材料和试剂

1. 一次性丁腈手套（Fisher Scientific，目录号：19-130-1597）
2. 实验室外套
3. N95面罩（3M，目录号：19-033-524）
4. 32盎司（946毫升）塑料泡沫杯（第一街，型号：SF32）
5. 白色印刷纸字母尺寸（8 1/2“x 11”）（办公室仓库，目录号：841195）
6. 虫卵圆顶（BioQuip）
7. 细尖油漆刷（academy 775圆形尺寸0；Grumbacher，目录号：14173361639）
8. 一次性培养皿（Fisher Scientific，目录号：FB0875713）
9. 移液管尖端2µl、10µl、200µl、1000µl
10. Eppendorf试管（1.5 ml）
11. Eppendorf试管（2毫升）
12. 颗粒杵（Fisher Scientific，目录号：12-141-364）
13. 甲基丙烯酸盐一次性反应杯（Fisher Scientific，目录号：14-955-127）
14. UC混合料3土壤（灰泥砂15.50 cu。英尺，泥炭苔藓11.50立方英尺。ft.，KNO 0.25 lb.，石灰石粉1.50 lb.，磷酸盐1.25 lb.，白云石3.75 lb.，镁0.07 lb.，铁0.13 lb.，锰0.03 lb.，锌0.05 lb.，铜0.11 lb.）(https://agops.ucr.edu/soil-mixing)或类似灰泥砂泥炭苔藓混合土3
15. 豇豆种子（cv CB46）
16. 豇豆蚜虫群落
17. 磷酸二氢钠（NaHPO）（费希尔科学公司，目录号：S369-500）24
18. 甲基乙二醛（Sigma-Aldrich，目录号：M0252-25ML）
19. N-乙酰-L-半胱氨酸（Alfa Aesar，目录号：A15409）
20. 70%高氯酸（马克龙精细化学品，目录号：MK-2766-500）
21. 碳酸钾（CKO）（费希尔科学公司，目录号：P208-500）23
22. 氢氧化钠（NaOH）（费希尔科学公司，目录号：BP359-212）
23. 木炭（Fisher Scientific，目录号：C270C）
24. 酸性宽范围测试色带（费希尔科学公司，目录号：A979）
25. ddHO公司2
26. 冰
27. 100毫米甲基乙二醛（见配方）
28. 100 mM NaHPO缓冲液（pH 7.0）（见配方）24
29. 500 mM N-乙酰-L-半胱氨酸（见配方）
30. 5%高氯酸（见配方）
31. 100万CKO（见配方）23
32. 10毫米氢氧化钠（见配方）

设备

1. 移液管（P2，P20，P200，P1000）
2. 微型离心机（Beckman Coulter，型号：Microfuge 22R离心机）
3. 分光光度计（Beckman Coulter，型号：Du 730生命科学紫外/可见分光光度计）
4. pH计（梅特勒-托利多，型号：MP 220 pH计）
5. 梅特勒104型电子天平
6. 植物和蚜虫生长室或温室保持在28±2°C和16小时光照/8小时黑暗光周期
7. 通风柜

程序

A、种植和植物生长
1. 用UC混合3土填满塑料泡沫杯。每个感染时间点和非感染控制（生物复制）至少使用三种植物。
2. 在每个杯中种植一粒豇豆种子，深度约为2.5厘米。
3. 将植物保持在28±2°C光照16小时/8小时黑暗光周期，并根据需要浇水。
4. 两周后，植物将有完全生长的单叶，并将准备好感染。

B、蚜虫侵扰
1. 用湿的细画笔，从一个殖民地收集无翅（无翅）第四阶段若虫和成年豇豆蚜虫，并将蚜虫放入培养皿中，如图2所示。
注：豇豆蚜虫群体最好保持在幼嫩的植株上，光照时间为16小时28 ±2摄氏度。

图2。收集豇豆蚜虫。 A、画笔旁的成年豇豆蚜虫。B、 9毫米培养皿中的豇豆蚜虫。

2. 把装有蚜虫的盘子移到植物生长室，在那里植物将受到侵染和维护。
3. 用同样的画笔，把大约100只蚜虫移到一片单叶上。
笔记：
a。如图3C所示，确保叶片均匀地布满蚜虫。
b。对于多个时间点的侵扰，侵扰植物，使你能够从所有的时间点，在同一时间收获叶子。例如，在24小时和48小时的时间点，在第1天和第2天在一天中相似的时间出没，在第3天收获叶子。
4. 在一张高约15mm、宽约7mm的纸上开一条缝（图3A），将纸放在豇豆叶周围形成屏障，以阻止蚜虫离开叶片，如图3所示。在控制未感染的植物上放置一个纸屏障。

图3。用来把蚜虫留在一片叶子上的纸屏障。A、纸上的狭缝可以把纸插在叶柄周围。B、有纸障的豇豆植物。C、被豇豆蚜虫均匀寄生的豇豆叶。
注：纸屏障阻止蚜虫离开叶片，同时限制了传统的夹子笼可能造成的机械损伤，传统的夹子笼用于将蚜虫限制在叶子上的特定位置。

5. 将受侵染的植物移入虫穹窿中，并在28±2°C的温度下保持16小时光照/8小时黑暗光周期。
6. 将未受感染的控制植物放在一个不同的虫卵圆顶中，靠近含有蚜虫出没植物的虫穹顶。

C、甲基乙二醛提取液
注意：由于高氯酸和甲基乙二醛有毒，在开始操作前，应采取以下安全措施：
a。穿戴个人防护设备（PPE），包括实验室外套、手套和N95面罩，用于处理高氯酸和甲基乙二醛。
b。在通风柜中执行所有步骤。
c。有一个易于接近的指定废物容器，在引擎盖里面，处理所有与高氯酸接触的东西.

1. 把植物和天平移到通风柜附近，用来称量树叶的重量。
2. 称量1.5毫升的空试管，并记下相应的重量。
3. 移去纸障，剪去感染叶片的叶柄，立即将叶片切成两半，并将半片叶子放入1.5毫升的Eppendorf试管中。
4. 称取试管重量，减去空试管的重量，确定叶片组织重量。
注：半颗豇豆的重量2周龄单叶叶约300毫克。
5. 添加300µl 5%高氯酸，并使用杵使叶组织均匀化。
笔记：
a。使用1:1的镁叶组织和µl体积的5%高氯酸。
b。为避免变化，应快速执行步骤3-5。
6. 在室温下培养15分钟。
7. 在4°C下，在13000 x g下离心分离样品10分钟。
8. 将上清液转移到新的1.5 ml试管中。
9. 将每个样品的上清液平均分为两个1.5 ml的试管，用作技术复制品。
10. 在每根试管中加入10毫克木炭，使上清液脱色，并在室温下培养15分钟。
注意：在15分钟的培养过程中，将试管倒置几次。
11. 加入适量的1 M CK2O3中和溶液。
注：用1 M CK2O3滴定时要小心，并用烷酸宽范围测试带监测样品的pH值，以防止过度中和。对于250µl上清液，大约需要45µl 1 M CK2O3。如果需要额外的滴定，使用小体积的1 M CK2O3。
12. 在4°C下，在13000 x g下离心分离样品10分钟。
注意：如果颗粒漂浮，并且没有卡在管底部，则重复离心。
13. 将每根试管中的上清液转移到一个新的1.5毫升试管中，并保持在冰上，直到准备好测量甲基乙二醛的浓度。

D、标准曲线甲基乙二醛
1. 如表1所述，将试剂加入2ml试管中，制备标准曲线。

表1。用于绘制甲基乙二醛标准曲线的试剂和浓度
管子甲基乙二醛浓度 100毫米甲基乙二醛 100 mM NaH2PO4缓冲液（pH 7.0）
1 0.5毫米 5微升 975微升
2 1毫米 10微升 970微升
3 2毫米 20微升 960微升
4 3毫米 30微升 950微升
5 5毫米 50微升 930微升

笔记：
a。甲基乙二醛具有剧毒性，应在通风柜中使用，并配备适当的个人防护设备。所有步骤，包括用分光光度计生成和读取N-α-乙酰基-S-（1-羟基-2-氧代-丙基-1-基）半胱氨酸的步骤，也应在通风橱内进行，以确保最大安全，并为与甲基乙二醛接触的所有物质配备一个易于接近的指定废物容器。
b。100 mM甲基乙二醛在ddH2O中新鲜制备。
2. 向每个试管中添加20µl 500 mM N-乙酰基-l-半胱氨酸，以开始图1所示的反应。
3. 倒置试管以混合反应并在室温下培养10分钟。
笔记：
a。培养期间应多次倒置试管。
b。如果该方案用于测量不同胁迫或不同植物种下的甲基乙二醛，则应观察样品的反应动力学，以确保10分钟的培养时间足以使反应达到平台。
4. 将样品移入试管中，使用分光光度计通过测量288nm处的吸光度来检测N-α-乙酰基-S-（1-羟基-2-氧代-丙基-1-基）半胱氨酸的形成。
5. 绘制一条标准曲线，如图4所示。

图4。使用分光光度计和表1中的甲基乙二醛浓度和试剂测量288nm处的吸光度而生成的标准曲线

E、甲基乙二醛估算
1. 对于每个样品，使用2ml试管并相应地贴上标签。在每个试管中，添加930µl 100 mM NaH2PO4缓冲液（pH 7.0）。
注：应新鲜制备100 mM NaH2PO4缓冲液（pH 7.0）。
2. 用100 mM NaH2PO4缓冲液向2 ml试管中添加50µl样品。
3. 向每个试管中添加20µl 500 mM N-乙酰基-l-半胱氨酸，以开始图1所示的反应。
注：500 mM N-乙酰-L-半胱氨酸在100 mM NaH2PO4缓冲液（pH 7.0）中新鲜制备。
4. 倒置试管，在室温下混合培养10分钟。
注意：在孵育期间多次倒置试管。
5. 将样品移入试管中，用分光光度计测量288nm处的吸光度，检测N-α-乙酰基-S-（1-羟基-2-氧代-prop-1-基）半胱氨酸的形成。
注：如果样品吸光度不在标准曲线范围内，稀释样品并从步骤E1开始重新进行反应。

数据分析

1. 使用图4所示的甲基乙二醛标准曲线，通过（Abs–intercept）/斜率确定样品中的甲基乙二醛浓度（mM）。288
2. 将所得值乘以20【20为稀释系数（在上述示例中，稀释系数为1000µl总体积/50µl样品）。
注：如果在测量前对样品进行稀释，则应在计算中包括该稀释系数。
3. 通过将甲基乙二醛浓度（mM）乘以提取样品体积（ml）并除以叶片新鲜重量（g），测定叶片样品中甲基乙二醛的总含量（µmol g新鲜重量）。-1
4. 平均两个技术复制品的生物复制品的价值。然后，通过计算不同生物复制品的平均值来确定每个时间点的值。

食谱

1. 100 mM甲基乙二醛（新鲜制备）
向984.6µl ddH2O中添加15.4µl甲基乙二醛
2. 100 mM NaH2PO4缓冲液（pH 7.0）（新鲜配制）
将0.599 g NaH2PO4溶解于50 ml ddH2O中。用10 mM NaOH使pH值达到7
3. 500 mM N-乙酰-L-半胱氨酸（新鲜制备）
将81.5 mg N-乙酰基-L-半胱氨酸溶解在1 ml NaH2PO4缓冲液（pH 7.0）中
4. 5%高氯酸
向23.21 ml ddH2O中添加1.79 ml 70%高氯酸
5. 1米CK2O3
在50 ml ddH2O中溶解6.91 g CK2O3
6. 10毫米氢氧化钠
将0.4 g氢氧化钠颗粒溶解于1000 ml ddH2O中

致谢

该方案改编自Wild等人。（2012）和Borysiuk等人。（2018年）。I.K.集团的这项工作由美国农业部国家食品和农业研究所孵化项目1017522资助。B.S.集团的研究得到波兰国家科学中心2014/14/E/NZ3/00155资助。

相互竞争的利益

作者没有利益冲突或利益冲突。

工具书类

1. Borysiuk，K.，Ostaszewska Bugajska，M.，Vaultier，M.N.，Hasenfratz Sauder，M.P.和Szal，B.（2018年）。铵态营养促进拟南芥甲基乙二醛衍生高级糖基化终产物的形成。前植物科学9:667。
2. 吉尔伯特，R.P.和布兰特，R.B.（1975年）。2,4-二硝基苯肼分光光度法测定甲基乙二醛。《分析化学》47:2418-2422。
3. Hoque，T.S.，Hossain，M.A.，Mostofa，M.G.，Burritt，D.J.，Fujita，M.和Tran，L.S.（2016年）。甲基乙二醛：植物非生物胁迫反应和耐受中的一个新兴信号分子。前植物科学7:1341。
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5. Kaur，C.，Kushwaha，H.R.，Mustafiz，A.，Pareek，A.，Sopory，S.K.和Singla Pareek，S.L.（2015年）。通过对水稻对甲基乙二醛反应的基因表达谱的分析，表明它可能是一种胁迫信号分子。前植物科学6:682。
6. 李志刚、段晓强、闵X、周志华（2017）。甲基乙二醛作为一种新的信号分子，通过调节乙二醛酶系统、抗氧化系统和渗透压细胞，诱导小麦耐盐性。原生质体254（5）：1995-2006。
7. MacWilliams，J.R.，Dingwall，S.，Chesnais，Q.，Sugio，A.和Kaloshian，I.（2020年）。AcDCXR是一种豇豆蚜虫效应剂，可能在改变寄主免疫和生理方面发挥作用。11（605年）。前植物科学
8. Melvin，P.，Bankapalli，K.，D'Silva，P.和Shivaprasad，P.V.（2017年）。DJ-1家族蛋白对甲基乙二醛的脱毒作用为转基因植物提供了双重的非生物和生物胁迫耐受能力。植物分子生物学94（4-5）：381-397。
9. Mostofa，M.G.，Ghosh，A.，Li，Z.G.，Siddiqui，M.N.，Fujita，M.和Tran，L.P.（2018年）。甲基乙二醛-植物非生物胁迫反应的信号分子。自由基生物医学122:96-109。
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11. Wild，R.，Ooi，L.，Srikanth，V.和Munch，G.（2012年）。一种快速、简便、经济可靠的测定毫摩尔浓度甲基乙二醛的方法：N-乙酰基-L-半胱氨酸测定法。肛门生物化学403（9）：2577-2581。
12. Yadav，S.K.，Singla Pareek，S.L.，Ray，M.，Reddy，M.K.和Sopoly，S.K.（2005年）。盐胁迫下植物体内甲基乙二醛的含量依赖于乙二醛酶I和谷胱甘肽。生物化学生物物理研究社337（1）：61-67。