材料和试剂

1.过滤的微量移液器吸头（各种容量）（例如，Clearline ，目录号：713115、713117和713118）

2.血清移液管（不同体积）（例如，隼，产品目录号：357543和357551）

3. 1.5 /2.0毫升微管（例如，Sarstedt的，产品目录号：72.692.005和72.693.005）

4. 15/50毫升锥形离心管（例如，隼，产品目录号：352096和352070）

5.注射器（例如，BD，目录号：300865）

6. 0.20 μ米注射器过滤器（例如，Sarstedt的，目录号：83.1826.001）

7. Stericup过滤器单元，Millipore Express PLUS高流速膜（Millipore，目录号：S2GPU01RE）

8.组织培养板，24 -井，平底（例如，隼，目录号：353047）

9.的单细胞悬浮液结核分枝杆菌（Mtb的）根据公开的方法制备的小号（通过菌落形成单位定量来确定细菌浓度）

注意：Mtb H37Rv（塞巴斯蒂安·加涅克斯的菌种）已用于我们已发表的研究中（Arbués等，2020 ）。也可以使用不同的菌株或分枝杆菌种。

10.按照标准规程（Vogel等人，2018）从全血或血沉棕黄层中分离出的人外周血单核细胞（PBMC）（当通过锥虫蓝排除法评估生存力≥95 ％时，可以使用存储在液氮中的样品））

11. RPMI-1640培养基，其含有L-谷氨酰胺和碳酸氢钠（例如，Sigma-Aldrich公司，目录号：R8758）

12.胎牛血清（FBS）（例如，Gibco，目录号：10270），热灭活的

13. Benzonase，大肠杆菌重组体（BioVision ，目录号：7680）

14.人血清原液，AB型（PAN Biotech，目录号：P40-2701），经热灭活和过滤（Stericup ）

15.台盼蓝溶液（例如，Sigma-Aldrich公司，目录号：T8154）

16. PureCol牛I型胶原蛋白溶液，3 mg / ml（Advanced BioMatrix ，目录号：5005）

17.来自人血浆的纤连蛋白，0.1％溶液（Sigma-Aldrich，目录号：F0895）

18. Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（PBS）10 x （Sigma-Aldrich，目录号：D1408）

19.用于细胞培养的1 N氢氧化钠溶液（NaOH）（Sigma-Aldrich，目录号：S2770）

20. IV型胶原酶，无菌过滤（Sigma-Aldrich，目录号：C1889）

21.二水氯化钙（CaCl 2 ·2H 2 O）（PanReac AppliChem，目录号：A4689）

22.的Triton X-100（例如，Sigma-Aldrich公司，目录号：T8787）

23.密理博双重蒸馏水，无菌

24.解冻介质（请参见食谱）

25.静息介质（请参阅食谱）

26.完全培养基（请参见食谱）

27.细胞外基质（ECM）解决方案（请参阅食谱）

28.胶原酶解决方案（请参阅食谱）

29. 0.1％的Triton X-100（请参阅食谱）

设备

II级生物安全柜
5％CO 2培养箱，设置在37°C
细胞计数室
倒置明场/相衬显微镜（例如，Leica DM IL LED）
注意：我们经常使用一个20 X目标计数PBMC和10 X目标并监控肉芽肿形成（步骤A，小号TEPS 1F和2i，分别地）

离心机15/50毫升锥形管中，最大RCF ≥ 3000 X克（例如，Beckman Coulter公司的Allegra X-15R）
微量1.5 /2.0毫升微管，最大RCF ≥ 6000 X克（例如，的Eppendorf 5424R）

程序

注意：此协议是为感染强毒的Mtb而开发的；因此，所有涉及处理Mtb的工作都应在II级生物安全柜下的3级生物安全实验室中进行。但是，我们的协议还已经在标准的生物安全2级实验室中成功地应用于1类（牛分枝杆菌BCG）或2类（Mtb H37Ra）生物。

一代结核杆菌诱导3D肉芽肿
感染前先静息PBMC
解冻一瓶或两瓶PBMC，以产生预期用于实验设计的足够量的细胞（2.5 x 10 6 PBMC /孔），然后将其转移到锥形离心管中。
加入10毫升（先滴加3-5毫升）预热的（37°C ）解冻培养基，然后轻轻混合，以洗涤细胞。离心机为在400 5分钟X克并弃去，通过移液上清液。
重复此洗涤步骤。
将细胞沉淀重悬于5 ml预热（37°C ）的静止培养基中。
将盖松开的试管放入37 °C的5％CO 2培养箱中，并使细胞静置至少6 h，直至过夜。
计数休息的PBMC，并通过台盼蓝染料排除法评估细胞活力。
注意：细胞活力应≥95％。较低的细胞活力可导致Mtb独立的细胞聚集体形成。

将所需量的PBMC转移到锥形离心管中。通过沉淀细胞离心以400 X克为5分钟，并通过移液弃去上清液。
在完全培养基中以10 7个细胞/ ml重悬PBMC 。放开管盖，将细胞放入37 °C的5％CO 2培养箱中，直至使用。
PBMC的Mtb感染和包埋（图1A）
根据配方4准备所需体积的细胞外基质（ECM）解决方案，但1 N NaOH除外。保持在4 °C /冰上，直到使用。
用达到目标感染复数（MOI）所需的Mtb单细胞悬液体积感染PBMC 。通过上下吸打10-15次充分混合，以获得PBMC和Mtb的均匀悬浮液。
注意：我们的实验通常使用标准MOI为1：200（Mtb：PBMC ）进行。但是，当使用新一批单细胞悬液（或不同的分枝杆菌菌株或物种）时，可能需要调整MOI。最佳MOI可以通过以剂量反应设置（使用各种供体和未感染的PBMC作为对照）监测3D肉芽肿的形成来通过实验评估。

分发250微升每孔的Mtb的感染的在24孔板中的PBMC。
向ECM溶液中添加所需量的NaOH（根据配方4），并通过上下吹打10-15次使其缓慢而彻底地混合。
注意：添加NaOH后，将ECM溶液彻底均质化对于达到正确的pH值以及因此正确设置基质至关重要。如果T他的NaOH均匀地结合到ECM溶液，其具有的PBMC混合物（小号TEP A2 E）应导致浅，淡黄的粉红色。但是，如果未正确混合ECM组分，则由于pH值的变化，可能会在整个孔中观察到从深粉红色到浅黄色的颜色梯度。pH值太碱性（深粉红色）不利于细胞和细菌生存，并会阻止肉芽肿样结构的形成。

加入250微升在先前步骤中制备的ECM溶液（1：1分的比例，体积/体积）到每个孔中，并通过上下抽吸3-4次混合。
将板放入37 °C的5％CO 2培养箱中，并使ECM放置45分钟。
补足一套ECM 500微升每孔完全培养基。
注意：如果不使用整块板，请用无菌PBS或水填充周围的空孔，以最大程度地减少蒸发。

将板放回5％CO 2接种器中。在37 °C下孵育所需的时间。
肉芽肿的形成可以使用倒置的明场/相差显微镜进行监测。
注意：就肉芽肿的形成而言，在数量和大小上都可能观察到明显的供体间差异。在其他体外肉芽肿模型中也描述了这种现象（Agrawal等，2016）。

图1. 3D体外肉芽肿模型的示意图。A. Mtb感染的PBMC嵌入细胞外基质（ECM）中。7-8天后可观察到肉芽肿样结构的形成。B. PBMC可以通过胶原酶消化从ECM中释放出来。C.随后用Triton X-100处理可回收Mtb 。

从ECM释放PBMC（图1B）
在选定的时间点，根据食谱5准备所需体积的胶原酶（1 mg / ml）。
从要处理的孔中除去上清液。如果计划分析可溶性因子，则丢弃或过滤除菌并在-80 °C下储存。
添加250微升每孔的胶原酶和孵育在板在5％CO 2在培养箱中37 ℃下进行40-45分钟。每15分钟通过上下吹打混合液体部分，以促进ECM的消化。
ECM完全液化后，将孔中的内容物转移到微管中。
通过离心沉淀细胞，在400 X克为5分钟，并通过移液弃去上清液。
然后，释放的细胞可用于随后回收Mtb （根据下面的步骤C），或用于宿主细胞参数的分析，例如通过流式细胞术（遵循标准染色步骤）。

检索Mtb （图1C）
重悬在先前secti获得的细胞沉淀在200微升0.1％的Triton X-100的涡旋几秒钟或上下吹打几次。
在室温下孵育20分钟以裂解宿主细胞。
要检索的Mtb 5分钟沉淀，离心在6 ，000 X克并丢弃，通过移液上清液。
如数据分析部分所述，可以从回收的细菌中获得各种Mtb读数。

数据分析

有关数据处理和分析的详细信息可以在我们的原始研究文章中找到（Arbues等，2020）。简而言之，分泌的细胞因子可以通过ELISA或从0.2 µm过滤的上清液中进行多重磁珠阵列测定。染色和固定释放的PBMC后，可通过流式细胞术表征宿主细胞群。从主机和RNA分析的Mtb可以按照标准程序随后TRI进行-reagent ®治疗。可以通过在补充了10％OADC（0.05％油酸，5％牛白蛋白V，2％葡萄糖和0.004％过氧化氢酶）的Middlebrook 7H11琼脂上测定菌落形成单位（CFU）来量化Mtb负载。重要的是，双重金胺/尼罗红染色可以分别用作回收细菌的代谢活性或休眠状态的替代物。通常，我们至少使用三个独立的供体来生成每个实验读数。

菜谱

解冻介质
RPMI补充有10％FBS和12.5 U / ml苯并酶

静息介质
RPMI补充了10％FBS

完全中等
RPMI补充了20％的人血清

细胞外基质（ECM）解决方案
每毫升配方：
950微升的胶原溶液（3毫克/毫升）
4微升人纤连蛋白（1毫克/毫升）
50微升PBS的10 X
10微升的1N NaOH
计算的该特定实验所需ECM溶液的体积被执行以：将要被嵌入井的数量+ ≥2口额外的井X 250微升
在实验当天，将胶原蛋白，纤连蛋白和10x PBS混合，并将混合物保持在4 °C /冰上，直到使用
在使用前，立即添加NaOH，并通过上下吹打缓慢而彻底地混合。溶液的最终pH值应约为7.0
胶原酶溶液
胶原酶缓冲液：补充有0.42 mM CaCl 2的PBS
准备0.5 M CaCl 2溶液（将1.47 g CaCl 2 ·2H 2 O溶于20 ml Milli-Q水中）并灭菌（高压釜或过滤器）
为了制备50ml的缓冲液，加入42微升的0.5M的CaCl 2至49.958毫升PBS的
胶原酶原液（10 mg / ml）
在5 ml胶原酶缓冲液中溶解50 mg无菌过滤的胶原酶
制备方便体积的等分试样以防止反复冻融循环和商店- 20 °C（几个月稳定）
胶原酶工作溶液（1 mg / ml）
计算出所需的稀释胶原酶的体积：将被处理+ 1井的数量以及额外X 250微升
在实验当天，将胶原酶原液在胶原酶缓冲液中稀释十倍以制备工作溶液（在37 °C的温度下稳定至少5 h）
0.1％的Triton X-100
通过将5 ml Triton X-100与45 ml Milli-Q水混合来制备10％的原液
过滤器对原液进行灭菌（在室温下稳定几个月）
为了制备50毫升工作溶液，加入500微升的库存的10％至49.5毫升无菌Milli-Q水（在室温下稳定数月）

致谢

我们要感谢Christian Schindler的统计支持和用于广义线性混合效应模型的R代码的脚本编写。根据与瑞士热带和公共卫生研究所的研究协议，DP从诺华公司获得了用于实施该模型的资金。该协议用于生成发表在数据Arbu é小号等。（2020年），并改编自Kapoor等人。（2013）。

利益争夺

DP从诺华（Novartis AG）获得了实施该模型的资金。资助者启动了研究设计，但在数据收集和分析中没有任何作用。MK是诺华的全职员工。

伦理

人PBMC是从Interregionale Blutspende SKR AG（瑞士伯尔尼）获得的血沉棕黄层中分离出来的。所有捐助者均提供了知情同意书，其中包括有关将血液制品用于研究目的的信息。

参考文献

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