材料和试剂

1. Falcon TM （规格50毫升； D-51588）
2.细胞过滤器（70 µm尼龙网，Fischer品牌，目录号：22363548）
3.细胞过滤器（40 µm尼龙网，Fischer品牌，目录号：22363547）
4.带螺帽的圆底玻璃管（尺寸：11 ml；派热克斯玻璃纤维，目录号：10004654）
5.手术刀刀片（Thermo Scientific TM 53221，目录号：12657776）
6.培养皿（Fisherbrand TM聚苯乙烯培养皿，无菌；尺寸：90毫米）
7。注射器过滤器（0.45 µm ，FRISENETTE，目录号：CALS2504100S）
8.无菌注射器（20 ml和50 ml）（Chirana ，目录号：CH03020L; CH03050L）
9.无菌移液器吸头（Labsolute ，无热原，一次性使用，大小：50 ml，10 ml，5 ml）
10.如先前在Bach等人中所述，将苔藓（Physcomitrella专利）预先混合4-5天（液体培养），并在25 mC，5 mM酒石酸铵存在下于16 h光照/ 8 h黑暗周期中生长。。（2014）。
11。纤维素酶ONOZUKA R-10 1.5％（w / v）（DUCHEFA，目录号：C8001.0010，CAS号：9012-54-8），储存温度2-8°C
12. Macerozyme R-10 0.5％（w / v）（DUCHEFA，目录号：M8002.0010，CAS号：9032-75-1），储存温度2-8°C
13. D-甘露醇（Duchefa Biochemie ，目录号：M0803.5000; CAS号：69-65-8）
14. CaCl 2 （SIGMA，目录号：C3306-550G; CAS号：10035-04-8）
15. MES水合物（SIGMA，目录号：M2933-1Kg）
16. KOH（SIGMA，目录号：484016-1KG; C AS号：1310-58-3）
17. Trizma基地（SIGMA，目录号：T6066-1Kg；CAS号：77-86-1）
18. HCl（VWR Chemicals，目录号：20255.200; CAS号：7647-01-0）
19. Ca（NO 3 ）2 ·4H 2 O（SIGMA，目录号：C2788-500G；CAS号：13477-34-4）
20.将聚乙二醇（PEG，MW 6000）（SIGMA，目录号：81 253-250G; CAS号：25322-68-3）
21. MgCl 2 （SIGMA ，目录号：M8266; CAS号：7786-30-3）
22.琼脂，经测试的植物细胞培养物（Alfa Aesar ，目录号：H26724；CAS号：9002-18-0）
23.酒石酸铵（SIGMA，目录号：09985-250G; CAS号：3164-29-2）
24. ħ 3 BO 3
25. MnCl 2 · 4H 2 O
26.烷基（SO 4 ）2 · 12H 2 O
27.氯化钴2 · 6H 2 O
28. CuSO 4 · 5H 2 O
29. ZnSO 4 · 7H 2 O
30. KBr
31. KI
32.氯化锂
33.氯化锡2 · 2H 2 O
34.甘露醇8.5％（请参阅食谱）
35. 1 M CaCl 2 （请参阅食谱）
36. 2 M KOH（请参阅食谱）
37. 0.2 M MES pH 5.8（参见食谱）
38.原生质体培养基（PM ）（请参阅食谱）
39.原生质体清洗液（PW ）（请参阅食谱）
40. 0.4 M Tris-Cl pH 8.0（参见配方）
41. PEG-MCT（请参阅食谱）
42. 1 M MgCl 2 （请参阅食谱）
43. MMM解决方案（请参阅食谱）
44. PRMB媒体（请参阅食谱）
45. PRMT媒体（请参阅食谱）
46. BCD媒体（请参阅食谱）
47. BCD板（请参阅食谱）
48. 500 mM酒石酸铵（请参阅食谱）

设备

1. 锥形瓶（1 L，无菌）
2. 试剂瓶（500 ml，250 ml，100 ml）
3. 血清移液管（品牌®的Accu -jet ®亲，目录号：19B17038）
4. 离心机（ThermoFish呃，型号：贺利氏TM Multifuge TM X1R ）
5. 血细胞计数器（Neubauer改良的0.1 mm，德国优越MARIENFELD；目录号：0650030）
6. 光学显微镜（OLYMPUS ，BX40）
7. 30 °C保温箱（Gerhardt Thermoshake ）
8. 手术刀手柄（Thermo Scientific TM 53410，目录号：12667776）
9. 镊子（Bochem TM 1020R，货号：10333511）
10. 微波炉（惠而浦，古斯托：GT285）
11. 无菌玻璃纸盘（尺寸：80毫米，公司：Focus Packaging＆Design Ltd，PKS150 70-01，批次：05377）
12. 手术胶带（微孔，1.25厘米X 9.1 m，½英寸x 10码，Ref：1530-0）
13. 本生灯（Campingaz ，Easy clic TM Plus; CV300 Plus）
14. 层流气流平台（LAF平台）
15. 45°C的水浴（MgW LAUDA MS）
16. 摇杆（品牌：Desaga，Starstedt-Gruppe）
17. 均质机（IKA ® T25数码ULTRA TURRAX）

程序

程序指南

注意事项：
1. 在室温下执行所有步骤（20-25 ℃下），除非另有说明。
2. 使用经高压灭菌或过滤器灭菌的溶液和设备。
3. 处理苔藓时，请始终使用微生物无菌技术，并在无菌设施中工作。
4. 执行所有离心步骤在200 X g ^缓慢加速和突破速度*除非另有说明，行吟诗人rwise 。
*使用Heraeus TM Multifuge TM X1R（Thermo Fisher）时的加速速度2和减速速度4 。

原生质体的产生

A.苔藓的准备

注意：在使用前，将苔藓混合两次，每次混合之间至少要间隔7天。加入5 mM的酒石酸铵以生长苔藓。第二次混合后，在第4天或第5天使用苔藓进行转化。

通过70 µm细胞过滤器过滤，过滤5天大的原苔藓组织。
将细胞过滤器放在50 ml F alcon管上。通过过滤器过滤40毫升的苔藓培养物，以收集顶部的苔藓（图1）。将细胞过滤器转移到新的F alcon管上，并重复多次过滤步骤以收集约1.5 g的苔藓。
将收集有苔藓的细胞滤网转移到新鲜的50 ml F alcon管中。将50 ml高压灭菌的软化水通过过滤器，以清洗并去除苔藓中的BCD介质痕迹。重复此洗涤步骤4-5次。
使用无菌镊子将收集自滤网的苔藓分成五个50 ml F alcon管。每个试管应包含约200至300 mg的植物组织。

图1 。苔藓前体组织的收集进行原生质形成。一。将70 µm无菌细胞滤网放在F alcon管上。乙。通过滤网的苔藓培养物收集顶部的苔藓。

B. enzyme溶液（p repare鲜）

1.在750毫升的PM培养基中加入750毫克的纤维素酶Onozuka R-10，在玻璃烧杯中制备酶溶液。用磁珠搅拌溶解盐，直到溶液看起来澄清为止。

2.纤维素酶完全溶解后，添加250 mg的Macerozyme R-10，并像以前一样完全溶解。

注意：系统地添加两种盐可确保其完全溶解。此时的酶溶液应为浅棕色。

3.将酶溶液转移至50 ml F alcon管中，并以5,000 g离心2分钟（将离心机的加速和减速速度设置为9）。

4.避免沉淀物和过滤器，将0.45 µm注射器过滤器过滤到LAF工作台内部的新的50 ml F alcon管中，以免上清液灭菌。

5.将10 ml无菌酶溶液分配到5个装有苔藓的F alcon管中（来自S tep A4），摇晃使其悬浮并将混合物转移到5个无菌P -tritri盘中。

6.在黑暗中于30°C下在酶溶液中孵育至少3 h。1.5小时后，用显微镜评估一滴消化液中游离漂浮的原生质体的数量，然后每30分钟评估一次。消化大部分原质组织后进行。

重要！苔藓原生质体非常脆弱，很容易受到干扰。处理原生质体时，应格外小心，并避免物理干扰。使用具有大开口的移液器吸头（用加热的无菌手术刀切开常规移液器吸头的尖端），并缓慢吸出原生质体悬浮液，以避免因抽吸而造成干扰。切勿涡旋原生质体悬浮液。在LAF工作台内无菌条件下执行所有步骤。

C. Isola te原生质体

1. 通过将悬浮液通过70 µm细胞过滤器过滤来恢复原生质体。洗P用2-3毫升PM中，以溶解任何剩余的苔藓粘在表面上，并且通过网状过滤此为好，以收集所有的原生质体ETRI-菜肴。
2. 再次，将消化后的溶液通过40μm筛孔，以进一步去除细胞碎片和未消化的前体。
3. 将滤液收集在50 ml F alcon管中，并分配到五个10 ml圆底玻璃管中。
注意：离心时，使用额外的玻璃管和10 ml水平衡。

4. 在200 x g （22 °C）下离心原生质体悬浮液10分钟。
5. 用移液管小心倒出上清液，而不要将管倒置。这避免了由于原生质体小球没有紧密粘附在管壁上而丢失小球的风险。移液时会留下少量上清液，以便原生质体沉淀保持浸没状态。
6. 轻轻摇动试管，将原生质体沉淀重悬于约1 ml PW溶液中。将所有试管中的原生质体悬浮液收集到一个管中，并加入PW以获得10 ml的总体积。
7. 重复步骤C4和C5。
8. 通过轻轻摇动试管，将原生质体沉淀物浸入3 ml PW溶液中。用血球计数器估算原生质体密度。计算两个网格区域上的原生质体数量（有关原生质体的图像，请参见图2 ），并使用平均值来估计原生质体的数量。

血细胞计数仪上网格区域的总体积：

1毫米×1毫米×0 。1毫米= 0 。1毫米3

解决方案中估计的原生质数：

网格面积上的原生质体×10 4 ×以毫升为单位的总体积=原生质体的数量

9. 重复步骤C4。
10. 用移液器小心倒出大部分上清液，当沉淀开始溶解时停止移液。
11. 在所需量的MMM溶液中重悬原生质体沉淀，以获得1.6 x 10 6原生质体/ ml的终浓度。

最终体积MMM-原生质体悬浮液：

图2 。该图显示了P. patens原生质体的显微镜图像。一。这是一些游离的原生质体，并带有前质组织。B.仅游离原生质体。B是治疗后的理想情况。C.未消化的前体组织。

D.原生质体转化

1. 对于每次转化，将20 µg D NA转移到50 ml F alcon无菌试管的底部。
注意：使用20 µg DNA的体积不超过30-50 µl。

步骤S 2-6具有时间敏感性

2. 将300 µl原生质体悬浮液（来自步骤C 11）和300 µl无菌PEG-MCT溶液添加到DNA中，并轻轻敲打试管进行混合。
3. 将混合物在45°C的水浴中孵育5分钟，然后在室温下孵育5分钟。同时使用微波融化PRMT介质。将熔化的PRMT放在45°C的水浴中。
4. 五次向“原生质体-PEG-DNA悬浮液”中加入300 µl PW溶液，每次稀释之间间隔1分钟。
5. 现在将1 ml PW溶液添加五次，每次稀释之间的间隔为1分钟。
6. 以200 x g的离心速度离心3分钟。用移液管小心倒出上清液。在这一点上，原生质体沉淀可能不可见，因此在移液时留少量（〜300 µl）的上清液。
7. 将原生质体重悬于500 µl PW溶液中。
8. 向温暖的PRMT培养基（保持45 °C）中添加10 mM CaCl 2 。现在，将2.5 ml的CaCl 2 -PRMT混合物添加到原生质体悬浮液中，然后轻按F alcon管轻轻混合。
9. 在覆盖有单个无菌玻璃纸盘的三个PRMB板之间分配1 ml这种混合物。
注意：将原生质体悬浮液缓慢分散在PRMT板上，同时在进行过程中用移液管吸头轻轻分散混合物。这确保均匀分布，并避免了在板的圆顶状凝胶斑点（切断1的端部，000微升尖端与该步骤加热的手术刀）。

10. 让原生质体在黑暗中于25°C下恢复过夜。
注意：要模拟黑暗条件，请用铝箔纸覆盖每块板。

11. 将板在25°C下连续光照5天。
12. 将含有原生质体PRMT层的玻璃纸圆盘转移到含有抗生素的BCD板上。在25°C下的标准生长条件下（16小时白天/ 8小时夜间循环）培育苔藓，然后选择阳性转化体。

数据分析

结果

3 ml PW溶液中的原生质体估计数量：

网格1和网格2上的原生质体及其平均值

网格面积上的原生质体×10 4 ×以毫升为单位的总体积=原生质体的数量

59 。5 ×10 4 ×3 = 178 。5 × 10 4或1 。3 ml中的79 × 10 6原生质体

最终体积的MMM原生质体悬浮液：

选择程序以获得稳定的苔藓线

在含抗生素的BCD平板上放置2周后，将已回收的转化子的玻璃纸圆盘转移到新鲜的含抗生素的BCD平板上，并在25 °C下于标准生长条件下再孵育2周。
将每个菌落转移到无抗生素的BCD平板上（用单个无菌玻璃纸覆盖）。在标准生长条件下于25°C孵育平板10天。
注意：将每个菌落分别转移到BCD板上，以避免获得嵌合菌落。转移后，用70％乙醇对镊子进行消毒并每次射击。

在无选择的平板上孵育10天后，将每个原代菌落的一小部分转移至含适当抗生素的BCD平板上。在标准生长条件下于25 °C孵育平板10天。仅稳定的转化体在选择板上生长。
注意：转移的原生质应仅从每个菌落的生长末端收集。避免转移整个菌落或配子。

在选择板上孵育10天后，将玻璃纸转移到无抗生素的选择板上，并使其生长一周，然后再将其分别转移到覆盖有玻璃纸的新鲜BCD板上。
使用基因型序列验证，代谢谱分析或蛋白质组学或表型学等方法来验证转化体。

菜谱

1. 8.5％（w / v）甘露醇（预先准备）
通过将91.08 g D-甘露醇添加到400 ml软化水中来制备500 ml 8.5％（w / v）甘露醇溶液
溶解后，加入软化水使体积达到500 ml，并进行高压灭菌
2. 1 M的CaCl 2 （p预先repare）
通过向300 ml软化水中添加73.51 g CaCl 2来制备500 ml 1 M CaCl 2 ∙2H 2 O
溶解后，加入软化水补足至500 ml
请勿高压灭菌，而是在使用前进行过滤灭菌
3. 2M KOH（p预先repare）
通过将11.2 g的KOH添加到50 ml的软化水中来制备100 ml的2 M KOH
盐完全溶解后，加入软化水补足至100 ml，然后高压灭菌
4. 0.2M MES pH 5.8的（p预先repare）
在室温下储存

加入约3.90 g MES水合物，制备100 ml 0.2 M 2-（N-吗啉代）乙磺酸（MES）。40毫升软化水，在磁力搅拌器上完全溶解
用2 M KOH将pH调到5.8
pH值稳定后，添加软化水使体积达到100 ml
5. 原生质体介质（PM ）（p提前repared）
在室温下储存

通过将10 ml的0.2 M MES（pH 5.8）和1 ml的1 M CaCl 2加入89 ml的8.5％甘露醇溶液中来制备100 ml的PM
MES中的MES（pH 5.8）的工作浓度为20 mM，CaCl 2的工作浓度为10 mM
过滤器对媒体进行消毒
6. 原生质体洗涤液（PW ）（预先p重复）
在室温下储存

通过向97 ml的8.5％甘露醇中添加2 ml的0.2 M MES（pH 5.8）和1 ml的1 M CaCl 2来制备100 ml的PW。
PW中的MES（pH 5.8）的工作浓度为4 mM，CaCl 2的工作浓度为10 mM
过滤器对媒体进行消毒
7. 0.4M的Tris-CL pH为8.0（p预先repare）
通过将4.84 g Tris碱添加到70 ml脱盐水中来制备100 ml 0.4 M Tris-Cl
溶解后，用2 M HCl将pH调节至8.0，然后加入软化水使体积达到100 ml
8. PEG-MCT（p repare鲜）
通过添加118 mg Ca（NO 3 ）2制备5 ml PEG-MCT· 4H 2 O和125 µl 0.4 M Tris-Cl（pH 8.0）到5 ml的8.5％甘露醇溶液中并溶解
注意：每次转化需准备300 µl PEG-MCT溶液。

加入2克聚乙二醇（PEG，MW 6000）并充分混合
将溶液在摇杆上放置至少2小时，以完全溶解PEG，避免重结晶
PEG溶解后，对PEG-MCT溶液进行过滤灭菌
注意：此处PEG代表聚乙二醇，MCT代表甘露醇+硝酸钙+ Tris-Cl （用于制备PEG溶液的盐）。

9. 1M的MgCl 2 （p预先repare）
通过将9.52 g MgCl 2盐添加到80 ml软化水中来制备100 ml 1 M MgCl 2
溶解后，加入软化水使体积达到100 ml，然后高压灭菌
10. MMM溶液（p repare新鲜）
通过将150 µl 1 M MgCl 2和100 µl 0.2 M MES加入到10 ml的去离子水中的8.5％甘露醇溶液中，制备10 ml的MMM溶液。这足以进行10-15次转换
使用前过滤除菌
注意：此处，MMM代表甘露醇+ MgCl 2 + MES；PRMB代表原生质体再生培养基基础层；PRMT代表原生质体再生培养基顶层。

11. PRMB（p提前repare）
制备BCD我直径机智H 6％（W / V）甘露醇和0.7％（W / V）琼脂在软化水，随后高压灭菌
一旦稍微冷却，添加10mM的氯化钙的最终浓度2浇注到前P ETRI-菜肴。固化后，用无菌玻璃纸覆盖培养基
准备3 P ETRI-菜，每改造珠江口盆地中
12 PRMT（p提前repare）
在去离子水中准备200 ml含8％（w / v）甘露醇和0.4％（w / v）琼脂的BCD培养基，然后高压灭菌
稍微冷却后，将50 ml培养基等分到LAF工作台内的四个无菌100 ml试剂瓶中
可选：可将其中一份保存在60 °C的烤箱中以保持温暖。该培养基可以在同一天用于转化，也可以融化形式最多保存2周。

等分试样可在室温下保存，需要时可在使用前加热（请参阅步骤D3）
注意：微波中的介质加热应在有经验的人员的监督下进行，并遵守安全准则。

13. BCD（p提前repare）
混合制备1升BCD培养基：
12.5毫克FeSO 4 · 7H 2 O

10 ml“溶液B”（25 g / L MgSO 4 · 7H 2 O）

10 ml“溶液C”（25 g / L KH 2 PO 4 ，用4 M KOH将pH调节至6.5）

10 ml“溶液D”（101 g / L KNO 3 ）

此附加“微量元素溶液”（1毫升614毫克ħ 3 BO 3 ，389毫克的MnCl 2 · 4H 2 O，110毫克ALK （SO 4 ）2 · 12H 2 O，55毫克氯化钴2 · 6H 2 O， 55毫克的CuSO 4 · 5H 2 O，55毫克的ZnSO 4 · 7H 2 O，28毫克溴化钾，28毫克KI，28毫克氯化锂，28毫克和的SnCl 2 · 2H 2 ö每升）
14. BCD板（p预先repare）
对于每一个转化，制备3 P ETRI-菜肴用含有0.7％BCD培养基（W / V）琼脂和抗生素与选择标记对应的用于转化
添加1mM的氯化钙的最终浓度2倒入之前P ETRI-菜
15. 500酒石酸盐毫铵（p预先repare）
通过将9.21 g酒石酸铵盐添加到80 ml的去离子水中来制备100 ml的500 m M酒石酸铵（C 4 H 12 N 2 O 6 ）
溶解后再加水补足至100毫升
使用前过滤除菌

致谢

这项工作是由研究基金（00022855）的支持Villum Fonden ，作为VILLUM实验的一部分程序由两个伊拉斯谟+津贴和。该协议是从巴赫等人修改。，2014年。

利益争夺

作者宣称，这项研究是在没有任何商业或金融关系的情况下进行的，可以将其解释为潜在的利益冲突。

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