材料和试剂
1. Kimwipes （Kimberly-Clark专业人士，KimTech 科学品牌，目录号：34155）
2. 设置微量的，以体积范围为0.5至1 ，000 微升（通用）
3. 适当大小的无菌微量移液器吸头（通用）
4. 2毫升移液器灯泡（VWR，目录号：82024-554）
5. 巴斯德移液器（VWR，目录号：14672-380）
6. 玻璃温度计，范围20-100 °C（通用）
7. 1.5 ml试管（Eppendorf Safe-lock微量离心管，目录号：022363204）
8. 凝胶上样移液器吸头（Fisher Scientific，Fisher Brand，目录号：02-707-181）
9. MTC Stop-Pop锁定管夹（MTC Bio，目录号：C2086）
10. 细菌纯化的HYPE 102-456 （WT，E234G和E234G / H363A）（Sanyal 等，2019）
11. 细菌纯化的全长α-syn（Sanyal 等，2019）
12. ddH 2 O（ELGA LabWater ，PURELAB Flex 2分配器，型号：PF2XXXXM1）

13. HEPES（Sigma-Aldrich，Sigma-Millipore，目录号：H4034）

14. 四水合氯化锰（Sigma-Aldrich，Sigma Millipore，目录号：M3634）

15. 12.1 N盐酸（Fisher Scientific，Fisher Chemical，目录号：A144-212）
16. 50％（w / w）氢氧化钠溶液（Fisher Scientific，Fisher Chemical，目录号：SS254-4）
17. Tris base（Fisher Scientific，Fisher生物试剂，目录号：L-15863）
18. 氯化钠（Fisher Scientific，费希尔化学，目录号：L-11620）
19. 甘油（Fisher Scientific，费舍尔生物试剂，目录号：L-13751）
20. α- 32 P-ATP 3000CI /毫摩尔10mCi / ml时，250微居里仪（Perkin Elmer，BLU003H250UC）
21. 4-20％预制SDS-PAGE凝胶（Bio-Rad，Mini-PROTEAN TGX凝胶，目录号：456-1091）
22. 蛋白梯（Bio-Rad，Precision Plus蛋白双色标准液，目录号：1610374TGX）
23. 2-巯基乙醇（Sigma - Aldrich，Sigma Life Sciences，目录号：M3148）
24. 十二烷基硫酸钠（Sigma - Aldrich，Sigma Life Sciences，目录号：L4390）
25. 溴酚蓝钠盐，ACS（Alfa Aesar ，目录号：32639）
26. 甲醇（Fisher Scientific，Fisher Chemical，目录号：L-21063）
27. 冰醋酸（Fisher Scientific，Fisher Chemical，目录号：A38C-212）
28. 甘氨酸（Fisher Scientific，费舍尔生物试剂，目录号：L-15696）
29. 考马斯亮蓝R-250（Amresco ，目录号：0472-25G）
30. 荧光屏（通用电气，柯达荧光粉存储屏，目录号：00146931）
31. 蛋白质存储缓冲液（请参阅食谱）
32. 10 x AMPylation Buffer（请参阅食谱）
33. 4 x SDS-PAGE加载缓冲液（请参阅配方）
34. 1 x SDS-PAGE运行缓冲区（请参阅食谱）
35. 考马斯染色（见食谱）
36. 染色（请参阅食谱）

设备
0.5英寸厚的有机玻璃或Lucite防护罩（Nalgene丙烯酸台式Beta辐射防护罩，Thermo Fisher，目录号：6700-1812）
盖革计数器（Model 3 Survey Meter，Ludlum Measurements，model：44-7）
ddH 2 O分配器（PURELAB Flex 2分配器，ELGA LabWater ，型号：PF2XXXXM1）
加热块（Analog Heatblock ，VWR，目录号：12621-108 ）
pH计（Seven Eas y，Mettler Toledo，目录号：1227396066 ）
离心机（Eppendorf，型号：离心机5417C，货号：0023210）
电源（PowerPac 300 / DCo de ，Bio-Rad，型号：PowerPac 300）
PAGE系统（Mini-PROTEAN Tetra Cell，4-Gel System，Bio-Rad，货号：1658004）
荧光图像分析仪（Typhoon FLA 9500，通用电气，型号：Typhoon FLA 9000）
荧光屏橡皮（FLA图像橡皮，通用电气，型号：FLA图像橡皮）
翘板（VWR，Rocking Platform，型号：200）
图像扫描仪（Epson，Epson Perfection V700照片）

软件
台风FLA 9500（通用电气）

程序
酰化反应
注意：该协议要求使用放射性α - 32 P-ATP。因此，所有放射性物质或与之接触的物质都必须按照您所在机构的放射性安全准则进行处理，存储和处置。必须始终在辐射屏蔽层后面处理放射性。应使用盖革计数器连续监控工作环境中的放射性污染。始终应穿戴适当的个人防护设备。
将ddH 2 O的计算体积吸取到指定的1.5 ml管中。
用移液管将计算量的10 x AMPylation Buffer移入指定的1.5 ml管中。
注意：可以根据需要修改10 x AMPylation Buffer的成分，以适应不同的实验条件，例如酶，底物等。
移取2μg纯化的重组HYPE酶至指定的1.5 ml管中。
注意小号：
反应的最终体积为20 µl。只要维持≥10：1的摩尔底物：酶摩尔比，并且可以将可检测量的每种蛋白质（即≥0.1μg）加载到凝胶上，就可以修改实际的反应量。
如前所述（Sanyal等，2019）纯化所有蛋白质，并溶解在蛋白质存储缓冲液中。
如果需要重新运行凝胶，建议准备所需样品量的两倍。
吸取20μg纯化的重组α-syn（或其他底物）到指定的1.5 ml管中。
注意：在进行动力学实验或并排比较不同的底物时，应使用摩尔浓度，以确保反应中分子的相对数量一致。
吸管2.5 微居里α- 32 P-ATP到指定1.5毫升管中。
注意小号：
反应开始时间从添加α - 32 P-ATP 开始。由于α - 32 P-ATP是唯一的放射性成分，因此可以在标准实验室工作台中添加其他样品成分，然后可以将样品运输到指定的放射性区域进行α - 32 P-ATP添加。
取决于测试酶的催化效率和/或核苷酸的新鲜度，可以使用α - 32 P-ATP的替代浓度。这些浓度应凭经验确定。理想情况下，应在α - 32 P-ATP 的前半衰期（14.3天）内发生AMPylation 反应。
在设置为30°C的加热块中孵育样品30分钟。
注意小号：
确保将加热块放在防辐射罩后面。
为了获得最佳的酶活性，不同的AMPylase 可能需要不同的反应温度或持续时间。
可以将样品以2000 x g 的速度快速离心5 s，以固结不在试管底部的任何样品成分。
用适当体积的4 x SDS上样缓冲液淬灭反应。
在加热块上于95°C加热样品10分钟。
注意：确保将管盖完全关闭，以免加热期间管盖突然弹开。可以将加重的样品托盘平放在试管盖上，以防止打开。或者，可以使用MTC Stop-Pop定位管夹（MTC Bio，Inc. ）。
以2,000 xg 的速度离心样品5秒钟。

SDS-PAGE分离

小心地从预制胶盒上取下梳子和绿色密封胶带。
根据制造商的说明组装凝胶盒和水箱。
注意：虽然在凝胶盒组件内部应使用新鲜的1 x 运行缓冲液，但也可以使用1 x 运行缓冲液填充槽。
使用移液器吸头，小心地将2-4μl 蛋白质梯添加到第一个泳道中。
使用凝胶上样移液器吸头，小心地将每种样品的10-30μl 上样到与第一个泳道相邻的泳道中。
牢固关闭水箱盖。
在恒定的200 V下运行凝胶45分钟。或者，可以通过以下方法获得更好的条带分辨率：首先将凝胶在80 V下运行约30分钟（直到样品清除堆积层），然后再升至120 V约1小时（直到染料前沿到达参考线上的凝胶盒）。
注意：通过在运行缓冲液中产生气泡并确保染料前移向凝胶底部，确保适当的电流流动。
荧光粉成像
使用暗盒杆小心取出凝胶。
注意：凝胶此时具有放射性，应根据您所在机构的放射性物质法规/准则进行处理和处置。
将凝胶放在干净的塑料盖板之间。消除凝胶中的任何气泡。
将带有凝胶的封面放在干净的荧光屏的成像面（白色）的顶部。
注意小号：
每次使用后都应使用荧光屏擦除器擦除荧光屏，以防止信号污染。
避免触摸荧光屏的成像面，否则可能会损坏屏幕。
将荧光屏和凝胶小心地放在泡沫荧光屏存储容器内。
在室温下将屏幕暴露3小时。
注意：磷光屏的暴露时间取决于AMPylation 反应参数，因此必须凭经验确定。
将磷光体屏幕成像面朝下放在成像器中。
注意：在成像之前，请确保成像仪屏幕上没有碎屑，因为它们可能会掩盖样品信号。应根据需要使用Kimwipes 和ddH 2 O清洁成像仪屏幕。
打开Typhoon FLA 9500软件。
在“模式设置”下，选择“ 磷光”标签。
在“阅读器设置”下，转到“方法”下拉选项卡，然后选择“ [磷光体]”选项。
注意：“ [磷光体]”选项将变成红色，对应于673 nm的波长。
在“阅读器设置”，进入“PMT”（光电倍增管），并选择250-1之间的值，000 V.
注意：500 V的PMT通常是衡量带强度的良好起点；PMT越高，信号越强。
在“阅读器设置”下，转到“区域”，然后选择与凝胶在屏幕上放置位置相对应的网格区域。或者，可以对整个屏幕进行成像，但这会花费额外的时间。
在“阅读器设置”下，转到“像素大小”，然后选择“ 50μm ”像素大小。
注意：可以根据特定的图像质量需求选择较低或较高的分辨率。
选择“扫描”以扫描图像。
选择“另存为”将图像另存为Tiff文件在相应的文件夹中。
考马斯染色
将磷光体屏幕暴露于凝胶后，将凝胶在考马斯染色中用设置为低速至中速的摇杆孵育10分钟。
注意：染色剂的使用量将根据用于培养的容器的形状和尺寸而有所不同，但应足以完全浸入凝胶中。
将考马斯染色剂倒入其原始容器中以供重复使用。
将凝胶在摇杆上的Destain中孵育30分钟，或直到蛋白条带和凝胶背景之间建立足够的对比度。
放弃退色在适当的废物容器中。
在封面之间的通用文档扫描仪上，或使用电话相机或扫描应用程序扫描凝胶。
注意小号：
进行考马斯染色以控制蛋白质的上样量，并且应产生可验证蛋白质实验量的条带（请参见图1，底部）。
如果使用摩尔比而不是基于质量的浓度建立反应，则表观条带大小可能会随蛋白质分子量的不同而变化。

图1 。HYPE 在体外将α-syn 酰化。具有AMPylation功能的E234G-HYPE 用α- 32 P-AMP 稳健地将α-syn及其自身（自动AMPylation ）进行AMPylate （上）。本质上自动抑制的WT-HYPE和催化死亡的E234G / H363A突变体未显示自动AMPylation 或底物AMPylation （上图）。将来自AMPylation 反应的1μg酶和10μg底物上样到凝胶上（底部）。荧光屏暴露3小时（上图）。

菜谱
注意：将以下溶液溶解在ddH 2 O中。在添加其他组分之前，务必先添加溶剂。除非明确说明，否则无需调节pH。用移液管和橡胶吸球用12.1 N HCl或50％NaOH将pH调节至适当的值。还可以准备稀酸或碱以避免超过目标pH值。
蛋白质储存缓冲液
50 mM Tris基础
300毫米氯化钠
10％（v / v）甘油
调整至pH 7.5
10 x AMPylation 缓冲液
50毫米HEPES
10毫米氯化锰2
调整至pH 7.5
4 x SDS-PAGE加载缓冲液
2.86 M BME
250 mM Tris，pH 6.8
10％（w / v）SDS
0.008％（v / v）溴酚蓝
40％（v / v）甘油
1 个SDS-PAGE运行缓冲区
0.3％Tris基数
1.4％甘氨酸
0.1％（w / v）的SDS
考马斯染色
50％（v / v）甲醇
10％（v / v）乙酸
0.1％考马斯亮蓝
去污
50％（v / v）甲醇
10％（v / v）乙酸

致谢

该出版物在印第安纳州CTSI TL1博士前研究金的部分支持下得以实现（格兰特＃UL1TR002529 [ A.Shekhar ，PI ] ，5/18 / 2018-4/ 30 / 2023和格兰特＃TL1TR002531 [ T. Hurley，PI ] ，5/18 / 2018-4/ 30 / 2023，来自美国国立卫生研究院，国家转化科学促进中心，临床和转化科学奖）Eli Lilly-Stark神经科学研究所-CTSI的SD博士前研究金；布朗夫曼家庭基金会对JCR的资助；以及美国国立卫生研究院的国立普通医学科学研究所（R01GM10092），印第安纳州临床和转化研究基金（CTSI-106564）和普渡大学炎症，免疫学和传染病核心研究基金（PI4D-209263）致SM。作者还要感谢Rochet和Mattoo 实验室的成员的有益讨论。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突或竞争。

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