[背景]自然界中的大多数细菌并非独立存在，而是存在于复杂的多物种生物膜群落中（López et al.，2010）。细菌之间存在着大量的物理和营养相互作用，有助于生物膜的生长和存活。细菌素的产生和分泌到细胞外空间，为生产商提供了一种独特的生态优势，可以与同一生态位中的其他细菌竞争（Donia和Fischbach，2015）。因此，细菌严格调控细菌素的表达，以培养生物膜内物种的生存。
致龋菌变形链球菌存在于牙菌斑中，菌斑是牙齿表面形成的生物膜群落（Kolenbrander等人，2010年）。在正常情况下，牙菌斑保持相对稳定（微生物体内平衡），有助于牙齿健康。然而，当地环境条件的变化会破坏这种自然平衡，导致生态压力，从而导致疾病。S、变形链球菌是细菌素（简称mutacins）最高产的生产商之一，细菌素的产生被认为是变形链球菌在口腔生物膜中定植和建立的重要因素（Merritt and Qi，2012）。在我们以前的出版物中，我们强调了变形链球菌细菌素在口腔链球菌之间拮抗作用中的作用（Dufour和Lévesque，2013；Dufour等人，2020）。我们还表明，DNA摄取和细菌素生成受严格调节的群体感应系统控制，这表明在遗传能力状态下，细菌素分泌可促进DNA交换（Perry等人，2009a和2009b；Dufour等人，2011）。
大多数变形链球菌都编码细菌素。通过基因组DNA序列的筛选，可以很容易地在电子显微镜下鉴定细菌素。例如，免费提供的软件BAGEL4(http://bagel4.molgenrug.nl)可用于细菌素基因的检测。它还分析了细菌基因组上可能编码转运、免疫和调节蛋白的基因。然而，在silico中确定的假定细菌素位点不一定代表功能性细菌素的产生。因此，为了研究细菌素，必须提取和纯化细菌素。变形链球菌产生的细菌素只有少数得到纯化和鉴定（Nicolas等人，2007年）。这可能是由于与生产和提取这些细胞外肽相关的许多挑战。从一个提取液到另一个提取液的肽回收率也经常观察到高可变性。由于细菌素的体积生产取决于总的生物量生产，因此也建议使用营养丰富的培养基（如动物组织提取物）来高效生产。在该方案中，我们开发了一种从浸没培养物中提取的方法，该方法使用添加了矿物盐和酵母抽提物的商业培养基（Dufour等人，2020年）。本研究小组已成功应用此方法从无龋及龋齿活跃者的牙菌斑生物膜中分离出具有生物活性的细菌素肽。

材料和试剂

1. 带通风帽的无菌13毫升培养管（任何类型，如Sarstedt，目录号：
62.515.006）
2. 螺旋盖管50 ml（任何类型，如Sarstedt，目录号：62.547.205）
3. 一次性玻璃巴斯德吸管22.9 cm（9“）（例如，VWR，目录号：89061-526）
4. 一次性注射器，50毫升（任何类型，如赛默飞世尔科技公司、费舍布兰德公司、产品目录号：14-823-43）
5. Acrodisc®注射器过滤器，带Supor®膜0.2µm，25 mm（Pall Corporation，目录号：4506）
6. 带透明盖的培养皿100 x 15 mm（任何类型，如Thermo Fisher Scientific，Fisherbrand，目录号：FB0875712）
7. 铝箔（任何产品）
8. 细菌素产生实验室（如链球菌、乳球菌、肠球菌）
9. 细菌靶菌株：黄色微球菌（如ATCC 4698菌株）
10. 脱水Todd Hewitt肉汤（Thermo Fisher Scientific，BD Difco，目录号：DF049217-6）
11. 脱水哥伦比亚肉汤（Thermo Fisher Scientific，BD Difco，目录号：DF0944-170）
12. 酵母提取物（BioShop Life Science Products，目录号：YEX401）
13. 琼脂（BioShop生命科学产品，目录号：AGR001）
14. NaH2PO4（例如，Millipore Sigma，目录号：S8282）
15. Na2HPO4（例如，Millipore Sigma，目录号：S9763）
16. 硫酸镁（例如，密理孔西格玛，目录号：M7506）
17. 硫酸亚铁（例如，密理孔西格玛，目录号：F7002）
18. CaCO3（例如，Millipore Sigma，Sigma-Aldrich，目录号：C4830）
19. 氯仿ACS试剂级（Caledon实验室化学品，目录号：3000-1-40）
20. 乙腈（用于HPLC）（Thermo Fisher Scientific，Fisher Chemical，目录号：A998）
21. 三氟乙酸（肽和蛋白质分析/认证）（Thermo Fisher Scientific，Fisher Chemical，目录号：O4902）
22. 甲醇（用于高效液相色谱法）（赛默飞世尔科技公司，费希尔化学公司，目录号：A452SK-4）
23. 盐酸溶液，6 N ACS（认证）（Thermo Fisher Scientific，Fisher Chemical，目录号：SA56-4）
24. Milli-Q水或任何过滤过的超纯水
25. 肉汤（500毫升）（见配方）
26. BAC半固体琼脂培养基（2升）（见配方）
27. Columbia-CaCO3琼脂平板（500毫升）（见配方）
28. 哥伦比亚软琼脂（500毫升）（见配方）
29. ACN-TFA溶剂（500毫升）（见配方）
30. 甲醇：水，95:5 v/v[pH 2]（500毫升）（见配方）
31. 甲醇：水梯度（500毫升）（见配方）

设备

1. 重型低型烧杯4L（任何类型，如VWR，目录号：10536-520）
2. 250 ml重型低型烧杯（任何类型，如VWR，目录号：10536-390）
3. 铲式刮刀（任何类型，如VWR国际，目录号：470149-438）
4. 250毫升离心瓶（赛默飞世尔科技公司，纳尔金公司，目录号：31200250）
5. 瓶盖为1L的可重复使用玻璃介质瓶（任何类型，如Thermo Fisher Scientific、Fisherbran，目录号：FB8001000）
6. 可重复使用的玻璃介质瓶，瓶盖为500毫升（任何类型，如赛默飞世尔科学公司、费舍布兰德公司、产品目录号：FB800500）
7. Sep-Pak®C18环保滤芯，55-105µm（Waters，目录号：WAT023635）
8. 二氧化碳培养箱（任何类型，如Thermo Fisher Scientific，型号：Hera Cell 150）
9. 水浴（任何产品）
10. 磁力搅拌器（任何产品）
11. 磁力搅拌棒（任何产品）
12. 台式冷冻离心机（任何类型，如Eppendorf，型号：5810R）
13. 落地式冷冻离心机（任何类型，如Beckman Coulter，型号：J2-21M）
14. 超低温冷冻机（任何产品，如赛默飞世尔科技公司，型号：Forma 900
系列）
15. SpeedVac真空浓缩器（任何产品，如赛默飞世尔科学公司，型号：Savant SPD120）
16. 便携式泵（任何产品，如Bio-Rad，型号：Econo梯度泵）
17. 本生灯
18. 低温（4°C）实验室室
19. 实验室通风柜
20. 蒸汽高压灭菌器

程序

A、细菌素生产培养基的制备及细菌生长
1. 将产生细菌素的BAC半固体琼脂培养基置于烧杯中，接种前将灭菌培养基在冷藏室过夜（18-24小时）。
2. 将产生细菌素的实验室菌株的预培养物制备到带有通风帽的13 ml无菌培养管中，并在含有10 ml THYE肉汤的通风帽中，在37°C和5%CO2的条件下在CO2培养箱中静置培养18 h。
3. 使用无菌玻璃巴斯德吸管，在无菌条件下将BAC半固体琼脂培养基刺穿约300次（图1）。


图1。细菌素生产培养基刺穿。使用22.9 cm的无菌玻璃巴斯德吸管，将半固体琼脂培养基刺穿多次。刺的深度应与所用移液管的尖端长度相对应（对于22.9 cm的巴斯德吸管，约为120 mm）。
4. 将产生细菌素的实验室菌株的过夜预培养物倒入BAC半固体琼脂培养基表面，并用与培养基灭菌相同的铝箔覆盖烧杯。在每升BAC半固体琼脂培养基的OD600中使用5毫升过夜预培养液（图2）。


图2。细菌素生产培养基的接种

5. 在37°C和5%CO2的条件下，在CO2培养箱中培养72小时（图3）。


图3。培养72h后获得细菌素产生实验室培养物。变形链球菌LAB761是一株编码多个细菌素位点的菌株，在刺穿的BAC半固体琼脂培养基中可以观察到细菌的生长。

B、分泌性细菌素的提取
1. 用抹刀捣碎混合物，然后转移到250毫升的离心瓶中（图4）。

图4。用抹刀（B）将刺穿的细菌素培养基（A）捣碎成小块。然后将捣碎的混合物转移到离心瓶（C）

2. 将装有捣碎混合物的瓶子存放在超低温冰箱中18小时。
3. 通过将瓶子放在65°C的水浴中1小时来解冻混合物。为了破坏实验室的细胞膜，必须进行冻融循环。
4. 使用地板冷藏离心机，在4°C下以15000 x g离心40分钟。
5. 小心收集上清液（图5A）并转移到1L的玻璃瓶中。
6. 加入等量的氯仿（图5B），用手用力摇动20分钟（图5C）。将混合物储存在4°C下过夜（18-24小时）。


图5。细菌素的氯仿萃取。向收集的上清液（A）中加入一体积的氯仿。用手将混合物（B）彻底混合约。
20分钟（C）。

7. 去除上层，将白色层转移到50毫升螺帽管中（图6）。让乳液自行沉淀（大约5-10分钟）。

图6。氯仿法提取细菌素。小心地去除与“氯仿废物”相对应的上部相（A）（B），并将含有分泌肽的白色物质转移到50毫升的试管中（C）。

8. 收集漂浮的白色界面层并转移到玻璃烧杯中（图7）。


图7。氯仿法提取细菌素。漂浮的白色界面层应清晰可见（A）。将对应于细菌素部分的白色界面转移到玻璃烧杯（B）中。

9. 将材料保存在通风橱中，直到残余氯仿完全蒸发（大约。
2-3天）。应获得含细菌素的棕色粉末（图8）。


图8。完全蒸发后胞外肽提取物的外观

10. 在25 ml ACN-TFA溶剂中溶解胞外肽提取物。
11. 将再悬浮的细胞外肽萃取物转移到50 ml的螺旋盖管中。
12. 使用台式冷冻离心机，在3200 x g下，在4°C下离心40分钟，以去除不溶性物质。
13. 将上清液转移到50毫升干净的螺旋盖管中。
14. 上清液通过具有低蛋白结合膜的0.22µm注射器过滤器。
15. 用100毫升的甲醇：水，80:20伏/伏。
16. 在步骤A18中获得的所得液体通过Sep-Pak®C18筒，使用50 ml的增加浓度甲醇：水（50%、60%、70%、80%和95%【pH 2】）使用便携式泵以1ml/min的流速进行细菌素活性试验。使用草坪斑点试验对所有部分进行细菌素活性试验。
17. 为了获得更高浓度的肽提取物，使用SpeedVac真空浓缩器在室温下干燥活性组分，并使用ACN-TFA溶剂溶解以获得所需浓度。
18. 将一小份细胞外肽提取物保持在4°C的温度下立即使用，其余的则存放在冰箱（-20°C）。

C、草坪斑点法测定细菌素活性
1. 将目标菌株的预培养物制备在带有通风帽的13 ml无菌培养管中，并在含有3 ml THYE肉汤的通风帽中，在37°C和5%CO2的条件下在CO2培养箱中静置培养18 h。
2. 测量预培养物的吸光度（OD600），并在55°C下预热的4 ml哥伦比亚软琼脂中稀释目标菌株，以使用绘图标准曲线（OD600与CFU/ml）获得约107 CFU/ml的浓度。
3. 将接种的软琼脂倒入哥伦比亚碳酸钙琼脂平板表面。保持室温，直到顶层凝固。
4. 在ACN-TFA溶剂中制备细胞外肽提取物的两倍系列稀释液（1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128）。
5. 在含有敏感目标菌株的ColumbiaCaCO3琼脂平板上滴下20µl等份连续稀释的细胞外肽提取物。等到液滴完全吸收后再孵育培养皿。为了加速吸收，把盘子放在本生灯的火焰旁，稍微关上盖子10-15分钟。
6. 在37°C和5%CO2的条件下，在CO2培养箱中培养18小时。

数据分析

1. 目测检查平板是否有生长抑制迹象（图9）。


图9。草坪斑点法检测变形链球菌胞外肽提取物的抗菌活性。测试两倍连续稀释肽提取物（显示1/16、1/32、1/64和1/128稀释液）的小份（20µl）。

2. 细菌素浓度表示为每毫微克的任意单位（AU）。金被定义为细菌生长抑制的最高稀释度的倒数。根据图9，细菌素浓度估计为3200 AU/ml（64 x[1000µl/20µl]）。

食谱

1. 肉汤（500毫升）
a、在一个带盖的高压灭菌玻璃瓶（1L）中，加入15克脱水的Todd Hewitt肉汤，
1.5 g酵母提取物和400 ml Milli-Q水
b、在瓶子里放一个磁力搅拌棒，用磁力搅拌器搅拌使其完全溶解
c、用Milli-Q水将最终体积调整至500 ml
d、在121°C下湿循环高压灭菌30分钟
注：无需调整pH值。盖子必须松开，以便蒸汽逸出。
肉汤可以在室温下储存。
2. BAC半固体琼脂培养基（2L）
a、在一个玻璃烧杯（4升）中，加入60克脱水托德休伊特肉汤，6克酵母提取物，2克
NaH2PO4，0.4 g Na2HPO4，1.4 g MgSO4，0.01 g FeSO4，6 g琼脂和1.6 L
Milli-Q水
b、在瓶子里放一个磁力搅拌棒，用磁力搅拌器搅拌使其完全溶解
c、用Milli-Q水将最终体积调整为2升。用铝箔盖住烧杯
d、在121°C下湿循环高压灭菌55分钟
注：无需调整pH值。接种前培养基在室温下保存18小时。
3. Columbia-CaCO3琼脂平板（500毫升）
a、在带盖的高压灭菌玻璃瓶（1L）中，添加17.5g脱水哥伦比亚肉汤、0.5g CaCO3、7.5g琼脂和400 ml Milli-Q水
b、在瓶子里放一个磁力搅拌棒，用磁力搅拌器搅拌溶解
c、用Milli-Q水将最终体积调整至500 ml
d、在121°C下湿循环高压灭菌30分钟
注：无需调整pH值。盖子必须松开，以便蒸汽逸出。虽然可以购买哥伦比亚琼脂基粉，但我们建议使用脱水哥伦比亚肉汤，并单独添加琼脂。用哥伦比亚琼脂基粉末检测细菌素活性较低。
e、在无菌条件下倒入琼脂平板
注：碳酸钙沉淀物不会完全溶解。琼脂板保存在4°C。
3. 哥伦比亚软琼脂（500毫升）
a、在一个带盖的高压灭菌玻璃瓶（1L）中，添加17.5g脱水哥伦比亚肉汤、3g琼脂和320 ml Milli-Q水
b、在瓶子里放一个磁力搅拌棒，用磁力搅拌器搅拌使其完全溶解
c、用Milli-Q水将最终体积调整至500 ml
d、在121°C下湿循环高压灭菌30分钟
注：无需调整pH值。盖子必须松开，以便蒸汽逸出。
软琼脂保存在55°C。
4. ACN-TFA溶剂（500毫升）
a、通过将175 ml乙腈稀释到324.5 ml Milli-Q水中，制备35%乙腈-0.1%三氟乙酸溶液，并将其放入带盖玻璃瓶（1l）中
b、加入0.5ml三氟乙酸
c、将磁性搅拌棒放入瓶中，用磁力搅拌器搅拌。注意：溶剂储存在室温下。
5. 甲醇：水，95:5伏/伏[pH 2]（500毫升）
a、通过将475毫升甲醇稀释到25毫升毫微克水中，制备95%甲醇溶液，并将其放入带盖玻璃瓶（1升）中
b、在瓶子里放一个磁力搅拌棒，用磁力搅拌器搅拌
c、用0.6盐酸调节pH值
注意：溶剂储存在室温下。
6. 甲醇：水梯度（500毫升）
a、通过将250 ml、300 ml、350 ml或400 ml甲醇分别稀释到250 ml、200 ml、150 ml或100 ml Milli-Q水中，将50%、60%、70%和80%甲醇溶液分别稀释到带盖的玻璃瓶（1 L）中
b、在瓶子里放一个磁力搅拌棒，用磁力搅拌器搅拌。注意：溶剂储存在室温下。

致谢

作者承认与巴博和德尔菲·杜福尔进行了许多有益的讨论。这项工作得到了加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）授予的RGPIN-2019-06454（致C.M.L.）和加拿大卫生研究院（CIHR）的CMA-151711（给C.M.L.和S.G.G.）的支持。C、 M.L.是加拿大口腔微生物遗传学研究主席的接受者。该方案曾在我们报告的工作中使用过（Dufour等人，2020年细菌杂志202:e00762-19）。

相互竞争的利益相互竞争的利益

作者声明没有利益冲突。

工具书类

1. Donia，M.S.和Fischbach，M.A.（2015年）。人体微生物群中的小分子。科学349（6246）：1254766。
2. Dufour，D.，Barbour，A.，Chan，Y.，Cheng，M.，Rahman，T.，Thorburn，M.，Stewart，C.，Finer，Y.，Gong，S.-G.和Lévesque，C.M.（2020年）。抗龋菌活性mutacinb-Ny266的遗传分析。细菌E062-0719:J。
3. Dufour，D.，Cordova，M.，Cvitkovitch，D.G.和Lévesque，C.M.（2011年）。作为链球菌细菌素相关的一种新的功能调节途径。细菌学杂志193（23）：6552-6559。
4. Dufour，D.和Lévesque，C.M.（2013年）。链球菌中与qorum感应肽信息素（'alarmone'）相关的细菌行为。未来微生物学8（5）：593-605。
5. Kolenbrander，P.E.，Palmer，R.J.Jr.，Periasamy，S.和Jakubovics，N.S.（2010年）。口腔多物种生物膜发育与细胞间距离的关键作用。微生物学自然修订版8（7）：
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6. López，D.，Vlamakis，H.和Kolter，R.（2010年）。生物膜。2（7）：a000398。冷泉哈勃透视生物
7. Merritt，J.和Qi，F.（2012年）。变形链球菌变位酶的调控与生态学。口服微生物学27（2）：57-69。
8. Nicolas，G.G.，Lavoie，M.C.和LaPointe，G.（2007年）。mutacins的分子遗传学、基因组学和生物化学。G3：基因，基因组，基因组学1（2）：193-208。
9. Perry，J.A.，Cvitkovitch，D.G.和Lévesque，C.M.（2009年A）。变形链球菌生物膜中的细胞死亡：CSP和细胞外DNA之间的联系。FEMS Microbiol Lett微生物学299（2）：261-266。
10. 佩里，J.A.Jones，M.B.，彼得森，S.N.，Cvitkovitch，D.G.和Lévesque，C.M.（2009年B）。