材料及相关试剂

1. 适用于SARS-CoV-2的个人防护装备（PPE）
2. 0.2 ml PCR管条（Labcon，产品编号：LC 3927-550）
3. 吸管尖头
4. WarmStart®比色灯2x主混料（新英格兰生物实验室公司，目录号：M1800）（等分并在-20°C下储存）
5. 蛋白酶K（见基因，目录号：744300.4.UC384，储存温度-20°C）
6. 盐酸胍（西格玛，目录号：G4505）
7. 脱氧核糖核酸酶游离水（生物工业，目录号：01-869-1B）
8. SARS-CoV-2的引物（表1）（Zhang等人，2020年）
9. 阳性内部处理和扩增控制引物（表2）（Curtis等人，2018年）流行音乐7
10. 底漆混合物（见配方）
11. 蛋白酶K（见食谱）
12. 盐酸胍（见配方）

表1。用于RT-LAMP的SARS-CoV-2引物
底漆名称序列
基因-A-F3 TGG CTA CTA CCG AAG AGC T公司
基因-A-B3 TGC AGC ATT GTT AGG在
GeneN-A-LF（循环前进） GGA CTG AGA TCT TTC附件TTA CCG T
GeneN-A-LB（回路向后）表演GAG GGA GCC TTG AAT ACA
GeneN-A-FIP（前内侧底漆） TCT GGC CCA GTT CCT AGG标签TCC AGA CGA ATT CGT GGT GG
GeneN-A-BIP（反向内部底漆） AGA CGG目录目录ATG GGT TGC ACG GGT GCC AAT GTG ATC T

表2。RT-LAMP用RNaseP pop7引物-阳性对照
底漆名称序列
pop7型-三层 TTG ATG AGC TGG AGC CA公司
pop7型-B3 CAC CCT CAA TGC AGA GTC公司
pop7型-LF（循环前进） ATG TGG ATG GCT堵头TTG TT
pop7型-LB（向后循环）类别GCT ACC GAG
pop7型-FIP（前内侧底漆） GTG-TGA-CCC-TGA-AGA-CTC-GGT-TTT-AGC-TGA-CTC-GGA-TC
pop7型-BIP（反向内部底漆） CCT CCG TGA TAT GGC TCT TCG TTT TTT TCT TAC ATG GCT CTG GTC

设备

1. 1µl-10µl、10µl-50µl、20µl-200µl移液管
2. PCR热循环器作为热源（Biometra，目录号：T3000）

程序

A、准备底漆混合物。（参见配方）准备两种混合物：（1）用于SARS-Cov-2测试。（2）用于pop7阳性的内部处理和扩增控制。

B、样品分析和制备（见图1A）
1. 对于唾液样品：在1毫升无脱氧核糖核酸酶核糖核酸酶的水（在唾液样品的同一容器中）中再悬浮。对于喉部/鼻腔拭子样本：使用标准通用转移介质（UTM）进行此测试。
2. 将5µl样品（步骤B1）添加到含有40µl DNase RNase游离水的PCR管中。
3. 包含非模板控件。加入5µl无DNase RNase的水代替样品。
4. 添加2µl蛋白酶K（最终浓度1.22 mg/ml）。
5. 室温下培养15分钟。
6. 在PCR机器或任何其他热源中于95℃孵育5分钟。摄氏度
注：我们成功地使用了热水杯。
7. 把样品冷却到室温。

C、 RT-LAMP反应（见图1A）准备三种混合物：（1）用于SARS-CoV-2试验。（2）以pop7基因为阳性对照。对于每种混合物，使用相关底漆。（3）对于使用SARS-CoV-2引物的非模板控制（见步骤B3）。
1. 准备反应：
混合灯10µl
底漆混合物2µl
盐酸胍1µl
样品裂解液（程序B的产物）7µl
2. 在65°C下培养30-40分钟。
3. 读取结果：
如果混合物颜色从粉红色变为黄色，则样品测试呈阳性（见图1B）。如果混合物保持粉红色，则样品测试为阴性（见图1B）。请注意，结果是二进制的，可以是正数，也可以是负数。只有亮黄色的结果被视为阳性。粉红色被认为是负的，任何其他范围或颜色的渐变都被认为是负的。阳性对照结果发表于Ben Assa*、Naddaf*等人，2020年（图3a）。

图1。SARS-CoV-2rt-LAMP检测方法及结果。A、步骤的说明协议：这个例子总结了协议的主要步骤。插图是用BioRender.com网站. B、培养前后各一个阴性样品（阴性样品）和一个阳性样品（阳性样品）。t=0 min时（左面板），所有样本均为粉红色。孵育30分钟后（右图），阳性样品变为黄色，阴性样品保持粉红色。图片是临床诊断鼻和喉拭子的代表性RT-LAMP测试结果，发表于Ben Assa*，Naddaf*等人，2020年。用常规RT-2法和常规提取法对SARS-CoV进行RT-2纯化。

笔记

1. 除PCR机外，步骤B5和C2可使用任何加热源（例如水浴）。我们成功地用了一个保温杯和一个温度计来调节水温。
2. 培养时间超过40分钟可能会导致非特异性的颜色变化，并被解释为假阳性结果。
3. 从步骤B开始并在整个方案的其余部分处理样品时，使用适当的个人防护设备是非常重要的。
4. 方案中的颜色变化表示二元阳性/阴性结果，不代表患者临床状态的任何梯度指示。

食谱

1底漆混合物1底漆混合物
a、在100µM处制备每种底漆
b、底漆混合物：F3 2µl（2µM最终浓度）
B3 2µl（2µM最终浓度）
LF 4µl（4µM最终浓度）
LB 4µl（4µM最终浓度）
FIP 16µl（16µM最终浓度）
BIP 16µl（16µM最终浓度）
c、脱氧核糖核酸酶游离水56µl
d、等分份并在-20°C下储存
2. 储备浓度为28.67（mg/ml）的蛋白酶K
溶于无DNase-RNase的水
储存于-20°C
3. 盐酸胍
溶于无DNase-RNase的水
原料浓度，800 mM
室温下储存

致谢

我们感谢Geva-Zatorsky实验室富有成效的讨论和贡献。我们要感谢兰巴姆医院的支持和接待，特别是对传染病和病毒学小组的支持。我们还要感谢Rich Roberts博士和Nathan Tanner博士的宝贵支持，以及Daniel King教授、Yehuda Chowers教授、Ronit Almog博士、Yuval Geffen博士、Dani Zvi Bar博士和Oded Lewinson教授提供的重要帮助。此外，我们要感谢迪马·阿布杜为本文件编制了数字。图1B中的插图是用BioRender.com网站.
这项工作得到了Technion综合癌症中心、Technion-以色列理工学院、“Keren Hanasi”、Alon杰出青年研究员奖学金、Horev Fellow（Taub基金会）的支持。NGZ是加拿大高级研究所（CIFAR）的Azrieli全球学者。

相互竞争的利益

作者声明与本文的研究、作者身份和/或出版没有潜在的利益冲突。在进行这项研究时，没有任何公司对这项研究进行投资，也没有打算商业化。

伦理学

本研究中，志愿者被批准使用本研究的IRCOVAM-4标准。

工具书类

1. Ben Assa，N.，Naddaf，R.，Gefen，T.，Capucha，T.，Hajjo，H.，Mandelbaum，N.，Elbaum，L.，Rogov，P.，King，D.A.，Kaplan，S.，Rotem，A.，Chowers，M.，Szwarcwort-Cohen，M.，Paul，M.和Geva Zatorsky，N.（2020年）。患者SARS-CoV-2的现场直接检测。实验生物医学（梅伍德）245（14）：1187-1193。
2. Bruce，E.A.，Huang，M.L.，Perchetti，G.A.，Tighe，S.，Laaguiby，P.，Hoffman，J.J.，Gerrard，D.L.，Nalla，A.K.，Wei，Y.，Greninger，A.L.，Diehl，S.A.，Shirley，D.J.，Leonard，D.G.B.，Huston，C.D.，Kirkpatrick，B.D.，Dragon，J.A.，Crothers，J.W.，Jerome，K.R.和Botten，J.W.（2020年）。无需提取RNA直接RT-qPCR检测SARS-CoV-2rna。生物14。doi:10.1101/2020.03.20.001008。
3. Curtis，K.A.，Morrison，D.，Rudolph，D.L.，Shankar，A.，Bloomfield，L.S.P.，Switzer，W.M.和Owen，S.M.（2018年）。多重RT-LAMP法检测血浆或全血中M组HIV-1。维罗尔方法杂志255:91-97。
4. Notomi，T.，冈山H.，Masubuchi，H.，Yonekawa，T.，Watanabe，K.，Amino，N.和Hase，T.（2000年）。环介导的DNA等温扩增。核酸研究28（12）：e63-e63。
5. Wang，X.，Yin，F.，Bi，Y.，Cheng，G.，Li，J.，Hou，L.，Li，Y.，Yang，B.，Liu，W.和Yang，L.（2016年）。逆转录环介导等温扩增快速灵敏检测寨卡病毒。维罗尔方法杂志238:86-93。
6. 于，L.，吴，S.，郝，X.，董，X.，毛，L.，佩莱查诺，V.，陈，W.H.和尹，X.（2020年）。应用逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）诊断平台快速检测COVID-19冠状病毒。临床化学66（7）：975-977。
7. Zhang，Y.，Odiwuor，N.，Xiong，J.，Sun，L.，Nyaruaba，R.O.，Wei，H.，和Tanner，N.A.（2020年）。用比色灯快速分子检测SARS-CoV-2（COVID-19）病毒RNA。内政部：https://doi.org/10.1101/2020.02.26.20028373。医疗保险