融利益。

伦理

所有使用hiPSC的实验均根据约翰·霍普金斯大学（JHU）医学院（SOM）的政策进行，该研究涉及JHU教职员工或学生进行的涉及hiPSC的研究，或涉及JHU设施或资源的使用。由JHU机构干细胞研究监督（ISCRO）委员会进行监督。

建立方案时使用的所有动物程序均符合美国国立卫生研究院（NIH）的《实验动物的护理和使用指南》以及机构动物护理和使用委员会的指导。此协议中动物实验的批准ID为M017M288，已从10/1/2017到9/30/2020进行验证。

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