材料和试剂
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1.塑料培养皿，分别为60毫米和90毫米。品牌并不重要
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2.血清瓶，250和500毫升（品牌并不重要）
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注意：确保瓶子可以承受至少12 1 °C的温度。
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3.方形盖玻片，22 x 22 mm（Corning，目录号： 2870-25）
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4. 25.4 x 76.2 mm的单凹显微镜载玻片（Sail Brand，目录号：货号7101）
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5.一次性使用的无菌注射器过滤器，直径为0.22 µm （Bioland ，目录号：PT13-022）
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6. 230目碳薄膜，铜网格（中京可依，目录号：BZ110223b）
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7.枯草芽孢杆菌NCIB 3610 （购于中国通用微生物培养物保藏中心，目录号：1.3358）
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8.胰蛋白Try ，Bacto （BD Difco ，目录号：211705 ）
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9.酵母提取物，LD，Bacto（BD Difco ，目录号：210933）
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10. Bacto Agar（BD Difco ，目录号214010）
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11.氯化钠（北京化工，目录号：A 1060005）
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12. LB琼脂，粉末（Solarbio ，目录号：L1015，储存：2-8°C）
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13. SH-PEG修饰的金纳米棒40 x 84 nm（NanoSeedz ，目录号：PEG-40-650-50）
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14. COOH改性的聚苯乙烯微球，0.5 µm（Dae技术，目录号：PSC-00500）
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15.金纳米球90 nm和120 nm
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注意：我们根据参考文献（Zhou等，2011）中的方法合成了金纳米球。
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16. Milli-Q H 2 O（来自Millipore Sigma的Milli-Q水净化系统）
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17.软LB琼脂为蜂拥（小号EE食谱）
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18. LB肉汤，溶液（小号EE食谱）
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设备
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微移液管，5，10，100，200和1 ，000 μ升（Eppendorf）中
高压灭菌器（从阿里巴巴购买）（品牌并不重要）
微波炉（美的）（b兰特不是关键的）
4 ° C和-80 ° C冰箱
摇床（Ĵ iecheng ê xperimental甲pparatus，型号：TS-100B ）
恒温恒湿培养箱（宜恒仪器，型号：LHS-80HC-ǁ ）
紫外可见分光光度计（岛津制作所Ç orpor通货膨胀，型号：UV1800 ）
手紫外线灯检查，365纳米（于华仪器，型号：ZF-7）（品牌不是关键的）
高频振动雾化器，5 W，5 V（从Alibaba，SKG购买，目录号：37288557693 ）
倒置显微镜，配备100 W卤素钨灯，多功能干式聚光镜和偏光镜/检偏镜组合（尼康，型号：Ellipse Ti -U ）
长工作距离物镜，CFI TU平面FLUOR BD 20 x ，NA / WD 0.45 / 4.5 mm （尼康）
20 x物镜，Plan Fluor 20 x ，NA / WD 0.5 / 2.1 mm（Nikon）
立式金相显微镜，配备100 W卤素钨灯和n E p i照明器，其中包含正交偏振器/分析仪模块（尼康，型号：LV100D ）
高精度压电Z载物台（PZ-2150）
彩色CMOS相机（Olympus ，型号：D P74）
带有100 W卤素钨灯和暗场聚光镜的立式暗场显微镜（尼康，型号：8 0i）
反相显微镜（奥林巴斯，型号：C KX53）

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软件
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ImageJ（一种用Java编写的开源软件，https：//imagej.nih.gov/ij/）
Matlab（The MathWorks，Inc.，https://www.mathworks.com/）
多粒子跟踪软件（在MATLAB中自行开发，Github ：https：//github.com/threebullets/ParDet）
Origin 8 （OriginLab ，https : //www.originlab.com/）
PIVlab-粒子图像测速（PIV）工具（William Thielicke，2014）（由William Thielicke开发的基于GUI的工具，https: //pivlab.blogspot.com/ ）
SPSS（IBM，https://www.ibm.com/analytics/spss-statistics-software / ）

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程序
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成群的细菌培养
根据食谱准备LB肉汤，Solarbio LB琼脂和软LB琼脂培养液。首先，将称量的试剂加入300 ml l Milli-Q H 2 O中，直至完全溶解。之后，将溶解的培养液放入121°C的高压釜中20分钟。接下来将它们放入微波炉中直至沸腾。最后将它们放在4°C的冰箱中以备后用。
注意：将玻璃瓶放入高压釜中时，为了安全起见，请确保瓶盖不要太紧。另外，即使在冰箱中，预备培养基也具有保存期限。如果发现它不能像以前一样保持质量，请停止使用它。
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准备用于细菌繁殖的软琼脂平板。首先在微波炉中将LB琼脂软溶液煮至100°C。在冷却至60℃后，添加3米升溶液，以60毫米P ETRI菜肴。在超净工作台中继续冷却，直到液体凝固成凝胶状态。
用Solarbio LB琼脂溶液准备固体琼脂平板，以激活和传播细菌菌株。步骤类似于步骤A 2。
注意：琼脂表面的平整度，硬度和湿度对细菌菌落的生长和运动有很大的影响。另外，琼脂板的厚度对于细菌培养至关重要。对于LB固体琼脂板，厚度通常是P etri皿的2/3高度。对于软琼脂板，我们需要确保软琼脂板的厚度适合物镜的工作距离。另外，琼脂的透明程度是影响显微镜观察的重要因素。
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为了使冷冻的细菌菌株恢复活力，将购买的枯草芽孢杆菌3 610粉末溶解在真空玻璃瓶中的适量LB肉汤溶液中，然后在37℃，200 rpm下放置到细菌培养振荡器中过夜。然后使用转移针通过划线方法在Solarbio LB琼脂上孵育下一代。
为了获得蜂拥细菌菌落，5 μ升细菌过夜培养物在软琼脂平板的中央接种。然后将板放置在层流工作台空气干燥5 - 8分钟。在这之后，将其存储在培养箱中在30℃和至少90 ％rh的湿度约2 - 4小时。
注意：确保培养箱中的湿度大于90％rh。因为在没有足够湿度的环境中，细菌菌落不会表现出集体的蜂群行为。
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制备AuNR解决方案
要检查颗粒大小和形状的均匀性，请测量SH-PEG AuNRs的UV-Vis光谱，以表征等离子体共振吸收峰的位置，并获取SH-PEG AuNRs的透射电子显微镜图像。UV光谱中存在两个峰。一个位于650 nm附近，另一个位于522 nm附近。在电子显微镜下，AuNRs应为棒状且尺寸均匀，平均尺寸为40×84 nm。
注意：为了制备AuNRs样品TEM检查，吸管5 μ升未稀释的AuNRs （145.36微克/米升），然后将其上的铜网格。在室温下自然蒸发。重复2或3次。
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稀释SH-PEG AuNR溶液（145.36微克/米升）的F或用20倍的Milli-Q H 2 ö 。

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微喷涂技术
将AuNRs示踪剂放到成群的细菌液的上表面。首先在高频振动雾化器上添加50 µl稀释的AuNRs溶液。
以平行于蜂群表面的方向喷出雾化的AuNRs气雾剂。
注意：应调整喷洒方向和到菌落表面的距离，以免损坏集体移动的细菌。通常，将自动化器放置在P etri盘上方约8厘米处。喷雾的方向优选平行于菌落表面或略微倾斜，使得气雾剂可以自然地落在菌落表面上。避免垂直向菌落喷洒。
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影像学
使用相衬显微镜在20 x或40 x物镜下检查细菌菌落的运动状态。
成群的细菌菌落面积将随着细菌数量的逐渐增加而不断扩大。在滞后阶段，细菌细胞保持静止。在大约2小时的滞后时间后，我们可以观察到菌落边缘附近的细菌开始以漩涡和喷射的形式活跃地聚集。一旦细菌开始蜂拥而至，请立即将标本放入倒置显微镜（图2A ）。
不E：不需要特殊的成像菜肴。
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调整暗场聚光镜的位置和20个物镜的工作距离（图2B ），直到红色AuNRs和棕色细菌可以同时成像。
在暗场模式下，使用RGB通道中的DP74彩色CMOS相机（图2C ）以60 fps的帧速率捕获40 s的图像。需要进行三个平行实验。
注意：环境温度和湿度（30 成像过程中应保持与培养箱中相同的温度（°C，90％rh）。另外，显微镜的光源强度不应太高，以免对样品造成光损伤。对细胞的破坏将阻止细菌的集体运动。
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图2.实验设置或成像。A.牛逼，他倒尼康Eclipse中的Ti -U显微镜。将样品置于暗场空气冷凝器下。B. 20 x长工作距离物镜。C.奥林巴斯DP74彩色相机。
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定位AuNRs的z轴位置
测量细菌层和之间的距离AuNRs吨的交叉极化模式下层他直立金相显微镜。
分别捕获细菌层和AuNRs层的焦平面的延时图像。记录其z轴位置。
通过调整压电Z定位平台，记录从细菌层到AuNRs层的光学切片3D图像。压电-Z定位台的z轴分辨率为0.01 μ米。通常选择的z增量步长约为0.2 µm。
在至少三个不同的菌落中重复实验。
注意：在“透明方法” -3部分中可以找到更详细的过程。交叉极化显微镜用于测量原始纸张的AuNRs层和细菌层之间的距离。
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其他对照实验
要获得群体细菌上层流体中90和120 nm金纳米球的运动，请使用与AuNRs粒子相同的示踪和成像方法。
若要获得PS球在成群细菌的上层流体上的运动，请使用与AuNRs粒子相同的跟踪和成像方法。
要获得的运动AuNRs在过滤哪些细菌出悬浮液，第一过滤从培养的细菌悬浮液将细胞用0.22微米直径的注射器过滤器。然后将50倍稀释的AuNRs溶液移液到单个凹面玻璃载玻片上。盖好载玻片后，将标本移至配备20倍尼康物镜的立式暗场显微镜。然后使用DP74彩色CMOS相机获取图像。
要在非群体细菌菌落中获得AuNRs的运动而不会产生群体，请使用紫外线灯照射群体细菌菌落至少10 h，直到集体运动完全停止。然后按照步骤C中所述的步骤喷涂AuNRs气雾剂。在反射暗场模式下，在尼康LV 100D显微镜下观察菌落。

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数据分析
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PIV分析
执行细菌上蜂拥的流场分析PIVl一个b根据以下步骤的软件。的工作流程也被示出在图3 A（AF ）中的细节。
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在MATLAB中运行PIVlabGui.m 。
加载和导入图像。通常，除非有其他要求，否则请选择1-2、2-3、3-4排序样式。
通过分析设置> PIV设置>通过1 >通过2…4设置分析参数。将PIV算法设置为FFT窗口。定义询问区域的大小和步长（以像素为单位）。
注意：如有必要，可使用选项进行简单的图像预处理，例如在“排除”中选择ROI，以及通过“启用CLAHE”，“启用高通”和其他降噪滤镜来降低噪声。
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通过分析>分析运行PIV分析！>分析当前框架>分析所有框架。
通过后期处理>向量验证来优化速度限制。
通过图>派生参数/修改数据来绘制PIV图像。
通过“文件”>“保存”导出txt文件，视频和图像图3B 。

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图3.集体蜂群细菌流场的PIV分析。答：执行PIV分析时的一般工作流程。（a）导入图像。（b）设置PIV询问区域和通过次数。（c）对连续帧进行PIV分析。（d）手动细化矢量场散点图中的矢量极限。（e）按需提取参数。（f）修改绘图外观。B.由速度矢量针覆盖的涡度场的典型图像。
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粒子追踪
ImageJ的单粒子跟踪（图4A ）
通过文件>导入>图像序列加载图像序列。通过ImageJ>插件>粒子跟踪器经典>粒子跟踪器打开粒子跟踪插件。设置的粒子检测参数，包括粒子半径，截止，链路范围和位移图4B（a）中，等可视化和选择的轨迹。图4B（b）中。保存表和图像图4B（cd）。
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注意：使用ImageJ时，由于后台单元格的干扰，仅可以轻松跟踪某些示踪剂。
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图4.单粒子跟踪分析。A. ImageJ的工作面板。B.图（a）-（b）展示了使用“粒子跟踪器”插件时的工作流程。（c）结果显示了每帧AuNR的坐标。（d）面板显示AuNRs轨迹在原始图像上的覆盖。比例尺为5μm 。
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多粒子跟踪
为了获得连续帧中多个粒子的轨迹，我们在MATLAB中开发了一个软件。主要过程包括图像预处理，基于局部强度阈值的粒子识别和帧间跟踪。如软件中所示，这些代码和详细说明在GitHub中共享。
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注意：在多粒子跟踪软件中，设置了局部动态强度阈值而不是全局阈值来识别来自细胞背景的粒子。
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的示踪剂traje扩散分析ctories
均方根位移（MSD）
计算不同滞后时间的每个轨迹的均方位移。然后计算视野中多个轨迹的集合平均MSD 。以对数-对数刻度绘制。另请参见原始纸的图3C。
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运动方向和转角的分布
任意将x轴的右侧设为正方向。将运动方向定义为每个步相对于x轴的方向，将转角定义为连续步之间的方向。使用视场中所有轨迹的计算数据，以Origin的半对数刻度绘制概率分布函数（PDF）。另请参见原纸的图3A和3B。
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规范位移的PDF
计算的位移Δ X在不同的滞后时间Δ吨。而比较不同的位移的PDF Δ吨，Δ X应被归一化√ 2DΔt其中d是从MSD曲线的拟合计算的扩散系数。以半对数比例绘制PDF。另请参见原始纸的图3D。
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示踪粒子角度变化与速度的相关性分析
计算粒子随时间的瞬时速度。利用Pearson相关函数对SPSS中示踪剂随时间变化的角度变化（转角）和速度进行相关分析。p值小于0.05，置信度为95％。参见图小号原纸的3E和3F。
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切片窗口法计算局部MSD指数
根据所选窗口大小将轨迹切成不同的长度。然后计算每个轨迹段的MSD指数。请参见原始纸图3H中的箱线图。
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Lévy步行模型的拟合
通过从Turchin （1998）修改的“角度方法”将长轨迹划分为“飞行”，该飞行过程由多个步骤组成。接下来，将“飞行”的PDF拟合到pow-law函数，以通过最大似然估计方法获得指数μ 。然后通过Akaike权重证明幂律模型优于指数模型（Edwards等，2007）。详细的分析和解释请参见图4和透明方法 - “ 6.莱维行走模式和功法配合”原皮（冯等人2019年）。
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菜谱
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柔软的LB琼脂群
10克/升胰蛋白,, Bacto
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5 g / L酵母提取物，LD，Bacto
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5克/升氯化钠
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0.5％巴克琼脂
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LB肉汤，溶液
10克/升胰蛋白,, Bacto
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5 g / L酵母提取物，LD，Bacto
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5克/升氯化钠
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致谢
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这项研究最初发表在杂志iScience ：丰，J.，张，Z.，温家宝，X.，薛，J。和他，Y.（2019）。单个纳米粒子跟踪揭示了细菌群上部流体iScience 22，123-132中有效的长距离暗流运输。这项工作得到了中国国家自然科学基金的资助，授权号为21425519。该方案的作者对原始研究论文的所有贡献者表示感谢。
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利益争夺
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作者没有竞争利益。
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参考文献
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