材料和试剂

用于细胞计数
一次性硼硅酸盐玻璃巴斯德吸管（Fisher Scientific，目录号：13-678-20D），在使用前进行灭菌
5 ml / 10 ml无菌血清移液管（例如，Genesee Scientific，目录号：12-102、12-104）
15 ml / 50 ml锥形底部离心管（例如，Corning，目录号：05-538-59A，05-526B）
玻璃盖玻片（例如，Fischer Scientific ，Hausser血细胞计数器盖玻片，目录号：02-671-53）
Kimwipes （Fisher Scientific，目录号：06-666）
6 cm t发行培养皿（例如，Genesee Scientific，目录号：25-260）
感兴趣的哺乳动物细胞类型（例如。，小鼠滋养层干细胞[卡拉布雷斯等人，2012 ] ）
补充有10％血清的细胞培养基（例如，补充有10％FBS的DMEM； DMEM，Thermo Fisher Scientific，目录号：11995065； FBS，VWR，目录号：97068-085）
无菌1x PBS（例如，Corning，目录号：21-040-CM）
0.25％胰蛋白酶-EDTA（例如，GIBCO，目录号：25200-072）
台盼蓝溶液0.4％（Thermo Fisher Scientific，目录号：15-250-06）
70％乙醇，在室温下储存

用于RNA纯化
RNase Zap（Thermo Fisher Scientific，目录号：AM9780）
P20 / 200/1000移液器吸头（例如，Olympus品牌吸头，Genesee Scientific，目录号：23-404、24-412、24-430）
1.7 ml微量离心管（例如，Genesee Scientific，目录号：22-282）
TRIzol试剂（Thermo Fisher Scientific，目录号：15596018）
氯仿（Fisher Scientific，目录号：BP1145-1）
异丙醇（Fisher Scientific，目录号：BP2618-1）
线性丙烯酰胺（Thermo Fisher Scientific，目录号：AM9520）
不含RNase的水（例如，我们使用由密理博的Synergy净水系统生产的去离子18.2MΩ水，目录号：SYNS0HFWW）
用无RNase的水制成的80％乙醇，储存在-20°C
LE琼脂糖（例如，Genesee Scientific，目录号：20-102QD）
溴化乙锭1％溶液（Fisher Scientific，目录号：BP1302-10）
50x TAE缓冲液（例如，Thermo Fisher Scientific，目录号：B49）
琼脂糖凝胶上样缓冲液和染料（例如NEB，目录号：B7024S）
1 Kb Plus DNA梯子（Thermo Fisher Scientific，目录号：10787026）

对于RNA-Seq
带有RiboErase的KAPA RNA HyperPrep试剂盒（Roche / KAPA Biosystems，目录号：KK8560）
SeqCap适配器套件（s EE注1;罗氏（Roche），目录号：714153000）
ERCC RNA Spike-In Mix 1（Thermo Fisher Scientific，目录号：4456740）
Qubit dsDNA HS检测试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：Q32854）
ERCC注释文件（在ERCC RNA Spike-In产品页面Thermo Thermo Scientific中找到的ERCC92.fa，ERCC92.gtf和ERCC_Controls_Analysis.txt ，目录号：4456740）
转录组注释gtf文件（例如，从Illumina的iGenomes网站下载：https : //support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.html）
适当的基因组序列（例如，从Illumina的iGenomes网站下载：https : //support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.html）

设备

用于细胞计数
组织培养箱（例如。，FORMA系列II 3110水套CO 2孵化器，赛默飞世尔科技，产品目录号：3110）
移液器（例如，德拉蒙德，目录号：DP-101）
P2 / P20 /千分之二百微量（例如，研究加4-包，的Eppendorf ，目录号：EPPR4330）
离心15 ml / 50 ml锥形管（例如，Eppendorf ，型号：5810，目录号：022628157）
相位血细胞计数器（例如，Fischer Scientific ，Hausser Bright-Line，目录号：02-671-6）
手动理货计数器（例如，VWR，目录号：23609-102）
具有10倍物镜的倒置显微镜（例如Zeiss Primovert ，目录号：491206-0004-000）

用于RNA纯化
安全护目镜（例如，Thermo Fisher Scientific，目录号：19-053-950）
微量离心机，在4°C下储存（例如，5424微量离心机，Eppendorf，目录号：5424）
带有1.7 ml离心管转子和PCR条带离心管转子的小型离心机（例如，Genesee Scientific MyFuge Mini，目录号：31-500）
Nanodrop分光光度计（例如，Thermo Fisher Scientific，目录号：ND-LITE）
迷你凝胶电泳系统（例如，Thermo Fisher Scientific，目录号：B1A）
琼脂糖凝胶成像系统（例如，Bio - R ad ，Chemidoc MP，目录号：12003154）

对于RNA-Seq
热循环仪（例如，Bio - R ad ，型号：C1000 Touch，目录号：1851148）
磁珠支架（例如，DynaMag-2磁铁，Thermo Fisher Scientific，目录号：12321D）
Qubit荧光计（Thermo Fisher Scientific ，目录号：Q33238）
迷你凝胶电泳系统（例如，Thermo Fisher Scientific，目录号：B1A）
琼脂糖凝胶成像系统（例如，Bio -R ad ，Chemidoc MP，目录号：12003154）
使用Illumina测序仪（例如，Illumina ，型号：NextSeq500，目录号：SY-415-1001）

软件

（可选）SRA工具包（Leinonen等，2011）；https://ncbi.github.io/sra-tools/
STAR aligner （Dobin et al。，2013）; https://github.com/alexdobin/STAR
Subread包中的featureCounts （Liao et al。，2014）; http://subread.sourceforge.net
Samtools （Li等，2009）；https://samtools.github.io
Microsoft Excel或等效版本，或Rstudio （RStudio_Team，2015年）；https://rstudio.com

程序

计算RNA的每平均量细胞（小号EE注2）
1.之前发起协议的这一部分，确保具有工作台空间，移液管，和枪头是洁净适合与RNA（工作小号EE注3）。

2.在6厘米的培养皿中培养细胞，直至其融合度达到60％至80％。

3.将细胞培养基和0.25％胰蛋白酶-EDTA预热至37 ℃下; 加热后，清洁装有培养基，胰蛋白酶-EDTA和含70％乙醇的1x PBS的瓶子，并将其放在生物安全柜中。

4.通过用等体积的1x PBS稀释0.25％的胰蛋白酶-EDTA溶液来创建0.125％的胰蛋白酶溶液。

5.从培养箱中取出培养的细胞，并将其放在生物安全柜中。

6.使用一次性的玻璃巴斯德吸管（或类似产品）从细胞中吸出培养基。

7.轻轻加入4 ml 1x PBS，然后吸出，以洗涤板上的细胞。

8.向细胞中加入2 ml的0.125％胰蛋白酶溶液，并将细胞板在室温下置于生物安全柜中3分钟。

注意：D关联协议可能因您的细胞类型而异。

9.使用连接到移液器的干净的5 ml血清移液管，将胰蛋白酶处理的细胞溶液上下吸移板，以获得单细胞悬液。

10.将胰蛋白酶处理的细胞溶液转移到15 ml锥形管中，该锥形管包含8 ml含10％血清的培养基。

11.将15 ml锥形管倒置10-15次以获得均匀溶液。

12.使用P20微量移液器，移出12μl细胞悬液，然后小心地将其移至1.7 ml微量离心管的底部。

13.再重复一次St eps A 11和A 12，以获得两次重复进行细胞计数。

14.添加12微升的台盼蓝溶液到每个12个微升细胞悬浮液，并通过移液混合，同时注意保持吨他台盼蓝/在管的底部的细胞溶液。

15.分别以1,000 rpm（〜200 xg ）的转速离心5分钟，将剩余的胰蛋白酶消化的细胞溶液（约10 ml；在15 ml锥形杯中）离心。

16.在旋转过程中，用喷有70％乙醇的Kimwipe清洁血细胞计数器和玻璃盖玻片，以除去任何微粒。

17.添加12微升的台盼蓝的细胞悬液至血细胞计数仪，确保溶液均匀地分布在盖玻片下。

18.根据20倍物镜，计数内的每个的四个血细胞计数器的非蓝色细胞quandrants ，跟踪计数的在每个象限中具有手式计数器。

19.使用下面的公式计算每毫升的细胞数，然后平均两次重复之间的每毫升细胞数：

复制1，每毫升细胞数= [（（所有4个象限的总计数）/ 4）* 2 * 10 4
复制2，每毫升细胞数= [（所有4个象限的计数之和）/ 4] * 2 * 10 4
每毫升平均细胞数=（重复1个计数+重复2个计数）/ 2
20.在完成步骤A 15的旋转后，小心除去含胰蛋白酶的培养基，以免干扰细胞沉淀，加入1 0毫升1x PBS，通过移液混合，并在离心机中离心PBS /细胞溶液在1,250 rpm（〜300 xg ）下持续5分钟。

21.取出PBS，用另外10 ml的1x PBS代替，通过移液混合，并在离心机中以1,250 rpm（〜300 xg ）离心5分钟以旋转细胞溶液。

22.移除PBS的所有痕迹和加入1ml TRIzol试剂到细胞象素设（小号EE注4）。

23.使用P1000，上下吸液管约15倍，以裂解细胞并使RNA提取效率最大化。

24.将样品池/ TRIzol混合物放入-80 °C的冰箱中。

25.重复步骤A1-A24至少三次，最好在单独的几天中，以获得生物重复。

26.从冰箱中取出TRIzol悬浮液，并使其在室温下解冻。

27.一旦解冻，让TRIzol试剂悬浮液在室温下静置5分钟，以帮助核糖核蛋白复合dissocia TE（小号EE注5）。

28.在TRIzol悬浮液中加入0.2 ml氯仿，剧烈涡旋约20 s，然后将样品在室温下静置2分钟。

29.在4°C下以12,000 xg离心样品15分钟。

30.将含有RNA的水相转移到新的1.7 ml试管（〜0.5 ml）中。

31.向萃取的水相中加入10μl线性丙烯酰胺，并剧烈涡旋。

32.向水相中加入0.5毫升异丙醇（量约等于水相的体积），并剧烈涡旋。

33.在-20 °C下孵育≥1小时（此步骤与制造商从TRIzol纯化RNA的说明不同）。

34.离心机在4℃以顶级速度将样品在微量离心30分钟℃，（> 12000 ×g下;小号EE注6）。

35.使用P1000除去水/异丙醇溶液，切记不要除去RNA沉淀，RNA沉淀应位于微量离心管铰链的下方。

36.向沉淀的RNA沉淀中，轻轻加入1 ml 80％乙醇和20％无RNase的冰冷混合物。

37.使用P1000除去80％的乙醇，注意不要除去RNA沉淀。

38.在微型离心机中脉冲旋转1.7 ml试管，以使残留的乙醇从试管侧面降至底部。

39.用P200移液器和吸头除去剩余的80％乙醇。

40.重复步骤A 38- A 3 9，直到没有80％的乙醇残留。

41.将沉淀重悬于30μl不含RNase的水中。

42.让通过溶液支架在室温下间歇搅拌1个小时（每隔15分钟）含有RNA的轻弹或涡旋，然后脉冲旋转管，或通过吸取溶液上下（小号EE注7）。

43. RNA溶解后，使用Nanodrop分光光度计对RNA的浓度进行定量。

RNA在260 nm和280 nm处的理想吸光度比在〜1.8和〜2之间。
如果RNA被残留的乙醇，苯酚或胍污染，或者RNA没有完全溶解，则260/280的比率会更低，通常< 1.6。
有关更多信息，请参见Thermo Fisher有关NanoDrop分光光度计的技术说明。
44.接下来，确定纯化的RNA是否完整。为此，请设置凝胶电泳仪，并用1x TAE缓冲液制备1％琼脂糖/0.0001%溴化乙锭凝胶。将琼脂糖凝胶浸入1x TAE缓冲液中。

45.在1.7 ml试管中，将〜250-500 ng RNA与适量的甘油基琼脂糖凝胶上样缓冲液混合。

46.在琼脂糖凝胶的不同泳道中，加载RNA /凝胶加载混合物以及0.5-1 μg DNA阶梯（后一个样品提供大小参考）。

47.以1x TAE在约8厘米处通过琼脂糖凝胶电泳，电极之间的距离电压为5 V / cm。

48.在适当的凝胶成像系统上为凝胶拍照。从典型的哺乳动物细胞中纯化的完整RNA应产生两条不同的条带，相对于DNA阶梯，其表观大小分别为〜1、500和〜750个核苷酸，分别对应于28s和18s rRNA（图2；s ee）。注8）。

图2. RNA在预先用溴化乙锭染色的1％琼脂糖凝胶上电泳。相对于DNA大小梯，28S和18S的rRNA的物种在〜1的大致大小迁移，400分别和〜750个核苷酸。

49.如果RNA是完整的，请继续计算每个细胞的RNA重量：

每细胞RNA = [以g / L表示的RNA浓度] * [每升用于重悬RNA的水中L的体积（例如30 x 10 -6 L）] / [在TRIzol中裂解的细胞数]
计算平均从生物复制RNA制剂（获得的RNA的每单元数的小号EE注9）。

制备cDNA的LiBr白羊用于RNA-SEQ（小号EE备注10，11，12，和13）
1.确保cDNA文库是从两个或更多个生物重复的RNA制备物（制备小号EE注14）。

2.对于每个样品在8的总体积进行测序，等分试样1微克总细胞RNA的微升不含RNA酶的水。

3.向每个样品ADD 2微升新鲜的1：100稀释的ERCC RNA穗在混合＃1（小号EE注15）。

4.从ERCC Spike-in RNA和1μg总细胞RNA的混合物开始，按照制造商的说明进行cDNA文库制备。我们基本上按照KAPA用户技术数据表中的说明进行操作（注16）。以下是用户要求的输入：

FR OM的技术数据表（“RNA洗脱，分段和底漆”）的第6节中，我们在94选择的6分钟的断裂条件℃，这将产生200-300个核苷酸长的RNA片段。
从技术数据表（“文库扩增”）第12条，我们执行只用一半的纯化cDNA文库的我们最后的cDNA文库的PCR扩增（即，10微升cDNA文库的50微升PCR反应），而不是全部20微升库在50 μ升反应（小号EE注17）。
从使用1μg总RNA制备的cDNA文库，使用一半的纯化cDNA文库中，我们通常执行11个PCR循环用于最终扩增步骤。
5.使用一个量子位荧光计，量化在PCR扩增，纯化的cDNA文库（DNA的浓度小号EE注18）。

6.用1x TAE缓冲液制备1％琼脂糖/0.0001%溴化乙锭凝胶。将琼脂糖凝胶浸入1x TAE缓冲液中。

7.运行2微升（1/10个）扩增的cDNA文库-6厘米的琼脂糖凝胶的，沿着250纳克1个所述的KB加DNA梯。

8.图像琼脂糖凝胶，并估计在碱基对每个制备的cDNA文库（平均大小小号EE注19）。

9.计算纯化的cDNA文库的摩尔浓度：

DNA碱基对的平均分子量为650道尔顿，即650 g / mol。
使用上面S tep B 8中确定的平均长度，计算cDNA文库的摩尔质量：
[cDNA文库克/摩尔] = [平均长度] * 650克/摩尔

现在，使用在所确定的DNA浓度小号TEP乙5以上，计算出cDNA文库（的摩尔浓度小号EE注20）：
[cDNA文库摩尔/升] = [cDNA文库浓度，单位为ng / μl ]）*（[1 x 10 -9 g] / [1 x 10 -6 L]）*（1 / [cDNA文库g /摩尔]）

10.在一个方式将保证每个库的等摩尔量的待测序池一起cDNA文库存在于池和每个文库将被测序，以深度> 20000000读取（小号EE注小号21和22 ）。

11.序列在Illumina平台上的汇集的cDNA文库（小号EE注23）。

数据分析

ñ OTE：见注24。

对齐数据，并获得读数S（小号EE注25）
在一个UNIX命令端子，创建一个主目录进行序列比对，过滤，和读计数（例如，./ ercc_mpc_analysis ）。

mkdir ./ ercc_mpc_analysis

获得RNA-Seq的的fastq从Illumina测序运行（文件如rnaseq_ file.fastq ），并将该文件移动到主目录（小号EE注26）。

mv rnaseq_file.fastq ./ ercc_mpc_analysis

下载相应的基因组发STA文件（例如，genome.fa ）和基因- GTF文件（例如，genes.gtf ）为您的细胞类型，并放置在主目录（./ ercc_mpc_analysis ）（小号EE注27）。
下载从ERCC穗在RNA批注文件ERCC RNA穗在产品页面默飞世尔网站的主目录，并将它们- ./ ercc_mpc_analysis （小号EE注28）。文件名是：
ERCC控制分析：ERCC RNA穗在控制混合料（例如，ERCC92_conc.txt）
ERCC92.fa和ERCC92.gtf序列和注释文件（.zip）
在主目录（./ ercc_mpc_analysis ）中，创建一个新目录来存储将由STAR构建的基因组索引

mkdir ./ GenomeDir /

建立包括基因组和ERCC参考序列的STAR基因组索引；索引将被创建并存储在./ GenomeDir /中。

STAR- runThreadN 8

- runMode genomeGenerate

- genomeDir ./ GenomeDir

-基因组FastaFiles基因组.fa ERCC92.fa

- sjdbGTFfile genes.gtf ERCC92.gtf

利用明星对齐的转录组测序的fastq文件（例如，rnaseq_file.fastq ）的基因组指数。该路线将被保存到阑尾“文件Aligned.out.sam ”（例如，rnaseq_file_out_Aligned.out.sam ）。

STAR - RUNT hreadN 12

- genomeDir ./ GenomeDir

- readFilesIn rnaseq_file.fastq

- outFileNamePrefix rnaseq_file_out _

使用samtools过滤“ Aligned.out.sam ”文件，以实现> 30的映射质量（此步骤选择唯一映射的读取）。在此示例中，过滤后的文件名为“ rnaseq_file_out _q30.sam”。
samtools视图-Shq 30

rnaseq_file_out_Aligned.out.sam > rnaseq_file_out _q30.sam

使用Subread包中的featureCounts可以计算与每个ERCC Spike-In转录一致的读取次数（注29）。在此示例中，包含ERCC计数的文件名为“ ercc_featureCounts_output.txt”。
featureCounts

-s 2

-a ERCC92.gtf

-o ercc_featureCounts_output.txt

rnaseq_file_out_q30.sam

使用Subread包中的featureCounts可以计算与genes.gt f文件中每个基因转录本对齐的读取数。在此示例中，包含ERCC计数的文件名为“ mm9_genes_featureCounts_output.txt”。
featureCounts

-s 2

-a基因

-o mm9_genes_featureCounts_output.txt

rnaseq_file_out_q30.sam

创建一条标准曲线，将ERCC Spike-In RNA-Seq读数与即将添加到RNA的每个ERCC转录本的绝对量相关，就在准备用于RNA-Seq的cDNA库之前。我们建议使用Excel或Rstudio进行这些计算。模板和示例可以在这里找到。下面的图3显示了源自单个RNA-Seq复制的标准曲线（Schertzer等，2019）。

图3. RNA-Seq读数计数（y轴）与ERCC Spike-In RNA分子丰度（x轴）相关的代表性标准曲线

1.将ERCC92_conc.txt文件（在步骤A4中下载）的内容复制并粘贴到新的Excel电子表格中–将其称为“ ERCC Mix In”电子表格（请参见注释N30）。ERCC92_conc.txt文件的图片如下（图4）。

图4. ERCC92_conc.txt文件的屏幕截图

2.删除Excel电子表格中表格的最后三列（“混合2中的浓度（原子/升）”，“预期倍数变化率”，“对数2 （混合1 /混合2）”）。

3.在表E列中创建一个新列，“添加的原子”，该列使用列D“混合物1中的浓度（原子/ ul）”中的值来计算添加到其中的ERCC Spike-In RNA的原子数之前RNA测序文库制备的总RNA（小号EE注31;图5）。

图5.在文库制备之前添加到RNA中的ERCC Spike-In的原子数计算示例屏幕截图

4.创建一个新列F列“ Moles”，将E列“添加的原子”中的数字除以1E18。

5.创建一个新列G列“分子”，该列将F列“摩尔”中的值乘以6.022E23（每摩尔分子； Avogadro数）。

6.创建一个新列H列，“ log 2 （分子）”，该列计算G列“分子”中值的对数以2为底。

7.排序表，使B列“ ERCC_ID”中的数据以升序显示；这将在以后变得很重要（图6）。

图6.排序后的ERCC计算表的屏幕截图

8.在一个单独的Excel电子表格中，复制并粘贴ercc_featureCounts_output.txt的内容文件中生成小号TEP甲9-称此为“ fCounts数据”电子表格（小号EE注32）。

9.在这个新的电子表格中，计算每个ERCC笔录的每千碱基对比对读数（RPKM）。

首先，在感兴趣的数据集中，找到与基因组比对且定位质量> 30的读取总数。这可以使用samtools视图在UNIX命令行中完成：

samtools视图-c rnaseq_file_out _q30.sam> rnaseq_file_counts.txt

接下来，在Excel电子表格中创建一个新列-H列，“ RPM”，其中G列中的读取计数除以“ rnaseq_file_counts.txt”中对齐的读取计数，然后乘以100万。这给出了每百万的读取数（RPM）。
然后，在Excel电子表格中创建一个新列，即列I，“ RPKM”，其中，列H中的RPM值除以列F中的“长度”（每个ERCC转录本的核苷酸长度）中的值，然后相乘1 ，000将其转换成RPM RPKM，或每对准每百万成绩单的碱基读计数读取。
最后，在Excel电子表格中创建一个新列-列J，“ log 2 （RPKM）”，该列计算第I列“ RPKM”中的值的log-base-2（图7）。

图7. ERCC RPKM计算的屏幕截图

10.确保Excel电子表格创建以s TEP乙1并且在步骤乙8升序（由ERCC ID排序小号EE注33）。

11.将“ fCounts数据”电子表格（在步骤B 8中创建）的log 2 （RPKM）值粘贴到“ ERCC混合”电子表格（在步骤B 1中创建）的新列中。

12.删除对齐读数为零的ERCC成绩单。

13.生成一个散点图，其中log 2 （分子）在x轴上，log 2 （RPKM）在y轴上。请参见下面的图3和图8。

图8.在Excel中生成散点图的屏幕截图

14.将一条直线拟合到数据

在Excel中，选择图形上的点，单击并单击“添加趋势线”。在窗口中，选择“线性”和“在图表上显示方程式”（图9）。

图9.在Excel中添加趋势线的屏幕截图

预期R 2值大于0.90（通常大于0.95）。
在下一部分中使用y = mx + b方程。

计算每个细胞所需的lncRNA和mRNA基因的分子。
复制mm9_genes_featureCounts_output.txt文件（步骤A10生成的文件）的内容，并将其粘贴到新的Excel电子表格-称之为“MPC”电子表格（小号EE注34）。
使用上面步骤B9中概述的相同步骤，将每个基因（MPC电子表格的G列）的读取计数转换为RPM作为新列H，然后转换为RPKM作为新列I，然后转换为对数2 （RPKM）新列J。
对于每个感兴趣的基因，使用s tep B 14中的y = mx + b方程计算对数2 （分子）。
x =对数2 （分子）
y =在J列中计算的log 2 （RPKM）值
b =根据步骤B14中的公式得出的y截距
m =步骤B14中方程的斜率
在MPC Excel电子表格中创建新列K“ log 2 （分子）”列，该列执行以下计算：
x =（yb）/米

在MPC Excel电子表格中创建一个新列L列“分子”，其中列K中的值使用指数2x转换为分子。在Excel中表示法，这是通过在L列的方程设置为执行“ = 2 ^ column_K”（小号EE注35）。
在MPC Excel电子表格中创建最后一列-列M“ MPC”，其中列L中的值转换为每细胞分子：
分1微克的总RNA的用于制备RNA-SEQ库中的量，按重量RNA的每单元在计算出的小号此协议的“过程”部分的TEP A49。此值表示用于制备RNA-SEQ库（细胞的近似总数目小号EE注36）。
对于每个感兴趣的转录物，将L列中的分子数除以用于RNA-Seq的细胞总数，以估算每个细胞的转录物分子。

笔记

罗氏（Roche）最近购买了KAPA Biosystems，并终止了其小的反应号序列适配器套件。该SeqCap适配器套件是他们的替代产品，但要注意，这个套件时采用的是96-反应格式。用户可以以低于SeqCap套件标价的价格从商业寡核苷酸供应商批量购买自己的Illumina兼容适配器。然后，这些适配器需要由用户重新悬浮和退火。但是，批量购买适配器的优点是大大降低了每个反应的成本。因此，计划执行许多RNA-seq分析（或就此而言，其他任何* -seq分析）的用户会发现，购买和退火自己的适配器比购买预先等分的适配器更具成本效益。对于那些有兴趣购买和退火自己的适配器的人，我们在这里提供了说明。计划只进行少量RNA-seq分析的用户可能会发现，从以小包装出售试剂的制造商（例如NEB）购买他们的RNA-seq试剂盒和适配器会更具成本效益。
协议的此部分描述了如何计算目标细胞类型中每个细胞的平均RNA量。该协议是为培养的贴壁细胞设计的，但可以很容易地适应培养的悬浮细胞。通过额外的优化，它也可以适应感兴趣的组织。在后一种情况下，用户将需要一种方法来估计每单位感兴趣组织的细胞总数（例如，每毫克组织中存在多少个细胞？）。通过准确估计每个组织的细胞数，用户可以从已知的组织质量中重复进行RNA纯化。然后将RNA的重量产量除以用于获得RNA的细胞数量，以得出目标组织中每个平均细胞的RNA量估计值。
要清洁工作台，请用一小层RNase Zap喷涂该区域，然后用纸巾将溶液擦拭干净。用RNase Zap轻轻喷雾用于RNA制备的移液器，然后将其擦拭干净。使用未暴露于任何RNase来源的移液器吸头盒。RNase的常见来源来自质粒DNA制备试剂盒和人的皮肤/唾液。在给定的工作日，通过在进行任何质粒DNA制备（或任何其他涉及RNase的方案）之前始终进行RNA工作并始终戴着手套，以最大程度地减少RNase污染的机会。此外，尽管听起来有些苛刻，但是一旦开始认真进行RNA制备（步骤A26 ，程序部分），请避免在敞开的微量离心管附近说话，咳嗽，嚼口香糖等。我们还在移液器上使用隔离提示。通过采取这些简单的预防措施，您将有助于确保协议的成功。
TRIzol含有酚，对眼睛，皮肤和呼吸道具有腐蚀性。当工作与的TRIzol ，用户应佩戴安全护目镜，封闭趾鞋，白大褂在任何时候，注意不要溅到的TRIzol自己身体上的任何部分。如果用户对TRIzol的烟雾敏感，应在通风橱中进行工作。TRIzol需要按照适用于该机构的安全准则进行处置。
最近，Chujo及其同事发现，将TRIzol悬浮液在55°C下孵育10分钟时，可以以更高的效率回收某些核保留的lncRNA （Chujo和Hirose ，2017年）。在我们先前对lncRNA细胞内丰度的研究中（Schertzer et al。，2019），我们没有执行此55°C的孵育步骤。但是，我们认为55°C的培养没有任何不利之处，并且将来可能会进行。
在开始旋转之前，将每个微量离心管的棘爪对齐，以使铰链都朝外。对准棘刺将确保每个试管中的RNA /丙烯酰胺沉淀位于试管铰链的正下方。知道试管中期望沉淀的位置有助于避免协议中的某些猜测，尤其是当您使用少量RNA时。
如果通过移液进行混合，请注意，RNA沉淀有时会粘在移液管尖端的内部。如果发生这种情况，请继续上下吹打水，直到沉淀明显溶解为止。
经历了不同程度降解的RNA将在凝胶上显示为涂片。
使用此程序，我们对小鼠胚胎干细胞和滋养层干细胞的每细胞RNA估计分别达到20皮克和30皮克（Calabrese等人，2007; Schertzer等人，2019）。
为了估计细胞内的丰度，我们建议使用RNA-Seq文库制备方案，该方案通过rRNA缺失而不是polyA选择从rRNA中纯化基因转录本。在一项前瞻性研究中，我们使用rRNA耗竭和polyA选择来估计三个感兴趣的lncRNA（Xist ，Airn和Kcnq1ot1 ），从而估计了细胞内的丰度，并发现这两种方案得出的估计值截然不同（未显示）。我们对这些先导数据的解释是，在polyA选择方案中，许多因素可能导致捕获效率因不同的聚腺苷酸化RNA而变化。聚腺苷酸化程度，polyA尾巴的长度，RNA碱基配对干扰polyA捕获的程度以及内部富A序列的数量的变化可能导致某些聚腺苷酸化的转录物比其他捕获效率更高。这些变化会使细胞内丰度的估计难以预测。相反，polyA捕获效率的变化与rRNA消耗协议无关，后者使用与主要rRNA种类互补的寡核苷酸从总RNA制剂中消耗rRNA。因此，通过rRNA消耗RNA-Seq比通过polyA-选择RNA-seq可以更准确地测量细胞内丰度。话虽这么说，与rRNA内部具有同源性的转录本会通过rRNA的去除而被选择性地去除，并且在此协议下需要进行特殊考虑。
为了制备用于RNA-Seq的样品，我们的实验室通常使用来自Kapa Biosciences / Roche的带有RiboErase的RNA HyperPrep试剂盒。带有RiboErase的KAPA RNA HyperPrep试剂盒中的说明很明确，并向用户深入介绍了该协议的每个步骤，该步骤从rRNA的降解开始，然后是DNase处理，RNA片段化和引物，cDNA合成，第二链cDNA合成和A尾，衔接子连接，最后是文库扩增。所有这些步骤之后，都是使用试剂盒提供的聚苯乙烯-磁铁矿珠进行纯化和缓冲液交换。在我们的实验室中，该工具包对于多个用户跨多年收集不同数据集的功能非常强大。但是，许多其他公司也出售高质量的试剂盒来制备核糖耗尽的RNA-seq文库，包括Illumina和NEB。一般来说，这些套件应具有同等的性能。对于仅计划执行少量RNA序列实验的用户，NEB之类的公司可能更可取，因为他们出售的试剂盒尺寸小于KAPA。
KAPA RNA HyperPrep协议是Parkhomchuk等人（1988年）描述的dUTP第二链协议的修改版本。（2009 ）和Levin等。（2010 ），其中通过在存在dUTP的情况下进行第二链cDNA合成来维持RNA-seq文库的链式性，然后使用经工程改造可优先扩增含脱氧胸苷的DNA的DNA聚合酶扩增cDNA文库。而不是脱氧尿苷。当使用此试剂盒或任何其他使用基于dUTP的方法的试剂盒时，研究人员应注意，扩增文库的链状度并不理想。改造后的DNA聚合酶在低频下仍会扩增含脱氧尿苷的第二链。此低频第二链扩增的结果，对于高表达基因，一个RNA-SEQ信号的“影子”往往是上是相反的（股线可见即，反义）的基因的正确链。实际上，该阴影信号从未影响过我们的下游分析，但用户应该意识到它的存在。
在该协议的第一次调试过程中经常犯错误是很常见的。我们建议初次使用的用户首先使用下面的整个协议，使用一个或两个生物材料不受限制的样本。这样，用户可以计算出图书馆准备工作的后勤工作，而无需第一次使用该协议即可工作。
为了获得可靠的生物学复制，我们建议使用在不同日期或不同动物等制备的RNA 。
为了最大程度地减少移液误差，建议移液体积为2μl或更大。例如，代替吹打1微升ERCC的穗在溶液中，以99微升不含RNA酶的水，我们将吸液管2微升穗在溶液中，以198的微升不含RNA酶的水。
带有RiboErase的KAPA RNA HyperPrep试剂盒; 货号：KK8560; 技术数据表版本KR1351-v2.17；相同的数据表也包含在我们的github页面中。
仅使用文库一半的原因是，如果用户由于PCR设置错误或cDNA文库扩增过度或扩增不足而需要重复进行最终的PCR反应，它将保留cDNA材料。
PCR扩增后，清理，及ELU后在20和灰微升如在技术资料中所缓冲液，DNA的每个样品的量应在7〜- 150纳克/微升。超出此范围的DNA浓度是可以接受的，但是在极少数情况下，我们自己的cDNA文库的浓度超出此范围，我们选择使用调整后的PCR循环数来重复最终的PCR扩增，提交原始扩增的RNA-seq文库。原因是用户正在尝试确保最终的PCR保持在线性扩增范围内。扩增至150 ng / μl的浓度可能接近KAPA试剂盒线性范围的顶部。同样，最终文库浓度< 7 ng / μl也可以接受，但是在这种情况下，我们选择使用更多的循环数重复进行最终PCR，而不是将低浓度文库提交测序。最常见地，我们的扩增的文库的最终浓度是10之间- 50纳克/微升; 这是我们的最佳目标范围。
使用用于cDNA文库制备条件上述指定用户应该期望扩增的DNA片段的平均大小在每个库为300之间-的核苷酸400。
下面是数字的例子：在计算出的浓度小号TEP乙5 （Prodedure部分）为25纳克/微升。在估计平均文库大小小号TEP乙8 （Prodedure部分）是300个碱基对。库的摩尔浓度为25 *（1 x 10 -9 ）/（1 x 10 -6 ）/（300 * 650）= 128 nM。
UNC的高通量测序设施要求用户以15 nM的最终浓度向他们提交其合并的cDNA文库。因此，举例来说，如果我们希望在一个库中包含12个独立的cDNA文库，则意味着每个文库在库中的最终浓度应为1.25 nM或[15 nM / 12]。创建合适浓度的cDNA文库的一种简单方法是，首先以该库的最终浓度为每个文库创建独立的等分试样-在本示例中，该浓度为15 nM。然后，每个库的相等容量可以合并以创建15 nM池。
为了确定库中可以包含的最大文库数量，以使每个文库仍能测序到适当的深度，请首先确定期望从Illumina测序仪器上运行返回的测序读段数。例如，在UNC，使用NextSeq500仪器进行的平均75周期高输出运行将返回5亿次读取。为了在一个库中每个cDNA文库获得至少2000万个读数，我们应在该库中包括的最大库数为500/20，即25个库。实际上，我们通常包括的库少于此最大数量，这导致每个库的读取深度大于2000万次读取。每个样品的高读取深度从来都不是问题。此外，从单个库读取的少于2000万个读本也可能是可容忍的；请注意，随着读取次数的减少，您自信地量化大量低表达转录本的能力也会随之降低。
从Illumina NextSeq500仪器获得75个碱基的单端读数后，我们进行了数据分析。较短，较长或什至配对末端的读取也将是合适的。
请参阅与此协议相关联的github页面，以获取Excel和R中的示例文件和分析模板（https://github.com/mschertzer/ercc_analysis）。
对于RNA-Seq的比对，我们一般采用STAR，但请注意，其他矫正器的支持跳空的对齐应该等效执行（Baruzzo等人，2017年;博士，2010; Dobin等。人，2013年）。
如果遵循github页上提供的示例，则可以使用SRA工具包在NCBI Sequence Read Archive （Leinonen等人，2011）中下载与记录SRR7685881相关的fastq文件。
在此协议的示例中，我们使用由UCSC Genome Browser （Haeussler et al。，2019）编译并从Illumina的iGenomes网站下载的mm9基因组.fa和genes.gtf文件：https：//support.illumina.com/ sequence / sequencing_software / igenome.html。
用户还可以在与此协议相关的github页面上找到这些文件（https://github.com/mschertzer/ercc_analysis）。
featureCounts的“ -s 2”选项特定于使用生成“反向链”数据的方法（例如，本协议中所述的带有RiboErase的KAPA RNA HyperPrep试剂盒）制备的库。
步骤乙2通过乙7 （数据分析）b elow已经在被包括在关于“ERCC_analysis_template.xlsx”模板“ERCC混合在”电子表格进行github上与此协议（相关联的页的https：// github上。 com / mschertzer / ercc_analysis）。
在Schertzer等人中。（2019），我们添加2微升的1：100稀释ERCC混合物1穗在RNA的至1μg总RNA。因此，按照我们的示例，将D列中的ERCC Spike-In Mix浓度除以100，然后乘以2以计算作为E列添加的阿托姆数。
在github页面上提供的模板“ ERCC_analysis_template.xlsx”中，第二个电子表格称为“ fCounts数据”。
排序后，每个电子表格中每个ERCC成绩单出现的顺序应相同。
例如，使用Schertzer等人的RNA-seq数据集对整个转录组进行MPC计算的例子。（2019），请参阅与此协议相关的github页面上的“ ERCC vprtta analysis example.xlsx”文件中的MPC电子表格（https://github.com/mschertzer/ercc_analysis）。
计算结果是对用于制备RNA-Seq cDNA文库（在我们的情况下为1μg总RNA）的总RNA池中存在的RNA分子数量的估计。
在Schertzer等人中。（2019），我们估计我们的滋养层干细胞系每个细胞可容纳30皮克。因此，1μgRNA对应于33,333个细胞。

致谢

我们感谢Keean Braceros对该协议进行了校对，并感谢Jackson Trotman对于图2中使用的凝胶图像。他的工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）Grant GM121806的支持。Schertzer等。（2019）是该协议的原始论文。

利益争夺

作者没有竞争利益要声明。

参考文献

Baruzzo，G.，Hayer，KE，Kim，EJ，Di Camillo，B.，FitzGerald，GA和Grant，GR（2017）。基于仿真的RNA序列比对器综合基准测试。Nat Methods 14（2）：135-139。
Bushnell，B。（2010）。BBMap（sourceforge.net/projects/bbmap/）。
明尼苏达州的卡比利（Cabili），密西西比州的杜纳金（Dunagin），MC，麦克拉纳汉（PD），比亚伊施（Biaesch），A。帕多万·梅哈（Padovan-Merhar），雷吉夫（Regev），A。里恩（Rinn）和拉吉（A. 在单细胞和单分子分辨率下对人lncRNA的定位和丰度分析。Genome Biol 16：20 。
明尼苏达州的卡比利（Cabili，MN），特拉普尔（Trapnell），C。，戈夫（Goff），L。人类大型基因间非编码RNA的整合注释揭示了全局特性和特定的亚类。基因开发25（18）：1915-1927。
Calabrese，JM，Seila，AC，Yeo，GW和Sharp，PA（2007）。RNA序列分析定义了Dicer在小鼠胚胎干细胞中的作用。美国国家科学院院刊104（46）：18097-18102。
Calabrese，JM，Sun，W.，Song，L.，Mugford，JW，Williams，L.，Yee，D.，Starmer，J.，Mieczkowski，P.，Crawford，GE和Magnuson，T.（2012）。作为X灭活机制的调节元件的位点特异性沉默。单元格151（5）：951-963。
Cerase，A.，Smeets，D.，Tang，YA，Gdula，M.，Kraus，F.，Spivakov，M.，Moindrot，B.，Leleu，M.，Tattermusch，A.，Demmerle，J.，Nesterova ，TB，Green，C.，Otte，AP，Schermelleh，L.和Brockdorff，N.（2014年）。Xist RNA和聚梳蛋白的空间分离由超分辨率显微镜显示。美国国家科学院院刊111（6）：2235-2240。
Chen，J.，Shishkin，AA，Zhu，X.，Kadri，S.，Maza，I.，Guttman，M.，Hanna，JH，Regev，A.和Garber，M.（2016）。跨哺乳动物的进化分析揭示了不同种类的长非编码RNA。Genome Biol 17：19 。
Chujo，T.和Hirose，T.（2017年）。建立在较长的非编码架构上的核体：其构造和功能的统一原理。摩尔细胞40（12）：889-896。
Dobin，A.，Davis，CA，Schlesinger，F.，Drenkow，J.，Zaleski，C.，Jha，S.，Batut，P.，Chaisson，M. and Gingeras，TR（2013）。STAR：超快速通用RNA-seq对准仪。生物信息学29（1）：15-21。
Gil，N.和Ulitsky，I.（2020年）。通过顺式作用的长非编码RNA调控基因表达。Nat Rev Genet 21（2）：102-117。
Haeussler，M.，Zweig，AS，Tyner，C.，Speir，ML，Rosenbloom，KR，Raney，BJ，Lee，CM，Lee，BT，Hinrichs，AS，Gonzalez，JN，Gibson，D.，Diekhans，M 。，Clawson，H.，Casper，J.，Barber，GP，Haussler，D.，Kuhn，RM和Kent，WJ（2019）。UCSC基因组浏览器数据库：2019年更新。核酸研究47（D1）：D853-D858。
Hezroni，H.，Koppstein，D.，Schwartz，MG，Avrutin，A.，Bartel，DP和Ulitsky，I.（2015）。从17种物种的转录组直接比较中得出长期非编码RNA进化的原理。细胞代表11（7）：1110-1122。
Hrdlickova，R.，Toloue，M.和Tian，B.（2017年）。用于转录组分析的RNA-Seq方法。Wiley Interdiscip Rev RNA 8（1）。
Jiang L.，Schlesinger，F.，Davis，CA，Zhang，Y.，Li，R.，Salit，M.，Gingeras，TR and Oliver，B.（2011）。RNA-seq实验的合成加标标准品。Genome Res 21（9）：1543-1551。
Kopp，F.和Mendell，JT（2018）。长非编码RNA的功能分类和实验解剖。细胞172（3）：393-407。
Kutter，C.，Watt，S.，Stefflova，K.，Wilson，MD，Goncalves，A.，Ponting，CP，Odom，DT和Marques，AC（2012）。长的非编码RNA的快速周转和基因表达的演变。PLoS Genet 8（7）：e1002841。
Leinonen，R.，Sugawara，H.，Shumway，M.和国际核苷酸序列数据库，C.（2011）。序列读取存档。Nucleic Acids Res 39（数据库问题）：D19-21。
Levin，JZ，Yassour，M.，Adiconis，X.，Nusbaum，C.，Thompson，DA，Friedman，N.，Gnirke，A.和Regev，A.（2010）。链特异性RNA测序方法的全面比较分析。Nat Methods 7（9）：709-715。
Li H.，Handsaker，B.，Wysoker，A.，Fennell，T.，Ruan，J.，Homer，N.，Marth，G.，Abecasis，G.，Durbin，R. and Genome Project Data Processing， S.（2009）。序列比对/图谱格式和SAMtools。生物信息学25（16）：2078-2079。
廖Y，史密斯，GK和施威（2014）。featureCounts：一种高效的通用程序，用于将序列读取分配给基因组特征。生物信息学30（7）：923-930。
Necsulea，A.，Soumillon，M.，Warnefors，M.，Liechti，A.，Daish，T.，Zeller，U.，Baker，JC，Grutzner，F.和Kaessmann，H.（2014）。在四足动物中，lncRNA谱的演变和表达模式。自然505（7485）：635-640。
Ninomiya，K.和Hirose，T.（2020年）。核体内短串联重复富集的建筑RNA：功能和相关疾病。非编码RNA 6（1）。
Parkhomchuk，D.，Borodina，T.，Amstislavskiy，V.，Banaru，M.，Hallen，L.，Krobitsch，S.，Lehrach，H.和Soldatov，A.（2009）。通过互补DNA的链特异性测序进行转录组分析。Nucleic Acids Res 37（18）：e123。
Raj，A.和Rinn，JL（2019）。用RNA成像照亮基因组暗物质。冷泉阁Perspect Biol 11（5）。
RStudio_Team 。（2015）。RStudio：R的集成开发。
Schertzer，MD，Braceros，KCA，Starmer，J.，Cherney，RE，Lee，DM，Salazar，G.，Justice，M.，Bischoff，SR，Cowley，DO，Ariel，P.，Zylka，MJ，Dowen， JM，T.Magnuson和JM的Calabrese（2019）。lncRNA诱导的由基因组结构，RNA丰度和CpG岛DNA控制的多梳菌传播。摩尔电池75（3）：523-537 e510。
Schuler，A.，Ghanbarian，AT和Hurst，LD（2014）。纯化对剪接相关基序的选择，而不是表达水平或RNA折叠，可以解释几乎所有对人lincRNA的限制。Mol Biol Evol 31（12）：3164-3183。
Schwaber，J.，Andersen，S.和Nielsen，L.（2019年）。亮点：逆转录效率标准在数据解释中的重要性。Biomol Detect Quantif 17：100077。
Smeets，D.，Markaki，Y.，Schmid，VJ，Kraus，F.，Tattermusch，A.，Cerase，A.，Sterr，M.，Fiedler，S.，Demmerle，J.，Popken，J.，Leonhardt H.，Brockdorff，N.，Cremer，T.，Schermelleh，L.和Cremer，M.（2014）。非活性X染色体区域的三维超分辨率显微镜显示了其活跃核区的崩溃，该核区具有独特的Xist RNA病灶。表观遗传染色质7：8。
Sunwoo H.，Wu JJ和Lee JT（2015）。Xist RNA-PRC2复合物在20 nm的分辨率下显示出较低的Xist化学计量，并暗示了小鼠细胞中的运行机制。美国国家科学院院刊112（31）：E4216-4225。
Tsanov，N.，Samacoits，A.，Chouaib，R.，Traboulsi，AM，Gostan，T.，Weber，C.，Zimmer，C.，Zibara，K.，Walter，T.，Peter，M.，Bertrand ，E.和Mueller，F.（2016）。smiFISH和FISH-quant-具有超分辨率功能的灵活的单RNA检测方法。Nucleic Acids Res 44（22）：e165。
Ulitsky，I.（2016年）。进化以营救：使用比较基因组学来了解长的非编码RNA。Nat Rev Genet 17（10）：601-614。
Washietl，S.，Kellis，M.和Garber，M.（2014）。在六个哺乳动物中人类长非编码RNA的进化动力学和组织特异性。Genome Res 24（4）：616-628。