材料和试剂

1. 移液管尖端：0.1-10µl、1-200µl和100-1000µl
2. 1.5 ml微量离心管
3. 50毫升锥形离心管
4. 无菌注射器：1ml和10ml
5. 无菌酸洗玻璃珠（150-212µm）（Sigma-Aldrich，目录号：G1145）
6. 0.22µm尼龙薄膜过滤器（例如，GVS，目录号：FJ13BNPNY002AD01）
7. 联合囊肿PCC 6803液体培养
8. 冰
9. 液氮
10. 无菌米利-Q水
11. HPLC用水（Sigma-Aldrich，目录号900682）
12. 键洗脱C18卡式瓶（安捷伦技术公司，目录号：12102028）
13. 三氟乙酸（三氟乙酸）（Carlo Erba，目录号：411564）
14. DTT（二硫苏糖醇）（Sigma-Aldrich，目录号：D0632）
15. 甲醇HPLC等级（Sigma Adrich，目录号：34860）
16. HPLC用磷酸（85%）（Sigma Adrich，目录号：49685）
17. 磷酸二氢钾（Sigma-Aldrich，目录号：P8281）
18. 无水磷酸二氢钾（Sigma-Aldrich，目录号：543841）
19. 乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：431788）
20. NADPH（β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸2′-磷酸还原四钠盐水合物≥93%（HPLC）（Sigma-Aldrich，目录号：N1630）
21. DTNB（5,5′-二硫代（2-硝基苯甲酸））（Sigma-Aldrich，目录号：D8130）
22. GSSG（L-谷胱甘肽氧化）（Sigma-Aldrich，目录号：G4376）
23. 来自面包酵母（酿酒酵母）的谷胱甘肽还原酶（Sigma-Aldrich，目录号：G3664）
24. 4-乙烯基吡啶（Sigma-Aldrich，目录号：V3204）
25. 还原型L-谷胱甘肽（Sigma-Aldrich，目录号：G4251）
26. L-抗坏血酸（Sigma-Aldrich，目录号：A5960）
27. Neubauer计数室（BrandTM-BlaubrandTM，目录号：10350141）
28. 磷酸盐缓冲液100 mM pH7（见回收物）
29. 磷酸盐缓冲液100 mM pH值7.5+EDTA 5 mM（见配方）

设备

1. 微量加样器
2. 纽鲍尔计数室
3. 冷冻离心机（50毫升锥形管：Thermo ScientificTM，型号：IECTM CL31；1.5毫升试管：Thermo ScientificTM，型号：SorvallTM LegendTM Micro 17R）
4. 涡流混合器（科学工业，型号：Vortex-GENIE 2）
5. 分光光度计（岛津，型号：UV-160A-Vis）
6. 型号：118PH，密尔沃基，型号：118PH
7. HPLC系统（岛津科学仪器）配备：
a、 LC泵（岛津科学仪器，型号：LC-10AT）
b、紫外可见探测器（岛津科学仪器，型号：SPD-10AV）
c、微球c-18柱（安捷伦科技，SS 100 x 4.6 mm，3 m；目录号：CP28076）μ

软件

1. Microsoft Excel（微软公司，可从：https://office.microsoft.com/excel)

程序

A、细胞收获和抗氧化剂提取
1. 将50毫升指数生长培养物（~2.5×107细胞ml-1）放入50 ml锥形离心管中。
2. 通过离心法（9300×g，4°C）收获细胞。
3. 弃去上清液，用无菌抹刀将小球放入新的无菌1.5毫升微型离心管中。
4. 把管子放在冰上。在1 ml 3%TFA中再悬浮细胞，并添加约100μl无菌酸洗玻璃珠（150-212µm）。
5. 通过剧烈混合（漩涡，1分钟）溶解细胞，用液氮冷冻并在冰中解冻。
注意：可以在光学显微镜下观察破裂的细胞，以确保细胞正确破裂。
6. 重复步骤A5至少3次。
7. 离心匀浆（16000×g 15min，4°C）。
8. 将上清液收集在一个新的1.5毫升微型离心管中，并在使用前将其保存在冰上。
9. 按以下顺序应用，激活键洗脱C18柱：
a、 1.5毫升甲醇。
b、 1.0 ml水用于HPLC。
c、 1.0毫升磷酸盐缓冲液100毫米pH 7.00。
丢弃洗涤步骤中的溶液。
10. 使用siringe将500μl助溶剂（步骤A8）通过先前激活的键洗脱C18盒。
11. 丢弃流动液（500μl），通过1.5 ml磷酸盐缓冲液100 mM pH7.00洗脱（洗脱液的pH值约为2）。将滤液收集在一个新的1.5毫升微型离心管中，通过旋转10-20秒使其充分混合。
该滤液用于抗坏血酸和谷胱甘肽的测定。
注：强烈建议在获得过滤。尤其是抗坏血酸的测定需在制剂完成后进行。不建议冷冻样品，因为解冻后可观察到抗氧化剂含量急剧下降。为谷胱甘肽测量，上清液可储存在-80°C。

B、还原抗坏血酸和总抗坏血酸测量
1. 在新的1.5 ml微型离心管中测定还原抗坏血酸混合物：
240 步骤A10中获得的滤液μl
240 μl K2HPO4 100 mM pH 8.5
50µl TFA 10%
15µl水用于HPLC
2. 在新的1.5 ml微型离心管中测定总抗坏血酸混合物：
240 步骤得到的滤液为10μl
240 μl K2HPO4 100 mM pH 8.5
15µl DTT 100 mM（最终浓度：3 mM）
在室温下孵育5分钟，加入50µl TFA 10%停止反应。

C、还原抗坏血酸和总抗坏血酸定量
1. 为了定量降低的抗坏血酸浓度，0.22µm尼龙膜过滤并在配备有C-18柱（100×4.6 mm，3μm）的HPLC中注入10μl。作为流动相，使用KH2PO4 100 mM（pH 3.00）的水溶液进行HPLC（用85%的磷酸调节pH值）为0.35和0。5ml min-1流量。过滤步骤B1到a中获得的溶液
2. 量化在265nm处显示最大值的峰下面积（图1）。
3. 用步骤C1和C2中描述的相同设备和条件，量化总抗坏血酸浓度过滤器并注入10μl步骤B2中获得的第二种溶液。
4. 使用一系列标准L-抗坏血酸稀释液（例如，最终浓度为0.1、0.5和1μM）制备校准曲线，并按照步骤C2（图1）中所述的相同程序测量峰面积。
5. 调整抗坏血酸浓度与峰面积的线性函数，用斜率计算未知样品的浓度，公式如下：

x2包含在公式中，因为细胞在1mL TFA中重新悬浮（步骤A4），但只有一半的上清液通过柱（步骤A9）。包括x3，因为在步骤A10中，一个体积的样品通过色谱柱（500μl），收集三个体积的样品（1.5 ml）。

图1。Asa定量的峰下面积和标准曲线下面积

D、谷胱甘肽含量的测定
谷胱甘肽总量（GSH+GSSG）的定量测定采用酶法。在这篇文章中，用分光光度法定量地研究了用NADPH还原DTNB到5-硫代-2-硝基苯甲酸（TNB）的过程。该反应用于测量GSSG还原为GSH。反应速率与GSH和GSSG浓度成正比。
1. 为了测定总谷胱甘肽，在一个新的1.5毫升微型离心管中加入：
650 µl磷酸盐缓冲液100 mM pH 7.5+EDTA 5 mM
25µl DNTB（5毫克/毫升）（最终浓度0.2毫米）
5µl NADPH（1毫克/100微升）
5微升谷胱甘肽还原酶1:30（0.5 U）
300 步骤A10中获得的滤液微升
注：空白溶液含有除步骤A10中获得的滤液外的所有试剂。
2. 轻轻混合，用分光光度计读取412nm处的吸光度。
3. 为了提取氧化明胶硫磷（GSSG），向步骤A10中获得的300µl滤液中添加3µl乙烯基吡啶（95%），通过涡流轻轻混合并在室温下培养25 min。
4. 离心（16000×g 10min，4°C）并将试管放在冰上
5. 在新的1.5 ml微型离心管中添加
365µl磷酸盐缓冲液100 mM pH 7.5+EDTA 5 mM。
25µl DNTB（5毫克/毫升）。
5µl NADPH（1毫克/100微升）
5微升谷胱甘肽还原酶1:30（0.5 U）
100 µl步骤D4中获得的上清液
6. 轻轻搅拌，读取412nm处的吸光度。
7. 谷胱甘肽水平的量化是基于谷胱甘肽（GSSG）的氧化形式。为了量化谷胱甘肽水平，用0-100µM标准L-谷胱甘肽氧化溶液制备校准曲线。

注：抗氧化剂的含量可以表示为每毫克新鲜或干重或作为每细胞pmol（抗坏血酸）和nmol/cell（谷胱甘肽）。抗氧剂的含量与用a纽鲍尔计数室。

食谱

1磷酸盐缓冲液1磷酸盐缓冲液100毫米pH值7
在100 ml无菌Mili-Q水中添加1.071g K2HPO4和0.524g KH2PO4
2. 磷酸盐缓冲液100 mM pH 7.5+EDTA 5 mM
溶液1：将0.681 g KH2PO4和0.093 g EDTA混合在50 ml无菌Mili-Q水中
溶液2：将0.871g K2HPO4和0.093g EDTA混合在50ml无菌Mili-Q水中
通过添加溶液1来调整溶液2的pH值，直到pH值达到7.5

致谢

这项研究由阿根廷国家促进发展署（Agencia Nacional de Promoción Cient y Técnica Argentina）（PICT 1956和PICT 0173）向M.V.Martin和阿根廷国家促进发展署（Agencia Nacional de Promoción Cient y Técnica Argentina）（PICT-2017-0201）向G.C.Pagnusat提供了资助。
本方案改编自先前发表的研究（Griffith，1980；Bartoli等人，2006；Narainsamy等人，2016）。

相互竞争的利益

作者声明没有竞争性的经济利益。

工具书类

1. Aguilera，A.，Berdun，F.，Bartoli，C.，Steelheart，C.，Alegre，M.，Salerno，G.，Pagnusat，G.和Martin，M.V.（2019年）。热胁迫诱导光合原核生物的铁下垂。生物XIV:828293。
2. Bartoli，C.G.，Yu，J.，Gómez，F.，Fernández，L.，McIntosh，L.和Foyer，C.H.（2006年）。拟南芥叶片抗坏血酸合成与积累调控中光与呼吸的相互关系。《出口管理条例》57（8）：1621-1631。
3. Distéfano，A.M.，Martin，M.V.，Córdoba，J.P.，Bellido，A.M.，D'Ippólito，S.，Colman，S.L.，Soto，D.，Roldán，J.A.，Bartoli，C.G.，Zabaleta，E.J.，Fiol，D.F.，Stockwell，B.R.，Dixon，S.J.和Pagnussat，G.C.（2017年）。热胁迫诱导植物铁下垂样细胞死亡。细胞生物学杂志216（2）：463-476。
4. 格里菲斯，O.W.（1980年）。用谷胱甘肽还原酶和2-乙烯基吡啶测定谷胱甘肽和谷胱甘肽二硫化物。肛生物化学106（1）：207-212。
5. Narainsamy，K.，Farci，S.，Braun，E.，Junot，C.，Cassier Chauvat，C.和Chauvat，F.（2016年）。蓝藻氧化应激解毒和信号转导：谷胱甘肽合成的关键途径支持麦角碱和眼酸盐的产生。分子微生物学100（1）：15-24。