材料和试剂

1.铝箔（卡尔罗斯GmbH的，Rotilabo ® ，Ç atalog号：0954.1）
2. Stripette TM血清移液管5 ml，10 ml（Corning，目录号：4051、4488）
3.盘子60毫米（Corning，目录号：3261）
4.猎鹰®离心管50毫升，15毫升（康宁，产品目录号：352070，352096）
5.安全防护罩手术刀（Biosigma srl ，目录号：530050）
6.金属钢基础模具（Leica Biosystem ，目录号：3803081）
7.光学显微镜盖玻片24 x 40 x 0.16 mm（Bio Optica SpA ，目录号：09-2040）
8.纸巾
9.组织包埋环（Bio Optica SpA ，目录号：07-7650）
10.指甲油
11. 10％的中性缓冲液ED福尔马林（NBF）（Diapath SpA的，Ç atalog号：F0047）
12.石蜡实验室O型蜡56-58 ℃下（HISTO -Line实验室SRL ，C atalog号：R0040-20）
13.无菌DPBS（Euroclone SpA，商标号：ECM4053XL）
14.二甲苯（生物ø ptica的SpA ，Ç atalog号：06-1304Q ）
15.无水乙醇（100％）（生物ø ptica的SpA ，Ç atalog号：06-10099）
16.去离子水
17.显微镜玻片超级冰霜®加（生物。光学SpA公司，Ç atalog号：09-OPLUS）
18.正常山羊血清（西格玛- Aldrich公司，Ç atalog号码：G9023，在-20以等份试样储存℃）
19.磷酸盐缓冲盐水片剂（西格玛- Aldrich公司，Ç atalog号：P4417）
20. α-SMA的小鼠单克隆（Santa Cruz Biotechnology公司，Ç atalog号：SC-32251）
21. PDGFR-β单克隆抗体兔抗人（Abcam公司，Ç atalog号：ab32570）
22.的AlexaFluor的山羊抗兔FITC缀合的（488纳米）抗体（分子探针，Ç atalog号：A11070）
23.的AlexaFluor山羊抗小鼠缀合TRITC（555 nm）的抗体（分子探针，Ç atalog号：A21127）
24. TO-PRO3碘化物（Invitrogen，目录号：T3605）
25. FluoroMount （生物。光学的SpA ，Ç atalog号：K024）
26.磷酸盐缓冲盐水片（西格玛，目录号：P4417）
27.柠檬酸（Sigma，目录号：C759）
28.柠檬酸钠（Sigma，目录号S4641）
29.正常山羊血清（Sigma-Aldrich，目录号G9023，在-20°C下等分储存）
30.解掩膜缓冲液（10 mM柠檬酸钠缓冲液）（请参阅食谱）
31.封闭溶液（10％正常山羊血清）（请参阅食谱）
32.稀释一抗的缓冲液（5％正常山羊血清）（请参阅食谱）
33.用于中频洗涤的PBS 1x （请参阅食谱）

设备

高压釜（AHSI SpA ，型号：FVA / A1）
镊子（Thermo Fisher Scientific，目录号10303611 ）
显微镜用剪刀（Bio Optica SpA ，目录号：32-703）
手套和护目镜
带电磁搅拌器的热板
PMP Hellendhal染色缸（卡特尔SpA的，实验室器皿司卡特尔TM ，Ç atalog号：0035500）
水浴
通风柜（Euroclone SpA ）
移液器（0.5-10，10-100和100-1 ，000微升）仪（Eppendorf，产品目录号：3111000.122，3111000.149，3111000.165）
巴德单片穿刺活检仪长16 G x 20厘米（CR Bard.Inc 。，货号：121620）
58 °C石蜡浴冷却板（Bio Optica SpA ，目录号：PF100）
切片机（Leica Biosystem，目录号：RM2125 RTS）
组织学浴（Bio Optica SpA ，目录号：WB100）
微波
用于免疫染色的木棒笔（Bio Optica SpA ，目录号：11-100 ）
轨道振动筛（Thermo Scientific，目录号：SHKA2000）
加湿室
pH值米ETER（Thermo Scientific的，Ç atalog号：3115101）

软件

的GraphPad Prism ® （版本5.0）（格拉夫派得软件）
图像分析软件（Leica QWin）（Leica）

程序

收集肾脏样本
准备用于样品处理的作业工具
在包装后其中高压灭菌干净镊子和剪刀铝箔。
肾脏活检程序
在实验过程开始时（T0），在健康和治疗猪的几个中间时间点进行针头活检。肾活检是与自动活检针直接超声引导下进行。处死后，将肾脏移出，并用安全的安全防护手术刀对骨皮质和髓质区域进行楔形活检。
每次肾脏活检均在装有20 ml冷（〜4°C）无菌DPBS的50 ml F alcon中递送至组织学实验室，并通过每只动物的唯一代码进行识别。
所有肾活检必须在最浸入冰半小时。
固定前准备肾脏活检
每次肾脏活检都必须转移到一个装有3 ml冷（约5°C）DPBS的60 mm皿中，并用无菌镊子将其清除掉任何残留的结缔组织或脂肪组织。
用无菌一次性手术刀可以将样本尺寸减小到0.5 x 0.5厘米。
肾标本必须在含有3毫升冷的另外60 mm皿转移（〜4℃）DPBS。

石蜡切片处理
肾脏标本固定
肾脏标本必须在室温下转移到装有10％中性福尔马林（NBF）的15 ml锥形管中8 h，但不得超过24 h。确保您有足够的固定剂覆盖组织。固定体积应为组织体积的5-10倍。
注：牛逼，他的肾标本不石蜡盒子托起。手动进行组织处理以模仿自动化处理的各个累积步骤。
肾标本脱水
固定后，福尔马林必须被丢弃。
肾标本有脱水移动酒精等级的步骤：
在室温下10 ml 50％乙醇放置40分钟（最多5天）。
10 ml 70％乙醇在室温下放置40分钟。
10 ml 95％乙醇在室温下放置25分钟。
10 ml 95％乙醇在室温下放置25分钟。
10 ml 100％乙醇在室温下放置25分钟。
10 ml 100％乙醇在室温下放置25分钟。
注意：这些步骤应完全完成（为这些步骤留出足够的时间），因为脱水不足会导致组织降解。
肾脏标本澄清
肾脏标本必须用二甲苯清除：
10 ml的二甲苯15分钟。
10 ml的二甲苯15分钟。
石蜡浸润肾标本
肾标本必须被转移到贝克尔在含有液体石蜡58 ℃的石蜡浴：10毫升液体石蜡2 h中的烘箱中在56℃-58 ℃（石蜡的熔融温度）。
将肾组织包埋在石蜡块中
熔融石蜡的少量具有被置于模具中，从石蜡储分配。
使用热镊子，肾样品必须被转移到阱中健康块金属钢基体的模具，将切割的一面朝下。
嵌入环必须被放入钢基础模具（在56 ℃）。石蜡色带漂浮在温水浴的表面上，在那里展开并完美展平。
模具具有可迅速地转移到冷却板（-20 ℃），并轻轻压平组织。石蜡将固化成薄薄的一层，将组织固定在适当的位置。
热石蜡已被添加到从石蜡分配器模具。确保有足够的石蜡覆盖组织。石蜡块应在-20°C下30分钟内固化。
当蜡完全冷却并硬化后，必须很容易地从模具中弹出石蜡块。蜡块不应粘住。如果蜡破裂或薄纸排列不正确，只需再次将其融化并重新开始。
制备石蜡切片：切片方案：
石蜡块具有在对一个40切片机和浮子期望厚度（通常为4-5微米）被分段含有蒸馏水℃水浴中。
笔记：
记录各部分的方向和顺序。
组织学浴必须达到最高56°C的温度，以使石蜡切片变平。
石蜡切片必须转移到Super Frost Plus显微镜载玻片上。
载玻片必须干燥过夜，并在室温下保存，直到可以使用为止。

免疫荧光染色
石蜡切片必须脱蜡并重新水化（整个过程必须在通风柜中进行设置）
载玻片必须在纯二甲苯中脱蜡15分钟。
注意：二甲苯去除了组织周围多余的蜡，并去除了石蜡切片。
载玻片必须使用梯度酒精系列再水化几分钟，然后用去离子水冲洗：
100％乙醇浸泡6分钟。
乙醇95％1分钟。
乙醇70％1分钟。
乙醇50％1分钟。
去离子水5分钟（连续3次）。
热诱导抗原暴露
载玻片必须转移到塑料垂直染色罐（适用于微波）中，其中装有100 ml pH = 6的柠檬酸钠缓冲液10 mM（装满帽沿），并放入水浴中。
注意：获得的水棒是将滑动罐放入一杯水（适用于微波）中，然后将整个东西放入微件中。这减少了罐内的沸腾。
载玻片必须经受5分钟的三个微波（750 W）循环。
抗原修复缓冲液的体积必须沸腾期间在每一周期为顶起来用蒸馏水，以避免蒸发。
幻灯片必须是让慢慢冷却。
注意：在每个抗原揭露过程中，载玻片的数量必须与染色罐中可用的位置相同，以便揭露的效率始终相同。如果使用的载玻片较少，请用空的玻璃载玻片填充空白处。这样可确保每个载玻片具有相似的热量分布，并减少了抗原回收的差异。
免疫荧光染色：
冷却的载玻片必须转移到装有去离子水的玻璃垂直染色罐中。在室温下，用去离子水在定轨摇床上清洗载玻片5分钟。
载玻片必须在室温下搅拌下，用三份PBS 1x漂洗5分钟，每次5分钟。
幻灯片必须放置与肾脏切片朝上在加湿室。
幻灯片上的每个部分都必须用PAP笔限制，以防止溢出。
100-200微升封闭缓冲液（10％正常山羊血清的PBS中稀释的1×）必须被添加到每个部分，并温育1个小时，在室温下，在加湿箱中。
染色组合必须制备组合并适当稀释的两种不同的抗体（封闭混合物（山羊血清的5％）中的α - SMA 1：100，PDGFR-β1：100），请注意之前单独测试的稀释度。
封闭缓冲液必须被轻轻地除去（例如，通过倾斜滑动侧身在纸巾上），而不添加第一抗体之前漂洗。
100微升的初级抗体混合物必须被添加到每个部分，并在加湿室中温育过夜，在4 ℃。
中频反应的阴性对照具有获得孵育同种型对照抗体代替初级抗体上的良好分隔部混合在幻灯片中的一个。
将载玻片必须被rinsedin PBS 1 X三次，每次5分钟。
必须分别混合两种二抗以结合两种一抗的混合物，并进行适当稀释：Alexa Fluor山羊抗小鼠555（1：200）和Alexa Fluor山羊抗兔488（1：200）在黑暗中PBS 1x。
二次抗体（50-100体积范围微升取决于混合的活检区域）具有在黑暗中的加湿箱上的部分和孵化要施加1个小时。
载玻片必须浸入PBS 1x中3分钟5分钟。
为了对幻灯片，TOPRO3的溶液（稀释1：3 ，000）的PBS 1X必须制备并添加于各部分编载玻片必须在加湿箱中在黑暗中孵育10分钟。
TOPRO3溶液必须从载玻片上排出，并且在不上升的情况下，必须在载玻片上添加一滴氟胶以安装盖玻片。确保没有气泡形成。
载玻片必须用指甲油密封以防止弄脏，并在黑暗中长时间保存。
载玻片必须通过共聚焦显微镜Leica TCS SP2（Leica）获取。

数据分析

使用配备有氩k气（488 nm），绿氖气（543 nm）和氦氖气（633 nm）激光器的Leica TCS SP2（Leica）进行共聚焦显微镜检查。通过该截面的z轴以500 nm的间隔拍摄共焦图像，总共深度为7 µm。分析来自单个光学平面和多个串行光学部分的图像，并在所有三个激光通道中依次扫描图像。这些影像是使用63X物镜拍摄并导出为TIFF文件，如图表明小号1和2。

图1.在LPS诱导的AKI的猪模型中，LPS诱导的PMT。A.在健康和内毒素猪的猪肾脏切片中进行PDGRβ和α-SMA染色的代表性图片。对于PDGFRβ（绿色）和α-SMA （红色），周细胞被双重染色。在健康猪（T9 CTR），α-SMA免疫染色信号才被内血管平滑肌细胞（虚线白箭头）和检测到的PD GFR β + / α SMA +血管周围细胞中几乎检测不到。在内毒素血症的猪（T9 LPS）PDGFRβ的数量+ /αSMA +细胞显著增加（白色箭头），如由在两个标记的共定位interstitiumand在肾小球水平。放大率630X。B.定量数据（每组n = 5 ，P = 0.001）。结果表示为每组五只独立猪的中值±IQR 。使用Mann - Whitney检验进行统计分析。根据Castellano等人的图1进行修改。（2019 ）。许可证：（http://creativecommons.org/licenses/by/4.0 /）。

图2.在I / R损伤的模型中补体激活诱导的PMT 。A.在T0（缺血前）和再灌注后24 h（T24 CTRL）对石蜡切片进行PDGRβ和α-SMA染色的代表性图片。在T0，PDGFR β + / α SMA +细胞是很少可检测的（缩小图像）和α-SMA在动脉壁（白色箭头）本地化。I / R损伤24小时后，这些细胞的数量急剧增加（T24 CTRL）。放大率630x。B.结果表示为每组五只独立猪的中值±IQR。使用Mann - Whitney检验进行统计分析。根据Castellano等人的图4进行修改。（2018 ）。许可证：（http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）。

两名对切片的来源不了解的独立观察员对每次活检至少连续10次高倍（630x）视野（0.0567 mm 2 HPF /切片）中的α-SMA +和PDGFR细胞计数。然后将这些值平均。对于每个视野，仅在皮质区域（周围和肾小球毛细血管）中计数阳性细胞。囊下纤维化区域，动脉外膜和髓质区域被排除在目标区域之外。根据核染色确定细胞计数。最终报告的计数是两项观察员措施的平均值。观察者之间的差异绝不会大于20％。
结果以中位数±四分位数间距（IQR）表示。通过Mann - Whitney检验评估统计学上的显着差异。甲P值< 0.05是显著。小号使用GraphPad Prism软件5进行tatistical分析如图3所示。

图3.通过GraphPad Prism软件进行的统计分析。A.打开GraphPad Prism并选择红色箭头指示的参数。B.开始在红色箭头指示的每个组中插入值。光盘。单击分析，然后选择要进行分析的测试。给定小样本（每组五只独立的猪），我们选择非参数检验，Mann - Whitney检验，并将数据表示为中位数和IQR。

菜谱

Unmasking Buffer（10毫升柠檬酸钠缓冲液）（500 ml）
柠檬酸溶液（10.5 g柠檬酸溶于500 ml蒸馏水）（41 ml ）
柠檬酸钠溶液（将14.7g柠檬酸钠溶于500 ml蒸馏水）（9 ml ）
蒸馏水（500毫升）
混合溶解。用1 N HCl将pH调节至6.0，并充分混合。将此溶液存储在4 °C以便更长的存储时间
封闭溶液（10％正常山羊血清）
5毫升PBS
500 μ升正常山羊血清
在4°C下保存1周
稀释一抗的缓冲液（5％正常山羊血清）
5毫升P BS 1 x
250 μ升正常山羊血清
在4°C下保存1周
PBS 1x用于中频洗涤
在200 ml去离子水中溶解一块磷酸盐缓冲盐水片，在25 °C时产生0.01 M磷酸盐缓冲液，0.0027 M氯化钾和0.137 M氯化钠，pH 7.4
在25°C下保存1周

致谢

这些研究得到了意大利卫生部的Bari“ Aldo Moro”大学（授予Giuseppe Castellano的Ricerca Finalizzata 2009和Giovani Ricercatori 2011-2012 [GR-2011-02351027]）的支持，这是一项区域战略拨款（普利亚地区（PSR） 094）授予Loreto Gesualdo），并获得Pharming Group的无限制研究资助。

利益争夺

作者没有利益冲突或竞争利益要披露。

伦理

这些研究得到了意大利卫生部伦理委员会的批准。

参考文献

Castellano，G.，Franzin，R.，Stasi，A.，Divella，C.，Sallustio，F.，Pontrelli，P.，Lucarelli，G.，Battaglia，M.，Staffieri，F.，Crovace，A.，史泰龙（G.史泰龙），西伦（M. 缺血/再灌注损伤过程中的补体激活诱导周细胞到成肌纤维细胞的转分化，通过pERK信号传导调节周围毛细血管腔的减少。前沿免疫9：1002。
Castellano，G.，Stasi，A.，Franzin，R.，Sallustio，F.，Divella，C.，Spinelli，A.，Netti，GS，Fiaccadori，E.，Cantaluppi，V.，Crovace，A.，Staffieri ，F.，Lacitignola，L.，Grandaliano，G.，Simone，S.，Pertosa，GB和Gesualdo，L.（2019）。LPS结合蛋白通过通过TLR-4信号诱导周细胞到成肌纤维细胞的转分化来调节急性肾纤维化。国际分子科学杂志20（15）：3682。
Castellano，G.，Stasi，A.，Intini，A.，Gigante，M.，Di Palma，AM，Divella，C.，Netti，GS，Prattichizzo，C.，Pontrelli，P.，Crovace，A.，Staffieri F.，Fiaccadori E.，Brienza N.，Grandaliano G.，Pertosa G.和Gesualdo，L.（2014年）。内毒素血症引起的少尿性肾损伤中的内皮功能障碍和肾纤维化：LPS结合蛋白的可能作用。暴击护理18（5）：520。
Chang，FC，Chou，YH，Chen，YT and Lin，SL（2012）。肾纤维化中周细胞-成肌纤维细胞转化和治疗靶点的新颖见解。Ĵ Formos医学协会杂志111（11）：589-598。
Chen，YT，Chang，FC，Wu，CF，Chou，YH，Hsu，HL，Chiang，WC，Shen，J.，Chen，YM，Wu，KD，Tsai，TJ，Duffield，JS and Lin，SL（2011））。血小板衍生的生长因子受体信号传导在阻塞性和缺血性肾纤维化中激活周细胞-成肌纤维细胞过渡。肾脏国际80（11）：1170-1181。
Di Carlo，SE和Peduto，L.（2018）。病理性成纤维细胞的血管周围起源。J临床投资128（1）：54-63。
Fani，F.，Regolisti，G.，Delsante，M.，Cantaluppi，V.，Castellano，G.，Gesualdo，L.，Villa G. and Fiaccadori，E.（2018）。脓毒症相关性急性肾损伤的发病机制的最新进展。Nephrol 31（3）：351-359。
Fiorentino，M.，Grandaliano，G.，Gesualdo，L.和Castellano，G.（2018）。急性肾脏损伤向慢性肾脏疾病的转变。Contrib Nephrol 193：45-54。
新墨西哥州的Goldenberg，比利时的Steinberg，AS的Slutsky和WL的Lee（2011）。障碍打破：败血症发病机制的新认识。Sci Transl Med 3（88）：88ps25。
Grgic ，I.，Duffield，JS和Humphreys，BD（2012）。间质性成纤维细胞在慢性肾脏疾病中的起源。Pediatr Nephrol 27（2）：183-193。
Guzzi，F.，Cirillo，L.，Roperto，RM，Romagnani，P.和Lazzeri，E.（2019）。急性肾脏损伤向慢性肾脏疾病转变的分子机制：更新的观点。国际分子科学杂志20（19）：4941。
休伊森，TD（2012）。肾脏纤维化：共享的问题减半吗？纤维发生组织修复5（Suppl 1）：S14。
Humphreys，BD，Lin，SL，Kobayashi，A.，Hudson，TE，Nowlin，BT，Bonventre，JV，Valerius ，MT，McMahon，AP和Duffield，JS（2010）。命运追踪揭示了肾纤维化中成纤维细胞的周细胞而非上皮起源。美国病理学杂志176（1）：85-97。
Kramann ，R.，Schneider，RK，DiRocco ，DP，Machado，F.，Fleig ，S.，Bondzie ，PA，Henderson，JM，Ebert，BL和Humphreys，BD（2015）。血管周围Gli1 +祖细胞是损伤诱导的器官纤维化的关键因素。细胞干细胞16（1）：51-66。
叶，IA，中川，S。，约翰逊，BG，Cha，JJ，米特尔斯特德，K。，古奇，KM，戈麦斯，IG，阿尔特迈尔，华盛顿州和杜菲尔德，JS（2017）。Pericyte MyD88和IRAK4控制对组织损伤的炎症和纤维化反应。临床研究杂志127（1）：321-334。
Lin，SL，Kisseleva ，T.，Brenner，DA和JS Duffield（2008）。周细胞和血管周成纤维细胞是肾脏阻塞性纤维化中产生胶原蛋白的细胞的主要来源。美国病理学杂志173（6）：1617-1627。
Meran ，S。和Steadman，R。（2011）。肾纤维化中的成纤维细胞和成肌纤维细胞。Int J Exp Pathol 92（3）：158-167。
Page，AV and Liles，WC（2013）。感染性疾病中内皮细胞活化/功能障碍的生物标志物。毒力4（6）：507-516。
西蒙妮·S·拉西奥·F·卡斯泰拉诺·G·迪维拉·C·基耶蒂·A·狄通诺·P·巴塔格利亚·M·科洛韦斯·A·斯塔菲里里·F·奥特温史泰龙（G.Stalone），格苏尔多（L. 肾缺血/再灌注损伤中补体依赖性NADPH氧化酶的活化。Free Radic Biol Med 74：263-273。
Stasi，A.Intini，A.Divella，C.，Franzin，R.，Montemurno，E.，Grandaliano，G.，Ronco，C.，Fiaccadori，E.，Pertosa，GB，Gesualdo，L。和Castellano ，G.（2017）。脂多糖结合蛋白在败血症诱导的急性肾损伤中的新兴作用。Nephrol Dial移植32（1）：24-31。
Wang，N.，Deng，Y.，Liu，A.，Shen，N.，Wang，W.，Du，X.，Tang，Q.，Li，S.，Odeh，Z.，Wu，T. and Lin H.（2017年）。肾间质纤维化中周生肌成纤维细胞转变的新机制：核心岩藻糖基化调节。科学代表7（1）：16914。