材料和试剂
探针合成试剂
10 x PBS（Thermo Fisher Scientific，目录号：AM9624）。存放在RT
100 mM MgSO 4 （NEB，目录号：B1003S）。储存在-20 °C
dNTP（A，C，T各自为6 mM）（NEB，目录号：N0446S）。储存在-20 °C 。请勿混用dGTP
清洁G （1 μ中号），小号撕在-20 ℃下
通过IDT按以下顺序订购Clean.G （标准脱盐，用UltraPure 水稀释）：CCCCGAAAGTGGCCTCGGGCCTTTTGGCCCGAGGCCACTTTCG
Bst DNA聚合酶（McLab ，目录号：BPR-200）。储存在-20 °C
IDTE pH 7.5（IDT ，目录号：11-05-01-05）。存放在RT
无菌试剂槽（即，MilliporeSigma ，目录号：CLS4870）。存放在RT
MinElute PCR纯化试剂盒（Qiagen ，目录号：28004）。将色谱柱保存在4 °C ，所有其他保存在室温。其他净化套件已经过测试，但是该套件提供了最可靠的结果
组织解离试剂（可选）
含钙/镁的HBSS（Thermo Fisher Scientific，目录号：14025092）。存放在RT
FBS（Thermo Fisher Scientific，目录号：10437028）。将等分试样存储在-20 ℃。解冻后的等分试样可在4 °C下保存长达2周
不含钙/镁的PBS pH 7.4（Thermo Fisher Scientific，目录号：10010023）。存放在RT
DMEM（Thermo Fisher Scientific，目录号：11995065）。储存在4 °C
BSA（MilliporeSigma ，目录号：A9418）。储存在4 °C
1 M HEPES pH 7.0（Thermo Fisher Scientific，目录号：15630080）。存放在RT
50 mM L-半胱氨酸（MilliporeSigma ，目录号：168149）
L-半胱氨酸储存在RT。该溶液是在实验前新鲜制备的。溶解15毫克的L-半胱氨酸在2.5米升的超纯水。
0.5 M EDTA pH 8.0（Thermo Fisher Scientific，目录号：AM9260G）。存放在RT
木瓜，悬浮液（沃辛顿，目录号：003124）。储存在4 °C
5米升聚丙烯管（赛默飞世尔科技，产品目录号：14-959-11A）。存放在RT
HBSS / FBS（请参阅食谱）
DMEM / BSA（请参阅食谱）
木瓜混合物（请参阅食谱）

探针杂交试剂
超纯水（Thermo Fisher Scientific，目录号：10977015）。存放在RT
16％多聚甲醛安瓿（Thermo Fisher Scientific，目录号：28908）。存放在RT
在每次实验前，通过在PBS中稀释来制备4％PFA。将整个安瓿（10 ml ）与30 ml PBS混合。使用前将新鲜的4％PFA稀释后使用。
Hoechst 33342（10 mg / ml ）（Thermo Fisher Scientific，目录号：H3570）。储存在4 °C
10％的Triton X-100（MilliporeSigma ，目录号：T8787）。存放在RT
将100％Triton X-100在UltraPure 水中稀释，并在室温下在振荡器上溶解过夜。
20x SSC（Thermo Fisher Scientific，目录号：15557044）。存放在RT
去离子甲酰胺（MilliporeSigma ，目录号：S4117）。分装并储存在-20 °C 。不要解冻并重新冻结
硫酸葡聚糖钠盐（MilliporeSigma ，目录号：D8906）。将粉末储存在4 °C
要制成50％的溶液，请将5 g的硫酸葡聚糖粉溶解在8 ml 的UltraPure 水中过夜，然后使总体积达到10 ml 。在-20 °C下储存50％硫酸葡聚糖
RNasin Plus（Promega，目录号：N2615）。储存在-20 °C
5米升圆底polysterene 试管用35 μ 米细胞过滤器帽（康宁，目录号：352235）。存放在RT
根据不同的组织和细胞类型的兴趣，其他过滤器尺寸是可用的（即，70 微米）。
Oligo探针和发夹（请参阅“ Oligo和发夹订购”一节）
荧光寡核苷酸（请参阅“ 探针杂交食谱”一节）
透化缓冲液（请参见配方）
FACS收集解决方案（请参阅食谱）
40％wHyb （请参阅食谱）
Hyb1（请参阅食谱）
探针混合物（请参见食谱）
荧光寡核苷酸混合物（请参阅食谱）

图书馆准备试剂
FFPE的RecoverAll 总核酸分离试剂盒（赛默飞世尔科技，目录号：AM1975）。按照套件用户手册中的说明存储组件
DNA LoBind 微量离心管（Eppendorf ，目录号：Z666548）。存放在RT
SMART-Seq v.4超低输入RNA试剂盒（Takara Bio ，目录号：634889）。按照套件用户手册中的说明存储组件
Nextera XT DNA文库制备试剂盒（Illumina，目录号：FC-131-1024）。储存在-20 °C
Nextera XT索引套件（Illlumina ，目录号：FC-131-1001）。储存在-20 °C
Ampure XP Beads（Beckman Coulter，目录号：A63880）。在RNA-Seq文库制备过程中需要4 °C的温度进行cDNA纯化
高灵敏度DNA分析试剂盒（安捷伦，目录号：5067-4626）。储存在4 °C
核分离试剂（可选）
蔗糖（MilliporeSigma ，目录号：S9378）。存放在RT
氯化钾（MilliporeSigma ，目录号：P9541）。存放在RT
MgCl 2 （MilliporeSigma ，目录号：M8266）。存放在RT
1 M Tris Buffer pH 8.0（Thermo Fisher Scientific，目录号：AM9855G）。存放在RT
蛋白酶抑制剂混合物（50 x ）（Promega，目录号：G6521）在DMSO中重新配制。储存在4 °C 将在4 °C 冷冻
DTT（Millipore Sigma，目录号：10197777001）。存放在RT
异戊烷（Millipore Sigma，目录号：32361）。存放在RT
缓冲区1（请参阅食谱）
均质缓冲液（请参见配方）
蔗糖缓冲液（请参见食谱）
蔗糖床（请参阅食谱）

设备
P200多通道移液器
P1000移液器
杂交烤箱（Bellco ，目录号：7930-01230）
可以设置在37 °C 和43 °C的任何其他杂交箱都可能工作。开始之前，请确保使用温度计测量温度。如果没有杂交烤箱，尽管没有经过测试，水浴也应该起作用。理想情况下，应使用2个烤箱。
离心机（Eppendorf ，型号：5804）
离心转子（Eppendorf ，型号：A-4-44）
任何其他离心机/转子，可容纳5米升聚丙烯管应该足够了。理想情况下，使用摆动的斗式转子，以使颗粒沉淀在管的底部。
具有405 nm，488 nm，561 nm和633 nm激光器的FACS区域（BD Biosciences）
可以使用其他FACS机器。我们还成功测试了MoFlo Astrios EQ。要注意的重要参数是激光器的可用性。如果使用633 nm激光，请确保使用具有633 nm激发荧光团的荧光寡核苷酸。
BioAnalyzer 2100（安捷伦）
热循环仪（Bio - Rad ，型号：C1000）。任何其他热循环仪都足够
杜恩斯匀浆器（Thomas Scientific ，目录号：1234F37）。仅用于核分离

软件
OligoMiner（Brian Beliveau，GitHub，https://github.com/beliveau-lab/OligoMiner）
UCSC基因组浏览器（UCSC，https ://genome.ucsc.edu ）
括号（Adobe，https://brackets.io）

程序
基因特异性探针组合成
注意：为了使用Probe-Seq最佳分离感兴趣的细胞类型，使用的标记是最重要的参数。基于其他方法，例如单细胞RNA测序，应验证标记物在目标细胞类型中高表达，尤其是表达。然后，检查成绩单的长度。理想情况下，转录本至少应为2 kb，以确保在BED文件中生成足够的寡核苷酸序列。这是可能的，然而，即较短的转录本（即，1 kb的）将产生足够的寡聚序列（> 20个寡聚物）。

寡头设计
改编自关于引物交换反应和SABER的原始协议（Kishi 等人，2018和2019 ）。

笔记：
Brian Beliveau先前已发布了秀丽隐杆线虫，D。melanogaster，H。sapiens ，A。thaliana，M。musculus和S. danios的全基因组探针组。如果您想使用其他物种，请参考OligoMiner （Beliveau et al。，2018）生成全基因组探针集。
最近创建了一个名为PaintSHOP 的用户友好型探针设计软件的Web版本（Hershberg 等，2020）。可以在这里访问该网站：https : //oligo.shinyapps.io/paintshop/。
下面用途描述的手动探针设计协议全基因组探针组具有35的长度窗口- 41个核苷酸，而新的平衡探针组油漆车间具有30的长度窗口- 37个核苷酸。因此，使用PaintSHOP 软件可望获得更多的寡核苷酸。
可以使用另一种探针设计软件（Passaro 等，2020）。可以在这里访问该网站：http : //oligominerapp.org/home。
但是，Probe- Seq的探针设计未使用这些网站，因为当时它们不可用。因此，我们尚未测试这些软件生成的探针。
在你开始前：
访问您机构的计算集群。
创建群集（上一个文件夹，即，“ SABER_Probe_Design ”）。
从Github 下载Brian Beliveau的OligoMiner -master文件夹：https : //github.com/brianbeliveau/OligoMiner。
转移群集上SABER_Probe_Design 文件夹中的OligoMiner -master文件夹。例如，使用终端机（Mac）中的rsync 命令在群集和本地计算机之间传输文件（如下所示的示例）。
从Ting Wu的OligoPaint 网站（https://oligopaints.hms.harvard.edu/genome-files）下载最喜欢的生物的全基因组探针集。
使用“平衡”设置下载“完整基因组”。解压缩文件，并在群集上的SABER_Probe_Design 文件夹中传输文件夹。
获取基因特异性BED文件（30分钟）
转到UCSC基因组浏览器：https : //genome.ucsc.edu/。
单击“基因组”，然后转到您生物体的基因组浏览器（即，对于鼠标，为GRCm38 / mm10）。
在搜索框（输入您选择的基因，即，Grik1），点击在下拉菜单中选择正确的mRNA转录[ 即，Grik1（小家鼠谷氨酸- [R eceptor，离子型，红藻氨酸1（GRI的K1），转录变异1，mRNA （来自RefSeq NM_146072），然后按Enter。
在查看器中使用正确的mRNA时，将光标悬停在“工具”上，然后单击下拉菜单中的“表浏览器”。
填写如下：
组：基因和基因预测
曲目：NCBI RefSeq
表：UCSC RefSeq （refGene ）
地区：位置
输出格式：BED
返回的文件类型：纯文本
命名输出文件（即，G ^ rik1_Mm）。
单击获取输出。
单击“外显子加两端的0个碱基”。
注意：如果目标RNA短且不能产生足够数量的寡核苷酸，包括内含子可能会有所帮助。如果使用核，则尤其如此，因为大多数RNA都是新生的。
点击“获取床”。这将下载您的BED文件。
打开BED文件。我们使用称为Brackets的软件，该软件可从http://brackets.io/免费下载。
如果列出了多个同工型（即，多个具有不同＃的NM_＃），请选择其中一个同工型并手动删除其他同工型。保存文件。
请注意BED文件中的2个功能，因为稍后将需要它们：
染色体数。
链取向为“ +”或“ -” 。
将BED文件传输到群集上的SABER_Probe_Design 文件夹中（即，在终端机（Mac）中键入“ rsync Grik1_Mm user@o2.hms.harvard.edu：/ home / user / SABER_Probe_Design ”）。
登录到集群。
注意：登录群集的方式因机构而异。

运行交互式模式（即，“ SRUN - PTY -p互动--mem 500M -t 0-06：00 /斌/庆典”）。
加载以下模块：
conda2（即，键入“ module load conda2 ”）。
床具（即，键入“ 模块负载床具/2.27.1 ”）。
任何其他依赖（即，GCC ）。
注意：每个群集的版本都不同。

在全基因组探针集（使用正确的染色体BED文件）和您的BED文件之间运行intersectBed ，选项为–f1 。（即，键入“ intersectBed –a mm10b / mm10_chr21b.bed –b Grik1_Mm –f 1> Grik1_Mm + _probes.bed ”）
笔记：

请确保你用全基因组探针组（即文件夹中运行此命令，mm10b）和特定基因床文件（即，Grik1_Mm）。
如果你有足够的计算能力，它也可以在本地运行此命令。
如果您的基因特异性BED文件的方向为“ +”，则需要反向补码。使用OligoMiner -master 文件夹中的probeRC.py 文件（即，键入“ python OligoMiner-master / probeRC.py –f Grik1_Mm_probes.bed –o Grik1_Mm-_probes ”）
将最终确定的基因特异性探针集文件传输到本地计算机（即，使用终端，在本地计算机上的文件夹中，然后键入“ rsync user@o2.hms.harvard.edu：/ home / ra108 / SABER_Pr obe_Design /Grik1_Mm-_probes.bed 。”
打开基因特异性探针组文件（即，用括号内）一次看你有多少寡核苷酸有。
注意：足够的寡核苷酸数量对于成功的Probe-Seq至关重要。我们已经使用了多达12个寡核苷酸用于高表达转录本，并通过FACS进行了很好的分离。但是，总的来说，越多越好。对于低表达的转录本，或少于20个寡核苷酸，Probe-Seq可能无法正常工作。

Oligo和发夹订购（10分钟+等待合成和交付的时间）
注意：没有引物序列的寡核苷酸包含与RNA杂交的序列，但不包含与发荧光寡核苷酸杂交的发夹连接物。在探针组合成步骤中，将特定的发夹引物序列附加到寡核苷酸序列上，以连接发夹连接体（请参见下文）。因此，在此步骤中，确定哪个发夹将用于哪个基因。如果将两个基因用于一种，则应添加两个不同的发夹引物序列，因为荧光寡核苷酸会与发夹区域杂交。例如，为了使用Vsx2和Grik1对两个种群进行分类，对于Vsx2，在每个寡核苷酸序列中添加25.25发夹引物序列（“ CCAATAATA”），并在探针集合成步骤中使用25发夹扩展Vsx2寡核苷酸，而对于Grik1 ，在探针组合成步骤中，将27.27发夹引物序列（“ CATCATCAT”）添加到每个寡核苷酸序列，并用27发夹延伸Grik1寡核苷酸。然后，将25.488 nm的荧光寡核苷酸和27.565 nm的荧光寡核苷酸杂交，分别检测Vsx2和Grik1。
为了订购寡核苷酸，我们使用IDT。其他公司的寡核苷酸未经测试。
转到www.idtdna.com，然后在“产品和服务”下单击“自定义DNA寡核苷酸”。
在“ DNA寡核苷酸”下，单击“立即订购”和“所有订购选项”。
在“订购”下，单击“板”，然后以96孔格式订购25 nmole DNA Plate oligo。
注意：对于大多数实验，25 nmole 可以进行数千次Probe-Seq实验，这可能会过多。如果可能的话，为了更小的DNA（即，10 纳摩尔），以减少成本。
单击“上样板”并下载样品订购模板。
用Excel打开模板。
将特定于基因的探针集文件的内容复制并粘贴到Excel模板的未使用区域中。
将寡核苷酸序列复制到“序列”下的列中。删除其他粘贴的信息。
对于每个寡核苷酸序列，添加“ TTT”和一个引物序列。根据我们的经验，效果良好的发夹引物序列为：
25.25 CCAATAATA
27.27猫
28.28 CAACTTAAC
36.36 AACTAATCT
注意：我们小组和其他人使用了其他发夹。但是，这些是最稳定起作用的发夹。对于其他发夹，请参阅Oligonucleotide_List文件。

对于每一行，序列应读为“（寡核苷酸序列）TTT （引物序列）” 。
注意：您可以在Oligonucleotide_List文件中找到序列的示例。
名称与基因的名称每一行，用发夹和numbe R（即，Grik1_25_1，Grik1_25_2 ...）。
许多基因可以容纳在一个板上，但它是明智的，在一个新行每次（一个新的基因开始即，如果Grik1寡核苷酸使用30口井，因此3行：2个全行+ 6口井，那么Grm6启动寡核苷酸应该开始上4 个列）。
在IDT上载Excel文件。
在印版规格下，使用以下命令：
规模：10 nmole （或25 nmole ）
纯化：标准脱盐
板型：V形底
运送选项：湿
缓冲液：IDTE 7.5 pH
归一化类型：归一化产量
数量：5 nmol
浓度：100 µM
容量：50 µl
订购板。
当板到达时，解冻的寡核苷酸，并使用P200多道移液器吸取到寡聚成STER ILE储器（即，MilliporeSigma ）汇集寡聚。合并的寡核苷酸可在-20 °C下保存。
通过用IDTE pH 7.5（IDT）稀释100 µM储备液来制备合并的寡核苷酸（10 µM）的工作储备液。

笔记：

请勿使用其他TE缓冲区。
工作物料可以多次冻融。
按SABER 的Oligonucleotide_List 或Supplementary Files（Kishi 等人，2019）或Probe-Seq（Amamoto 等人，2019）论文中的顺序订购发夹。可以订购将它们干燥，然后以100 µM的储备溶液重悬于IDTE pH 7.5。可以使用IDTE pH 7.5制备工作储备液（5 µM），并分装以备将来使用。
注：25发夹需要一个InvdT 在3'端和HPLC纯化。

探针组合成（2-3小时）
在冰上的PCR管中添加以下试剂：
超纯水44.5 µl
10x PBS 10 微升
100mM MgSO 4 （NEB）10 微升
dNTP（A，C，T 每个6 mM，NEB）5 µl
Clean.G （1 µM）10 µl
BST酶（McLab ）0.5 µl
发夹（5 µM）10 µl

笔记：
通过将dATP ，dCTP 和dTTP 混合至最终浓度为6 mM 来制备6 mM A，C，T dNTP 。
通过IDT按以下顺序订购Clean.G （标准脱盐，用UltraPure 水稀释）：CCCCGAAAGTGGCCTCGGGCCTTTTGGCCCGAGGCCACTTTCG 。
在热循环仪中，于37 °C 孵育15分钟。
加入10 µl 的寡核苷酸池（10 µM）并混合。
在37 °C 下孵育100分钟，在80 °C 下孵育20分钟，在4 °C 下无限期孵育。您可以将此未纯化的反应保存在-20 °C 。
用8 µl 未纯化的探头组检查扩展的探头组的长度，然后将其与1.6 µl 的6x上染液混合（或其他足够的上样液即可）。运行在1.25％溴化乙锭的琼脂糖凝胶（2 - 3μ 升的EtBr的用于50米升体积）中在150 V代表8分钟。乐队应该是300之间- 700 基点。有关示例凝胶，请参见图2。

笔记：

较长的运行时间会导致频段变暗。预计会出现两个频段- 顶部频段是扩展的探针，底部频段包含催化发夹和C lean.G oligo。即使纯化后，该底带仍然存在，甚至可能有助于在存储过程中稳定长的ssDNA探针。
如果探针组太短或太长，您可以将扩展时间从100分钟更改为80分钟（如果太长）或120分钟（它太短）。发夹数量也可以更改。例如，如果使用10 μ 升发夹，并在〜250bp的探头运行时，可以尝试发夹加倍到20μ 升（和降低的水的量在反应）于长度理论上一倍至500bp。

图2.三种基因特异性探针组的示例DNA凝胶。左侧泳道是带有红色标记的500 bp条带的DNA阶梯。对于每个泳道，底带是未延伸的发夹和其他小DNA片段。顶部带是扩展的探针组。这些条带总是模糊的，因为探针是ssDNA。

纯化剩余的92 μ 升使用探针组的MinElute PCR纯化试剂盒（Qiagen）。我们使用7倍PB缓冲液（约5倍）以提高结合效率。
洗脱在25μ 升的超纯水中。
使用ssDNA设置通过NanoDrop 确定浓度。的浓度应为〜200 - 400纳克/μ 升。
将纯化后的探针组储存在-20 °C下。可以耐受冻融。
探针序列：第1天

笔记：
如果Probe-Seq由于任何原因而失败，请查看文档末尾的《故障排除指南》。
如果您有兴趣使用冷冻组织中的细胞核，请参阅附录。
组织解离（30分钟）

笔记：
对于不同的组织，解离可能不同。此解离协议适用于成年小鼠视网膜。
如果从已经解离的细胞开始，则从探针杂交开始（第12步）。
准备所有解决方案。
注意：请确保已将RNasin 添加到所有解决方案中。木瓜混合物应移至37 °C 加热约15分钟。HBSS / FBS和DMEM / BSA应该在室温下。应将4％PFA和通透缓冲液放在冰上。40％wHyb （每个样品加热500 µl ）和混合探针应加热到43 °C 。
在RT处用HBSS或PBS解剖视网膜。
将视网膜放入微量离心管中，并除去大部分PBS / HBSS，而不会干扰视网膜组织。
加入400 微升预热（37 ℃ ）木瓜蛋白酶混合物。
在没有搅拌的情况下，在37 °C下孵育7分钟。
在室温下旋转600 xg （rcf ）2.5分钟。
除去上清液，并在不搅拌的情况下添加1 ml HBSS / FBS。
在室温下旋转600 xg 2.5分钟。
除去上清液，然后加入600 µl DMEM / BSA。
通过用P1000移液器研磨组织来分离。大约15次进/出移液应足以解离成单个细胞。溶液应均匀，没有可见的团块。
注意：避免气泡。如果在此阶段存在大块碎片或成团的细胞，请使用移液器或镊子小心将其清除。
将匀浆转移至5 ml 聚丙烯管（Thermo Fisher Scientific）中。确保通过推入将盖密封。
探针杂交（约1小时动手+过夜孵育）
在4 °C下旋转600 xg 5分钟。
注意：如果没有温度控制的离心机，也可以使用RT旋转。但是，可能会有更多的RNA降解。
除去上清液，然后加入1 ml 4％PFA。重悬。在摇动下于4 °C 孵育15分钟。

笔记：

为了最大程度地减少细胞损失，每个旋转步骤后，可在底部留出约50 -100 µl 的液体。
对于含有大量碎片的组织（例如，小鼠或人脑），孵育15分钟后，可以使用FACS细胞滤网进行额外过滤。这可以改善染色指数。
在4 °C下将2,000 xg 旋转5分钟。
注意：固定后，离心速度已更改为2,000 xg。
除去上清液，然后加入1 ml 透化缓冲液。重悬。在摇动下于4 °C 孵育10分钟。
在4 °C下将2,000 xg 旋转5分钟。
除去上清液，然后加入500 µl 预热（43 °C ）40％wHyb 。重悬。在烤箱中于43 °C 孵育至少30分钟。
注意：如果在原位杂交炉不可用（即，Bellco ），水浴应该足够了，尽管它尚未在我们的实验室测试。
在室温下将2,000 xg 旋转5分钟。

笔记：

更换液体时，快速执行每个步骤以最小化温度变化至关重要。理想情况下，烤箱和离心机应靠近在一起。
将探针混合物和样品添加到样品中时，其温度必须在43 °C ，这一点至关重要。如果在较低的温度下添加探针混合物，则可能会发生探针的明显脱靶结合，从而导致不需要的背景。这对于随后添加用于洗涤的wHyb 溶液也很重要。
从这里开始，直到FACS才需要重新悬浮。重悬将导致细胞卡在移液器吸头中。
除去上清液，然后加入100 µl 预热的（43 °C ）探针混合物。在烤箱中于43 °C 孵育至少16 h 。
探针序列：第2天
荧光寡核苷酸杂交（〜2小时）
注意：如果不对样品进行RNA测序，并且在FACS之后RNA的质量并不重要，则可以进行更长的孵育。将孵育时间增加至2个过夜孵育（〜48小时）会增加染色指数。但是，经过如此长时间的孵育后，RNA质量尚未得到测试。

准备所有解决方案（请参阅食谱）。
笔记：
确保已将RNasin 添加到所有解决方案中。
开始前约30分钟，则应该暖40％wHyb （1米升/样品）和2 X SSC（1米升/样品）至43 ℃下。达到43 °C 至关重要。
此时，应将另一个烤箱设置为37 °C ，以进行荧光寡核苷酸杂交和洗涤。您应将Fluorigo Oligo Mix和PBS（1.5 m l /样品）加热至37 °C 。
如果您使用的是单炉工作时，你可以暂停后小号TEP 24 下方。取下2上清液X SSC洗涤（留下约100 μ 升和盖紧瓶盖，以防止干燥）和烘箱温度切换到37 ℃下。将样品放入37 °C 的烤箱中，等待约10分钟以达到平衡。然后，恢复在小号TEP 25 下面通过加入预热的37 ℃的PBS中。
加入500 µl 预热的（43 °C ）40％wHyb ，在室温下以2,000 xg 旋转5分钟。
注意：在40％wHyb中孵育后，沉淀可能变得透明。继续离开〜100 μ 升除去上清液时避免干扰颗粒在管中。

除去上清液，然后加入500 µl 预热（43 °C ）40％wHyb 。在43 ° C下孵育15分钟。
在室温下将2,000 xg 旋转5分钟。
除去上清液，加入1米升的预热（43 ℃）2×SSC。在43 °C下孵育5分钟。
在室温下将2,000 xg 旋转5分钟。
除去上清液，然后加入500 µl 预热的（37 °C ）PBS。
在室温下将2,000 xg 旋转5分钟。
除去上清液，然后加入100 µl 预热的（37 °C ）荧光寡核苷酸混合物。在37 °C下孵育10分钟。
加入500 µl 预热的（37 °C ）PBS，在室温下以2,000 xg 旋转5分钟。
除去上清液，然后加入500 µl 预热的（37 °C ）PBS。在37 °C下孵育5分钟。
在室温下将2,000 xg 旋转5分钟。
注意：在重悬之前，请使用FACS收集溶液（BSA / PBS）上下吸移管，以BSA覆盖移液管吸头内部，以帮助最大程度地减少粘在移液管吸头内部的细胞。
根据细胞数重悬于500-1,000 µl PBS中。将试管放在冰上。
过滤进入FACS细胞滤网并进行FACS。
注意小号：
一个。确保每人带入装有500 µl FACS收集溶液的收集管（微量离心管）。
b。为了在FACS之前观察细胞，将10 µl 悬浮液吸移到载玻片上并风干。盖玻片与安装介质。

流式细胞仪（〜30分钟，用于100万个细胞）
闸门首先基于Hoechst直方图（图3 ）。此步骤将确保您获得2N个单元。确保不包括双峰。您也可以基于FSC / SSC选通单元与碎片，但是此步骤可能不必要，因为碎片对Hoechst不利。
注意：如果您的组织包含多倍体细胞（4N +细胞），则很难将它们与双峰或其他细胞团区分开。在这种情况下，最好使用核Probe-Seq协议。
使用具有适当波长的2D图进行门控。负人口可能会成对角线。正人口将向左或向右偏移相比对角线事件（即，牛逼他Vsx2 + 细胞）。通常，分离不会像GFP或特征明确的细胞表面标记那样明显。因此，最好使用阴性对照（仅荧光寡核苷酸对照）。

图3. Probe-Seq的FACS门控策略。A. 使用Hoeschst 直方图，首先对单个单元格峰进行门控。B. 单细胞事件的百分比将取决于组织。例如，与视网膜相比，小鼠视网膜的单细胞事件百分比更高，这是因为在视网膜的分离协议期间生成的碎片更少。在单细胞事件中，确定感兴趣的群体。在此，在x轴上指示Vsx2荧光，并且Vsx2 + 群体相对于负群体右移。建议使用一个空的自发荧光通道作为相对轴，因为这将有助于确定所有通道中具有高荧光的事件。*即使它们在Vsx2通道中具有很高的荧光强度，也不要收集这些事件。对于空的自发荧光（561 nm）通道，这些事件也具有很高的荧光强度。如果使用直方图或没有自发荧光通道的图，这些事件看起来就像是Vsx2 +，即使它们不太可能成为关注的人群。

注意：建议不要使用一个激光通道，因为这可用于确定自发荧光（即，图3中的561 nm通道）。如果是在你的利息（即通道高度荧光事件，该Vsx2通道）和自身荧光通道（即，561 纳米），这些事件可能萤光所有通道（即，细胞指示由FACS *情节）。对于真正阳性的细胞，它们通常形成事件簇，而不是流。因此，不应收集这些事件。
将FACS分离的细胞在微量离心管中分选到FACS收集溶液中（从每个管中已有的500 µl 开始），并保持在4 °C下。这不是一个停止点。尽快进行去交联步骤。
注意：FACS收集解决方案中的BSA有助于在后续步骤中沉淀细胞。

去交联和RNA分离（〜4 h）

将收集的细胞转移到5 ml 聚丙烯管（带白色帽）中。
在4 °C下以3,00 0 xg 旋转7分钟（如果没有温度控制的离心机，则在室温旋转）
注意：在RT离心也是可以的。注意旋转速度的变化。

除去尽可能多的上清液。通常，剩余量约为40-50 µl 。取决于细胞数量，沉淀可能不可见（即，10,000个细胞不可见）。
从用于FFPE 的Recoverall 总核酸分离试剂盒（赛默飞世尔科技公司）中，每个样品混合100 µl 消化缓冲液和4 µl 蛋白酶。
将消化缓冲液/蛋白酶混合物（104 µl ）加入沉淀中。重悬。
如果可用，将重悬的细胞转移至DNA LoBind 微量离心管（Eppendorf）。用封口膜包裹盖子。
在50 ℃下孵育3小时。
注意：此孵育时间与制造商的规程不同。

3小时后，可将样品无限期保存在-80 °C 或根据试剂盒规程进行下一步。

停顿点

制备隔离添加剂/乙醇混合物（用于100 µl 消化液，120 µl 隔离液+ 275 µl 100％乙醇。通常大约为140 µl，因此请进行相应调整）。
加入隔离液/乙醇混合物并用移液器混合。
加到过滤器上，在室温下以10,0 00 xg 旋转30 s。
丢弃流通。用700 µl 洗涤液洗涤1. 在室温下将10,000 x g 旋转30 s。
丢弃流通。用500 µl 洗涤液2洗涤。在室温下旋转10,000 x g 30 s 。
丢弃流量。在室温下旋转10,000 xg 30 s。
制备DNase混合物（6 µl 10x DNase缓冲液，4 µl DNase，50 µl UltraPure 水）。
将60 µl 的DNase Mix加到药筒中心。盖上盖子，在室温下孵育30分钟。
加入700 µl 洗涤液1，在室温下孵育1分钟。在室温下旋转10,000 xg 30 s。
丢弃流通。用500 µl 洗涤液2 洗涤两次。
旋转10,000 xg 1分钟以除去残留的液体。
在〜17 µl 的UltraPure 水中洗脱（如果需要更低的浓度，请使用更多的水。以17 µl的洗脱将为您留下约12 µl 的RNA，足以用于SMART-Seq v.4，Qubit和/或生物分析仪）。
将RNA储存在-80 °C 。

停顿点

注意：Qubit或BioAnalyzer 可用于估计RNA浓度。如果少于10,000个细胞，则这些方法可能无法浓缩。在这种情况下，使用9.5 µl RNA作为起始体积直接进行SMART-Seq v.4 。

按照制造商的规程进行SMART-Seq v.4规程，以进行cDNA合成和扩增。根据细胞数量，您将使用1-9.5 µl RNA进行cDNA合成。
注意小号：

循环数将取决于细胞类型，RNA浓度，RNA完整性。目标是使用最少的循环次数获得〜500 pg / µl cDNA。这将确保尽可能小的扩增偏差，同时具有足够的cDNA供后续步骤使用。一种策略是与你的纯化的RNA的20-50％具有高数量的周期（即，以执行SMART-SEQ ，18个循环），然后计算从那里所需的循环的数目。
如果您收集了基因阴性和基因阳性种群，并且想知道是否收集了正确的细胞类型，则可以在此阶段使用细胞类型特异性标记物运行qPCR或ddPCR 。
其他图书馆prepration 套件可以使用。但是，它们尚未经过测试。
将150 pg cDNA用于Nextera XT文库试剂盒。
注意：HS DNA BioAnalyzer 芯片应在SMART-Seq v.4协议之后和Nextera XT索引之后在BioAnalyzer 2100 上运行，以确保正确构建文库。

附录：核分离（30分钟）

笔记：
所有的FISH试剂均与整个细胞方案相同。在开始之前，请确保将RNasin 添加到每个解决方案中。另外，在开始核分离之前，请确保预热试剂。40％wHyb （每个样品加热500 µl ）和混合探针应加热到43 °C 。
因为仅使用核RNA作为标记，所以与整个细胞相比，信号强度可能会降低。因此，标记基因的表达水平和转录长度将更为关键。
如果未检测到足够的信号，则可以设计带有外显子和内含子序列的寡核苷酸，它们应存在于新生核RNA中。
与整个细胞相比，提取的总RNA含量较差。因此，执行SMART-Seq v.4时，将需要更多的循环来扩增您的cDNA。
这种核隔离方法适用于小鼠，人类的视网膜和大脑。尚未针对其他生物中的其他组织进行过测试。
这种核分离是针对冷冻组织的。如果您有新鲜纸巾，请用异戊烷/干冰浆快速冷冻纸巾。尚未使用固定冷冻的组织测试此核分离方案。开始之前，请将收集管放在干冰上。组织直接进入浆液，组织周围没有太多残留液体。快速将冷冻的组织转移到收集管中。保持在-80 °C 。
准备好所有的解决方案，并保持在冰上用Dounce匀浆（即，托马斯科学）。
向玻璃Dounce均质器中加入1 ml 冷均质缓冲液。保持冰上。
将组织切成小块，放在1％PFA中的冰上5分钟。
用缓冲液将组织碎片转移到均质器中。用紧紧的杵在冰上匀浆10-15次。避免起泡。
将匀浆转移至5 ml 聚丙烯管中（Thermo Fisher Scientific）。确保通过推入将盖密封。
小心地将2 ml 的蔗糖床溶液添加到试管底部，以使匀浆液位于蔗糖溶液上方。
在500 xg ，12分钟，4 °C下旋转。
除去上清液。加入1 ml 4％PFA溶液并重悬沉淀。在摇动下于4 °C 孵育15分钟。
注意：首先去除顶层上清液。然后，除去剩余的上清液。
在4 °C下以2,000 xg离心5分钟。
转到Probe-Seq协议的Probe Hybridization （探针杂交）下的步骤17 。

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故障排除指南

表1 。故障排除指南

问题
可能的解决方案
探针不延伸
确保所有溶液均已稀释在正确的溶液中（水与IDTE pH 7.5对PBS）。
检查订购的寡核苷酸序列是否已添加“ TTT”接头和发夹引物序列。
在探针合成过程中，请确保寡核苷酸上的发夹引物与发夹匹配（即，Grik1.25和25.25发夹）。
有基因阳性和基因阴性事件之间没有分离
确保标记基因高表达。
检查寡核苷酸的数量。如果少于15-20，则可能没有足够的切片寡核苷酸，因此可能需要新的标记基因。
在更换溶液时，请确保溶液的温度不偏离适当的温度（即43 °C ）。
细胞聚集在一起
确保您不在wHyb 或Probe Mix中使用Tween-20 。
分离组织更长的时间。
对于您感兴趣的组织可能还有其他解离方法。
信号强度不足以区分人群
如果寡核苷酸数量少，则可以在生成探针组时尝试同时使用外显子和内含子。这尚未在我们手中进行测试，但它应该会增加信号。
使用更多的探针（2 µg而不是1 µg）。
孵育时间更长（24小时而不是16小时）。

菜谱
视网膜分离食谱（如果使用其他组织，则为可选）

笔记：

特别是对于探针杂交/探针合成试剂，只能使用具有以下目录编号的试剂。我们尚未测试过其他公司生产的各种试剂。
这些体积是每个样品的体积，除了DMEM / BSA（用于5个样品）。如果对多个样品执行Probe-Seq，请相应地调整音量。
HBSS /胎牛血清
HBSS 900 微升
FBS 100 微升
总体积1,000 µl
DMEM / BSA
DMEM 3,000 微升
BSA 12毫克
总体积3,000 µl
木瓜粉
HBSS 315 微升
1 M HEPES pH 7.0 35 微升
50 mM半胱氨酸20 µ l
0.5 M EDTA pH 8.0 0.4 µl
UltraPure 水19.6 µl
木瓜10 微升
总体积400 µl

笔记：
实验前请使以上溶液新鲜。
将HBSS / FBS和DMEM / BSA保持在室温。
木瓜混合物应在使用前于37 °C 孵育10分钟。最初多云，变暖后变晴。
每使用1 ml 的溶液，添加1 µl 的RNasin Plus（Promega ）。使用前，将其与RNasin 孵育至少10分钟。

探针杂交食谱
的SABER FISH试剂的详细信息可以在原始SABER FISH论文中找到（癸巳等人，2019）。有关基因特异性探针组设计的详细协议，请访问saber.fish 网站。这是Probe-Seq所需的试剂：
通透缓冲液
PBS 989 微升
Hoechst 33342（10 mg / m l ）1 µl
10％Triton X-100 10 微升
总体积1,000 µl

实验前要新鲜
FACS 收集溶液（1％BSA / PBS）
BSA 10毫克
PBS 1,000 微升
总体积1,000 µl

实验前要新鲜
40％wHyb
20X SSC 5米升
超纯水25 m l
去离子甲酰胺20米升
总容积5000万升

储存在-20 °C 。该溶液不应在-20 °C 冻结
预温至4 ℃，使用前
注意：与原始的SABRE-FISH论文相比（Kishi 等人，2019），这些解决方案不包含Tween-20。这是因为我们发现Tween-20会导致解离的细胞结块。

Hyb1
20X SSC 1米升
超纯水1米升
去离子甲酰胺4米升
50％硫酸葡聚糖2米升
总容积8百万升

在-20 °C下储存120 µl 等分试样。该溶液不应在-20 °C 冻结
探针混合
Hyb1 96 微升
纯化探针组1 µg
最高120 µl的UltraPure 水
预温至43 ℃，在使用前

笔记：
已显示将纯化探针的量设置为2 µg会增加荧光强度。尚不清楚是否达到2 µg的饱和点。因此，更多的探针组可以改善荧光强度。
纯化的探针组的总体积不能超过24 µl 。
荧光寡核苷酸混合物
PBS 100 微升
10 µM荧光寡核苷酸2 µl （每个）
预温至37 ℃，在使用前

笔记：
荧光寡核苷酸是从IDT订购的。序列和荧光标签（位于5'端）可以在Oligonucleotide_List文件中找到。列出了每个发夹2种不同的荧光团，但也可以使用其他荧光团。它们再悬浮在超纯水中为100 μ 中号股，和10 μ 米工作原液（在水中稀释）可以被等分并储存在-20 ℃下。
加1 μ升的的RNasin P 的LU（Promega公司）为每1米升使用的每个溶液。使用前，将其与RNasin 孵育至少10分钟。
核分离食谱
缓冲区1
1.5 蔗糖2 ，500μ 升
1 M KCl 375 微升
1 M氯化镁2 75 µl
1 M Tris缓冲液pH 8.0 150 µl
超纯水11 ，900μ 升
总体积15 ，000μ 升

缓冲液1可以在4 °C下保存长达6个月
均质缓冲液
缓冲液1968 µl
10％Triton X-100 10 微升
蛋白酶抑制剂（50x）20 µl
1 mM DTT 1 µl
Hoechst 33342 1 微升
总体积1,000 µl

均质缓冲液应新鲜
注意：每个样品需要1 ml 均质缓冲液。
蔗糖缓冲液
1 中号的KCl 2 ，250μ 升
1 中号的MgCl 2 450μ 升
1 M Tris缓冲液pH 8.0 900 µl
超纯水11 ，400μ 升
总体积15 ，000μ 升

蔗糖缓冲液可在4 °C下保存长达6个月
蔗糖床
蔗糖缓冲液2 ，500μ 升
24％蔗糖12 ，500μ 升
总体积15 ，000μ 升

蔗糖床可在4 °C下保存长达6个月
注：加1μ 升的的RNasin 加（Promega公司）为每1米升使用的每个溶液。使用前，将其与RNasin 孵育至少10分钟。

致谢
我们要感谢Cepko 和Tabin 实验室的前任和现任成员所进行的深入讨论和反馈。感谢C. Araneo ，F。Lopez 和流式细胞仪核心设施在流式细胞仪技术方面的协助。这项工作得到了霍华德·休斯医学研究所（JC，CLC和NP），爱德华·R。和安妮·G· 莱夫勒博士后奖学金（RA），HSCI实习计划（MDG）和NIH NEI K99 / R00 Grant 5K99EY028215（SWL）的支持。该协议从原始探针- SEQ和SABER手稿衍生（Amamoto 等人，2019;岸等。人，2019）。

利益争夺
作者宣称没有利益冲突。

伦理
根据哈佛大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的方案处理所有动物（协议编号：1695）。

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