材料和试剂
以下介绍的材料和试剂用于宫颈HeLa细胞系的纸基冷冻保存。对于乳腺MCF-7，前列腺PC3和淋巴细胞JKT细胞系的冷冻保存，请参阅“注意”部分以了解详细信息。

需要
1. 无菌10米升血清移液管（Costar公司Stripette ，目录号：4488）
2. 无菌15米升离心管（赛默飞，目录号：339650）
3. 无菌1-20μ 升，200μ 升，1 ，000μ 升移液管尖端（赛默飞，目录号：10380792，10619331，10390792）
4. 无菌T75组织培养瓶（ThermoFisher，目录号：156499）
5. 无菌1米升低温管（冷冻管）（Sigma-Aldrich公司，目录号：CLS430487）
6. 冷冻安全的样品瓶储存盒（冷冻盒）（Sigma-Aldrich，目录号：Z756776）
7. 弗罗斯蒂先生冷冻容器（ThermoFisher，目录号：5100-0001）
8. 35毫米x 10毫米无菌培养皿（Corning，目录号：430165）
9. 60毫米x 10毫米无菌培养皿（猎鹰，目录号：351007）
10. Whatman 114级纤维素滤纸（Sigma-Aldrich，目录号：1114-185）
11. 温水（37°C）
12. 液氮（-196°C）
13. Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS）-10x（Sigma-Aldrich，目录号：59331C）
14. 纤连蛋白人血浆（Sigma-Aldrich，目录号：F0895）
15. 人宫颈HeLa癌细胞系（ATCC，目录号：CCL-2）
16. Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）（Gibco，目录号：11965092）
17. 胎牛血清（FBS）（Sigma-Aldrich，目录号：F7524）
18. 青霉素链霉素（Pen-Strep）溶液（Sigma-Aldrich，目录号：P4333）
19. 二甲基亚砜（DMSO）（西格玛奥德里奇，目录号：D2650 ）
20. TrypLE 表达酶（Gibco，目录号：12604021）
21. 康宁基质胶基质（Sigma-Aldrich，目录号：DLW356231 ）

可选的
1. 细胞计数室载玻片（ThermoFisher，目录号：C10228）
2. 锥虫蓝排除试验（可选，Sigma-Aldrich，目录号：T6146 ）
3. 用于哺乳动物细胞的Invitrogen 活/死测定试剂盒，其中包含绿色钙黄绿素-AM和红色乙锭均二聚体-1荧光染料（ThermoFisher，目录号：L3224）
4. 完整的罗斯威尔公园纪念学院（RPMI ）介质（Gibco，目录号：11875093）

设备
需要
尺寸18 厘米的通用剪刀
尺长15厘米
高精度镊子（杜蒙，目录号：5627）
计时器（Sunnex ，目录号：360594）
微量天平（梅特勒-托利多，目录号：ME54）
高压灭菌器（Runyes ，目录号：SEA 18L-DIG-USB）
离心机（Eppendorf，目录号：5810）
实验室水浴箱（Witeg ，目录号：WITEG 20002）
加湿细胞培养箱（新不伦瑞克省，目录号：Galaxy 48R）
II级层流通风罩（NuAire ，目录号：NU-437S）
-80 °C 冰箱（Arctiko ，目录号：ULUF 65）
液氮罐（Arpege ，目录号：40）

可选的
Countess II FL自动细胞计数仪（ThermoFisher，目录号：AMQAF1000）
奥林巴斯FV1000倒置共聚焦显微镜（Olympus America）

软件
（可选）Imaris 9.2图像分析软件（牛津仪器）

程序
PAP的制备ER（小号EE V 记意1 ）
高压釜的纸张和切割它，使用无菌剪刀，进入〜3×3厘米2 条罩下（论文可以是切向其他尺寸和形状，以及，提供的移液细胞悬浮液饱和的详细信息参见注释的文件内。）。
将纸条放入无菌的60 mm x 10 mm 培养皿中（每个培养皿一条），并在通风橱下用移液管吸取100 µl 含10 µg / ml 纤连蛋白的DPBS 。后加入纤连蛋白溶液，将纸纤维在室温下孵育20分钟。为避免水分蒸发，请使用培养皿内部的湿纸巾盖住盖子，形成一个加湿室（蒸发速率请参见注释）。
用100 µl DPBS 冲洗纸条两次约5 s，以除去多余的纤连蛋白。
将经过纤连蛋白处理的纸条放在加湿室中，直到准备好细胞并装入细胞。

视频1. 制备用于冷冻保存哺乳动物细胞的纸条的步骤。可以使用任何类型，大小和形状的纸条，只要纸孔适合细胞穿透并且纤连蛋白使纸饱和即可。

制备细胞
使用10 ml 完整的DMEM 在T-75烧瓶中培养约10 6个细胞（请参见食谱），并将其置于37 °C 和5％CO 2 的加湿培养箱中。
传代细胞最多15到24代。
使用约80％的融合液将细胞从烧瓶中解离 2 m l TrypLE，持续5分钟。将细胞转移至15 ml 离心管中，在37 °C下以300 x g 离心5分钟。
在1 ml 室温DPBS中重悬细胞沉淀（〜10 7个细胞），并使用细胞计数室载玻片和自动细胞计数器进行台盼蓝排除试验，以计算活细胞和死细胞的数量。
离心细胞，在300 ×g下在37 5分钟℃，和重悬细胞沉淀（约10 7 个细胞）我Ñ 300μ 升基于DMEM冷冻培养基（见配方）。

细胞的冷冻保存（小号EE V 记意2 ）
转印纤连蛋白涂覆的纸条至无菌35 毫米×10毫米的培养皿中（每个培养皿一个条带）和移液管到他们300μL细胞悬浮液（〜10个7 细胞/米升每cm 2，见注解）。
在1分钟内用镊子将纸条滚动，以防止细胞悬浮液蒸发，并立即将其放入冷冻管中。然后，将冷冻管放入Frosty先生的冷冻容器中。要控制冷冻速度，请在容器中加入100％异丙醇至指示的行。
将细胞缓慢冷冻于Mr. Frosty容器中，以-1°C min -1的速率过夜冷冻至-80 ° C 。
将细胞转移到冷冻箱中，以便在-196 ° C的液氮中长期保存。

V IDEO 2 。细胞装入纸条中。滚动纸条并将其放在标准冷冻管中，在一分钟之内，以防止悬浮介质蒸发。

按需解冻细胞
从液氮中取出冷冻管，并在37 ° C的水浴中融化30秒钟。
可以将细胞冷冻保存在较大的薄片中。在这种情况下，请使用消毒剪刀剪掉一小部分纸，然后解冻。将未使用的纸张放回液氮中。在每个样品取回周期后，在纸上验证细胞活力。

从纸上释放细胞
从引擎盖下的冷冻管中取出装有细胞的纸条，并将其放入装有10 ml 完整DMEM的15 ml 离心管中。
手动摇动离心管约20秒钟，以从纸中释放细胞。
用无菌镊子从试管上取下纸带。
将离心管中的细胞悬液在37 °C下以300 x g 离心5分钟以沉淀细胞。
用三倍洗涤细胞沉淀 1 ml 室温DPBS。
将细胞重悬于T75烧瓶中的完整DMEM 中，并将烧瓶置于37 °C 和5％CO 2的加湿培养箱中，以2D培养扩增它们（图2）。

图2.共聚焦显微镜图像显示，在基于纸和常规（对照）冷冻保存后，细胞以二维培养物扩增。增殖3天后，肌动蛋白（红色）和微管蛋白（绿色）的扩散以及细胞核（蓝色）的存在证实了无纸化和新鲜培养的HeLa细胞之间没有形态异常或差异。

（可选）使用细胞计数室载玻片和自动细胞计数仪，进行台盼蓝排除试验，直接计算释放的活细胞和死细胞的数量。
（可选）利用其仍然在纸张上的细胞（图3）以进一步在体外三维培养物生长和球体结构（Alnemari 等人，2020）或任何其它细胞应用。这是通过将纸张以及剩余的单元格在无菌培养皿中，让细胞在37 °C和5％CO 2的加湿培养箱内进行3D扩增。请注意，此步骤已在我们最近的研究（Alnemari et al。，2018）中扩展到在纸平台上形成3D细胞培养物的阵列，目前我们正在提高其在冷冻保存这些阵列中的适用性。

3D细胞培养物的冷冻保存
在4°C（置于冰上）中将细胞（〜10 7个细胞/ ml 浓度）添加到100％Matrigel中，然后将细胞在Matrigel中的悬浮液吸移到置于无菌陪替氏培养皿中的高压灭菌纸条上（〜10 7个细胞/ m 每厘米2 升）。
在室温下将纸条放置10分钟，以使Matrigel固化。
将纸条在37 °C 和5％CO 2的加湿培养箱中浸入完整的DMEM中7天，以使纸中的细胞增殖。
滚动纸条并将其放入装有DMEM冷冻介质的标准冷冻管中。将冷冻管放入冷冻箱中。
以1°C min -1的速度将增殖的细胞缓慢冷冻至-80°C过夜。
将细胞转移至-196°C的液氮中以进行长期保存。

图3.共聚焦显微镜图像显示融化后纸张中的活细胞释放。将它们加载到10 µg / ml 纤连蛋白处理过的纸上并随后冷冻和融化后，纸平台内活（绿色）和死（红色）HeLa细胞的相对分布从视觉上证明了活细胞可以从纸上有效释放。

解冻并按需提供3D细胞培养
从液氮中取出冷冻管，并在37 ° C的水浴中融化30 s。
如果将细胞培养物以较大的薄片冷冻保存；切一小片，然后融化。将未使用的液体放回液氮中。
将纸条和剩余细胞浸入无菌陪替氏培养皿中的完整DMEM中，以在37 °C 和5％CO 2的加湿培养箱中进行额外的细胞增殖。
（可选）使用活/死测定法目测评估（作为对照）试纸中活/死细胞的分布（图4）。这是一个有用的步骤，尤其是在处理3D细胞培养物时（有关过程详细信息，请参见食谱）。

数据分析
通过使用绿色（488 nm）和红色（612 nm）激发波长的Olympus FV1000倒置共聚焦激光扫描显微镜（Olympus Corporation）对细胞进行成像，进行活/死分析，并使用Imaris软件进行后处理图像。使用10倍空气物镜在纸上成像最深160 µm。Z堆栈成像以5 µm的增量进行，并使用Imaris软件创建了它们的3D投影。
图4.共聚焦显微镜图像显示融化后基于纸质3D培养的细胞存活。在7天的3D纸质HeLa细胞培养之后，以1°C min -1的速率冷冻过夜至-80 °C ，最后融化；实验表明活细胞的完整性和存活率。

笔记
乳腺癌MCF-7癌细胞系，前列腺PC3癌细胞系和淋巴细胞JKT细胞系（ATCC，目录号分别为CRL-3435，CRL-1435和TIB-152）也可以用于纸质冷冻保存。参见Alnemari 等。（2020）作比较。以下是准备细胞的详细步骤。使用HeLa细胞时，其余的冷冻保存和解冻步骤相同。
对MCF-7细胞使用完整的DMEM，对PC3和JKT细胞使用完整的RPMI培养基，两者均补充有10％（vol / vol）的FBS和1％（vol / vol）的Pen-Strep 。
使用TrypLE将PC3和MCF-7细胞约80％融合后，将其从烧瓶中解离，并以300 x g 离心5分钟。收集悬浮的JKT细胞，并以200 x g 离心7分钟。
将细胞沉淀（〜10 7个细胞）重悬于完全冷冻的培养基中，其中PC3和MCF-7细胞的DMSO浓度为10％（体积/体积），JKT细胞的DMSO浓度为5％（体积/体积）。
室温下纸中水量的变化（水蒸发速率）是每9 cm 2 纸带0.002 g min -1 。
300 µl 细胞悬浮液（浓度为10 7个细胞/ ml ）足以使3×3×0.02 cm 3的纸体积充满细胞。

菜谱
完全中等
要准备用于HeLa细胞的完整细胞培养基，请在DMEM中补充10％（vol / vol）FBS和1％（vol / vol）Pen-Strep

冷冻介质
要准备用于HeLa细胞的冷冻培养基，请添加10％（vol / vol）DMSO以完成DMEM

活/死一个SSAY
在5 ml 室温DPBS中稀释2.5 µl 钙黄绿素-AM和10 µl 乙二甲基均二聚体-1
移液管将100μl在工作溶液在纸张上的条纹和温育30分钟的所述暗
将纸张放在盖玻片上，并使用安装介质将其用另一个盖玻片密封
在显微镜下观察细胞的完整性，存活率和生存力

致谢
这项工作得到了纽约大学阿布扎比分校（NYUAD）的财政支持。我们感谢纽约大学阿布扎比核心技术平台的技术支持。该协议是根据Alnemari 等人（2005年）描述的程序进行修订的。（2020）。

利益争夺
作者宣称没有竞争利益。

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