材料和试剂

2-mL微量离心管（ Sarstedt ，目录号：72.695.400）
5-mL管（ Sarstedt ，目录号：72.701）
培养皿92 × 16 mm（ Sarstedt ，目录号：82.1473）
1-mL钝注射器（SOFT-JECT HSW，目录号：5010.200V0）
无菌4-mm直径玻璃珠（ Dutscher ，目录号：068502）
无菌 96 孔 V 型底透明聚苯乙烯微孔板（Greiner Bio-One，目录号：651101）
无菌移液器吸头
堆肥（ Proveen ，目录号：14926）
花椰菜： Brassica oleracea var。葡萄孢菌克洛维斯 F1（维尔莫林）
注意：植物在温室条件下生长，播种后 4 周使用。所有接种均使用第二片真叶（子叶上方的第二片叶子）进行。接种后，将植物保持在经典的生长室条件下：9 小时光照、22 °C和 70% 相对湿度。
油菜黄单胞菌光伏。 campestris ( Xcc ) 菌株 8004::GUS-GFP (WT 以下； Cerutti et al. , 2017)和变种： Xcc 8004::GUS*-GFP*（下文为 WT*，携带点突变 Y468A 和 Y66A，使 β-葡萄糖醛酸酶的催化位点失活和 GFP 蛋白）； Xcc 8004::GUS-GFP Δ hrpX ; Xcc 8004::GUS-GFP Δ hrcV ; Xcc 8004::GUS-GFP Δ xopAC
注意：考虑到与 GUS-GFP 盒式磁带的组成表达相关的健身成本，我们决定为我们的参考菌株创建盒式磁带的非功能版本。使用该系统，两个受挑战的菌株携带并表达 GUS-GFP 盒式磁带，但其中只有一个实际上会显示为已标记。因此，我们消除了与盒式磁带相关的健身成本的可能性，同时仍然能够区分两种混合菌株。
分光光度计池（标准聚苯乙烯半微量比色皿， Sarstedt ，目录号：67.742）
无菌蒸馏水
氯化镁（MgCl 2 ）（Merck，目录号：105832）
酵母提取物（Sigma-Aldrich，目录号：Y1625）
酪蛋白氨基酸（BD，BD Biosciences，目录号：223050）
磷酸氢二钾（K 2 HPO 4 ）（Merck，目录号：105101）
琼脂（BD，BD Biosciences，目录号：214010）
七水合硫酸镁（MgSO 4 ·7H 2 O）（Merck，目录号：105886）
X-葡萄糖（5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-β-D-葡萄糖醛酸，环己基铵盐一水合物）（BIOSYNTH，目录号：B-7300）
DMF（ N，N二甲基甲酰胺）（Sigma-Aldrich，目录号：D4551）
利福平（ Euromedex ，目录号：1059）
甲醇（VWR，目录号：20847.320 ）
Pimaricin（DSM，DEVLOCID Instant，目录号：00226）
MOKA培养基（见食谱）
1 mM MgCl 2溶液（见配方）
X- gluc （见配方）
利福平（见食谱）
Pimaricin（见食谱）

设备

6毫米直径的空心冲头（Harris，Uni-Core，Electron Microscopy Sciences，目录号：69039-60）
手持式菌落计数器（Heathrow Scientific，目录号：HS120000）
28℃细菌培养箱
离心机（Eppendorf，型号：5415D）
珠子辅助研磨机（ Retsch ，目录号：MM400）
分光光度计（ Amersham Biosciences，型号： Ultrospec 2100 pro）
无菌环境（本生灯或微生物罩）
多道移液器 (10 – 100 µL)
单通道移液器

程序

用于接种的细菌细胞的制备
即，此处为 50 µg/mL 利福平）的MOKA 板上生长的细菌细胞用于接种 5 mL 液体 MOKA 培养基（含有相同的抗生素），并在 28°C 在 200 rpm 的搅拌下生长过夜。
即3.3 × g ）离心 5 分钟，并在 1 mM MgCl 2中洗涤两次。重悬于 1 mM MgCl 2中并测量 OD 600nm 。
在 2 mL 试管中制备 1 mL 细菌悬浮液，以便对于每个菌株，最终 OD 600nm = 0.1（即1 × 10 8 cfu /毫升；注意：在与其他物种一起工作时，必须通过在 1 mM MgCl 2中电镀在固体培养基上来验证这一估计。
在 5 mL 管中将每种悬浮液稀释至 1/100，以获得 OD 600nm = 0.001的最终接种物（即1 × 10 6 cfu /mL) 在 5 mL 的 1 mM MgCl 2中。对于 WT* 参考菌株，在 OD 600nm = 0.001 处制备 10 mL 的悬浮液，因为它将用于所有混合物。
将 2 mL 的 WT* 悬浮液与每个菌株 2 mL 混合，在另一个 5 mL 管中进行测试（使每个混合菌株处于 5 × 10 5 cfu /mL，但接种物的终浓度为 1 × 10 6 cfu /mL)。

接种
使用装有 1 毫升细菌悬浮液的钝注射器，渗入花椰菜第 2 片真叶的叶肉（有关该过程的图片，请参见 Cohn等人，2015 年）。应该渗透足够大的区域，以便以后能够对 6 毫米的叶盘进行采样，而不会带走任何被注射器损坏的组织。通常，最多可以在同一片花椰菜叶子上渗透七个不同的点，从而允许在同一片叶子上接种多种菌株或混合物。在这种情况下，请注意将渗透区域分开以排除交叉污染。
圈出叶子下侧的浸润区域，以标记受感染的组织，以便以后取样。
将植物放入生长室并适当浇水。

接种悬浮液的电镀和混合种群中初始相对频率的计数
将 100 μL 的接种悬浮液转移到具有锥形底部的 96 孔板中。
使用多通道移液器执行串行 1/10 稀释（在 90 μL 的 1 mM MgCl 2中为 10 μL）。
取 100 µL 稀释液 10 -3并将它们铺在含有适当抗生素（即此处为利福平 50 µg/mL）和杀菌剂（即此处为 Pimaricin 30 µg/mL）以及 X-的圆形 92-mm MOKA 板上葡萄糖200 µM。在我们的例子中，通过使用 4 毫米玻璃珠摇动直到悬浮液均匀重新分配来进行扩散。
°C下孵育 4–5 天，以允许 GUS 表达菌落的细菌生长和蓝色染色。
计数蓝色和白色菌落，例如，使用手持菌落计数器，以确定 T 0时混合菌株的比例。这对于以后计算 CI 期间的正确标准化是必要的（请参阅数据分析部分）。

孵化后混合种群中相对频率的采样、电镀和计数
接种三天后，通过在标记标签定义的浸润区域冲出一个 6 毫米的叶盘并将其放入 200 μL 的 1 mM MgCl 2中，对叶肉组织进行采样。
使用 2 mL 管中的 4 mm 玻璃珠（每管 2 个珠子）使用珠子辅助研磨机在 30 Hz 下研磨叶样品 2 分钟。
短暂离心 (5 秒) 含有研磨材料的管子以将其收集在底部。
将 100 μL 的地面组织转移到具有锥形底部的 96 孔板上。
按照步骤 C2 到 C5 中的说明进行操作。然而，因为每个菌株显示不同的表型，并确保两个菌株的菌落存在，板 50 μL 的 10 -2和 10 -3稀释。
注意：通常，我们建议通过计数显示 30 到 300 个菌落的平板来收集细菌滴度。但是，由于竞争检测需要精确确定每种混合菌株的 CFU 数量，我们建议对混合接种样品至少有 100 个菌落的平板进行计数。

数据分析

出于重现性目的，实验应至少进行四次生物复制。生物复制被定义为使用新鲜缓冲液、从在新固体培养基上生长的细胞制备的新鲜细菌细胞悬液和新批次植物对完整实验程序的复制。竞争测定的结果显示为竞争指数 (CI)，其定义为孵育后突变体与 WT* 菌株的相对丰度之比，通过接种物中突变体与 WT* 菌株的相对丰度进行归一化（Taylor等人. , 1987; Macho等人, 2007):

CI=((N(mutants))⁄(N(WT)))3dpi/((N(mutants))⁄(N(WT)))T0

N ：菌落数
dpi : 接种后天数

在这里，我们使用了Xcc 8004:: GUS-GFP Δ hrpX 、 Δ hrcV和Δ xopAC突变体作为该协议的示例。这三个菌株是 III 型分泌系统相关突变体，在植物中表现出不同的适应性（Feng等人，2012；Guy等人，2013；Wang等人，2015）。当与 WT* 菌株共同接种时，这三种菌株的竞争指数如图 1 所示。 Xcc 8004:: GUS-GFP 是阴性对照，其适应度应与 WT* 参考菌株相同（即CI ~1）。 CI < 1 的菌株被认为比叶肉环境中的 WT 菌株更不适合。
我们使用了每个植物样品的四个独立的生物学重复。该图是使用 R 软件的 ggplot2 包生成的（ Wickham ，2016； https://github.com/tidyverse/ggplot2 ）。我们特意设置了一个基于 log10 的尺度来扩展低 CI 值，否则这些值很难区分。数据的统计处理也使用 R 实现 Kruskal-Wallis 检验。在图 1A 中使用字母“a”、“b”和“c”显示被识别为显着不同 ( P < 0.05) 的组。

图 1. Xcc的竞争分析 8004:: GUS-GFP 菌株和花椰菜叶肉中的相关突变体。
所有竞争测定均通过共同接种Xcc进行 8004:: GUS*-GFP* 参考菌株与 Xcc 8004 ::GUS-GFP 衍生物的比例为 1:1。在接种后 3 天对叶肉盘进行取样。 A. 竞争分析结果的图形表示。显示 CI ~1 的菌株被认为与 WT 菌株一样适合，而 CI < 1 的菌株被认为比叶肉环境中的 WT 菌株更不适合。水平条显示每个植物样品的四个独立生物学重复的中位数。通过Kruskal-Wallis 检验评估适应度差异的统计显着性。识别为显着不同的组 ( P < 0.05) 使用字母“a”、“b”和“c”显示。显示相同字母的结果属于同一统计组。 B. 在 3 dpi 的叶肉中显示来自 WT 与 WT * 样本的菌落的板照片。从视觉上看，这两个种群大致以 1:1 的比例存在，说明了两种菌株的预期等效适应性。在接种任何接种悬浮液后获得相同的 1:1 比率。 C. 在 3 dpi 的叶肉中显示来自 ΔhrpX 与 WT* 样品的菌落的板照片。 Δ hrpX的蓝染菌落菌株的代表性严重不足，清楚地暴露了该菌株的大量适应性不足。

食谱

MOKA培养基
混合 4 g 酵母提取物、8 g 酪蛋白氨基酸、2 g K 2 HPO 4和 0.3 g MgSO 4 · 7H 2 O。
加入蒸馏水至 1 L。
混合直至试剂完全溶解。
通过在 120°C 高压灭菌 20 分钟对 250-mL 的混合物进行灭菌。
在室温下储存。
用于平板的固体 MOKA 培养基的制备方法相同，并在高压灭菌前将 3.75 g 琼脂添加到每个单独的 250 mL 等分试样中。
1 mM MgCl 2溶液
通过将 2.033 g 的 MgCl 2 · 6H 2 O 溶解在 10 mL 的 dH 2 O中，制备 1 M MgCl 2的储备溶液。
通过在 120°C 高压灭菌 20 分钟进行灭菌。
2 O中稀释 1/1,000 的储备溶液来制备 1 mM MgCl 2 。
两种溶液均在室温下储存。
X-葡萄糖
通过将 0.54 克 X- gluc溶解在 10 mL 的 DMF 中来制备 X- gluc 500x 库存溶液。
储存在-20°C。
将 500 μL 的 X- gluc储备溶液添加到 250 mL 的 MOKA + 琼脂溶液中，以在用于 CI 测量的板中获得 200 μM 的 X- gluc最终浓度。
利福平
将利福平粉末溶解在甲醇中，以获得 10 mg/ mL 的库存溶液。
储存在-20°C。
在 MOKA 培养基中将利福平原液稀释至 1/200，以获得 50 μg/ mL 的最终浓度。
匹马霉素
将 pimaricin 粉末重新悬浮在水中，以获得 30 mg/ mL 的库存溶液。
储存于 4°C。
在 MOKA 介质中将 pimaricin 库存溶液稀释至 1/1,000，以获得 30 μg/ mL 的最终浓度。

致谢

这项工作得到了博士的支持。法国国家教育和研究部向 JSL 提供的资助。 ANR (ANR-19-CE20-0014-01) 支持 JSL、LDN、EL 和 AB。 LIPM 是法国卓越实验室项目 (TULIP ANR-10-LABX-41; ANR-11-IDEX-0002-02) 的一部分。

利益争夺

没有相互竞争的利益。

参考

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