材料和试剂

一般用途
1. 标准移液管过滤器头（TipOne过滤器头）（StarLab，目录号：S1120-3810、S11201810、S1120-8810和S1112-1720或同等产品）
2. 移液管（10毫升血清移液管）（Sarstedt，目录号：86.1254.001）3。超纯水

细胞培养
1. 175 cm2烧瓶（Greiner Bio One，目录号：660175，或同等产品）
2. Filtropur S 0.2（Sarstedt，目录号：83.1826.001）
3. Stericup快速释放快速加0.22µm PES（默克Millipore，目录号：S2GPU11RE）
4. 卡斯特拉尼棘阿米巴（道格拉斯）页码（ATCC，目录号：30010）
5. D-（+）-葡萄糖（西格玛，目录号：G8270）
6. 三水合柠檬酸钠（Sigma，产品编号：C7254）
7. 蛋白胨（Sigma，目录号：82450）
8. 酵母抽提物（Fisher生物反应器，目录号：BP1422）
9. 氨苄西林钠盐，细胞培养/分子生物学等级（Euromedex，目录号：EU0400）
10. 硫酸卡那霉素，细胞培养级（Euromedex，目录号：UK0010）
11. D-（+）-葡萄糖（西格玛，目录号：G8270）
12. 蛋白胨酵母抽提物培养基（PPYG；见配方）
基础培养基
完全培养基
13. 36%葡萄糖溶液（见配方）
14. 氨苄西林储备液（100 mg/ml）（见配方）
15. 卡那霉素原液（25 mg/ml）（见配方）

梯度制备与回收
1. 塑料注射器（5毫升注射器）（Terumo，目录号：SS*05SE1）
2. 21G x 11/2“针头（Terumo，目录号：AN*2138R1或同等产品）
3. 无菌50毫升锥形管（Sarstedt，目录号：62.547.254，或同等产品）
4. 高分子管，38.5 ml（Beckman，目录号：326823）
5. 光学级超纯氯化铯（Invitrogen，目录号：15507-023）
6. 氯化铯溶液（1.2 g/cm3、1.3 g/cm3、1.4 g/cm3和1.5 g/cm3；见配方）
7. K36缓冲液（见配方）

净化质量控制
1. 玻璃显微镜载玻片（Biosigma，目录号：VBS653/A）
2. 封面纸（Biosigma，目录号：VBS636）
3. UVette 220-1600 nm（Eppendorf，目录号：952010051）
4. Formvar和碳涂层200目铜/铑网格（电子显微镜科学，目录号：FCF200 Cu）
5. 水中乙酸铀酰1%
注：醋酸铀酰是一种放射性化学物质。它是由电子显微镜设备提供的，因为我们不允许在实验室使用它。

设备

1. 微生物安全罩（ADS laminaire，型号：Optimal 12，或同等产品）
2. 培养箱生物性能（Froilabo，目录号：BP240，或同等产品）
3. 离心机（Beckman Coulter，型号：JXN-30）
4. 摆斗转子（Beckman Coulter，型号：JS24-38）
5. 分光光度计（Eppendorf，型号：生物光度计）
6. 倒置显微镜（蔡司，型号：Axio Observer.Z1）
7. 透射电镜（FEI，型号：Tecnai G2）
8. 高压灭菌器（SHP Steriltechnik SG，型号：Laboklav 135）
9. 蠕动泵（KNF Lab，型号：Laboport）

程序

1. 在20毫升PPYG培养基中播种20个175平方厘米的烧瓶，每平方厘米有1000个卡斯特拉尼棘阿米巴细胞。在32°C下培养两天。
注：您可以在每个烧瓶中分别添加最终浓度为0.1mg/ml和0.025mg/ml的氨苄西林和卡那霉素，以避免细菌污染。
2. 两天后，细胞汇合应在130000到180000个细胞/cm2之间。以0.2倍的感染倍数用模拟病毒库感染细胞。
在32°C下培养两天或直到细胞完全溶解。
注意：感染前无需更换培养基，也无需从烧瓶中取出病毒。
3. 从烧瓶中收集含有上清液的细胞碎片，并将其汇集到50毫升锥形管中。
注：对于含有20ml培养基的20个175 cm2烧瓶，您需要7个试管。
4. 在室温（~25°C，RT）下，在500 x g下离心10分钟，以去除电池碎片。
5. 将上清液倒入新的50个锥形管中。
6. 在室温下以10000 x g离心25分钟以使病毒颗粒化。
7. 丢弃上清液。
8. 通过移液管将产生的病毒颗粒重新悬浮在10毫升K36缓冲液中，并在两个新的50毫升锥形管（每管35毫升）中汇集。用K36缓冲液定容至50毫升。
9. 在室温下以10000 x g离心25分钟以使病毒颗粒化。
10. 在离心过程中，在Beckman聚丙烯管中制备四个CsCl梯度。在每根管底部添加7.5 ml密度为1.5 g/cm3的CsCl溶液，然后逐滴小心地覆盖9 ml 1.4 g/cm3 CsCl溶液和9 ml 1.3 g/cm3 CsCl溶液。等待最终病毒含有1.2g/cm3的密度层。
11. 丢弃步骤9中离心分离的上清液。
12. 用移液管将两个病毒颗粒用16 ml 1.2 g/cm3 CsCl溶液重新投加。
13. 将8毫升再悬浮病毒颗粒逐滴覆盖在四个梯度的顶部（图1A）。
14. 在Beckman Coulter JS2438转子中，在10万x g、20°C下离心过夜（16至18小时）。
15. 离心后，通过梯度小心地用吸管或刺穿多聚物管并用针头和注射器抽吸（图2），收获与病毒部分（图1B）相对应的白色环。将病毒部分转移到两个新的50毫升锥形管中，在每个管中添加高达50毫升的K36缓冲液，并通过倒置试管进行混合。


图1。离心管分离前（A）后（B）模拟病毒颗粒在CsCl梯度上分离。黑色箭头所示的白色环对应于拟态病毒粒子。


图2。侧刺法收集病毒组分

16. 在室温下以10000 x g离心25分钟以使病毒颗粒化。
17. 用10ml的K36缓冲液将两个小球再悬浮，用K36使其体积达到50ml，并在室温下以10000 x g离心25分钟以洗涤病毒。
18. 重复步骤16和17两次。最后一次清洗时，将再悬浮的病毒集中在一个50毫升的锥形管中。
19. 在10ml K36缓冲液中再悬浮最终颗粒。
20. 病毒可在-80°C下滴定或储存，直到进一步使用

笔记：
a。通常，当使用该方案纯化棘阿米巴多噬拟态病毒时，我们回收10毫升含有1×1010至4×1010粒子/毫升的病毒溶液。
b。纯化后的颗粒具有传染性，可用于进行新的感染或任何其他实验。

数据分析

1光学显微镜
将4.5µl纯化病毒悬浮液滴在显微镜载玻片上，并覆盖一张盖玻片。倒置几个小时，让病毒沉淀在盖玻片上，以便更容易聚焦。用63x物镜用光学显微镜观察，确认纯化后的病毒不含任何明显的污染物（图3）。


图3。用光学显微镜观察拟态病毒纯化颗粒（63x物镜，1.6x视差）

2透射电子显微镜
对于透射电镜，在K36缓冲液中稀释纯化的咪咪病毒样品1:2（v/v），并在室温下将10µl液滴培养在formvar和碳涂层的200目铜/铑网格上1分钟。用三个连续的1%乙酸铀酰液滴清洗网格。将残留的醋酸铀酰留在网格上1分钟，然后用滤纸轻轻触摸网格边缘，将其清除。干燥后，用电子显微镜检查网格（图4）。


图4。咪咪病毒纯化颗粒的阴性染色观察

食谱

1. 葡萄糖溶液
将36克葡萄糖和2克柠檬酸钠溶于100毫升微温水中。
溶液澄清后，用其配制完整的PPYG培养基。
2. 蛋白胨酵母提取物（PPYG）培养基基：
高压灭菌40 g蛋白胨和2 g酵母抽提物，稀释于1.8 L超纯水中，置于2 L玻璃瓶中。
让它在室温下冷却。
完整介质：
a、在基础培养基中加入以下物质
20ml硫酸镁400mm
16毫升50毫米氯化钙
20毫升铁（NH4）2（SO4）2 5毫米
20ml Na2HPO4 250mm 20ml KH2PO4 250mm和100ml葡萄糖溶液。
b、使用蠕动泵过滤0.22µm灭菌杯，并在室温下储存
3. 氨苄西林储备液（100 mg/ml）
a、将1g氨苄西林溶于10ml超纯水中
b、通过插在注射器上的0.22µm过滤器过滤
c、在1.5 ml试管中等分，并在-20°c下储存
4. 卡那霉素原液（25 mg/ml）
a、将250毫克卡那霉素溶于10毫升超纯水中
b、通过过滤器22μm的注射器堵塞
c、在1.5 ml试管中等分，并在-20°c下储存
5. K36缓冲器
a、在1L超纯水中溶解2.25g KH2PO4、5.8g K2HPO4·3H2O、7.4g KCl和0.9g NaCl
b、通过与蠕动泵相连的1L 0.22µm灭菌杯过滤，并在室温下储存
6. 氯化铯溶液
密度1.5 g/cm3：在27.3 ml超纯水中溶解22.7 g CsCl
密度1.4 g/cm3：在30.6 ml超纯水中溶解19.4 g CsCl
密度1.3g/cm3：将15.62g CsCl溶解于34.38ml超纯水中
密度1.2g/cm3：在38.8ml超纯水中溶解11.2g CsCl
溶液澄清后，通过插在注射器上的0.22µm过滤器进行过滤

致谢

这项工作得到了法国国家科学研究中心和地中海微生物研究所的“起首政变”的支持。

相互竞争的利益相互竞争的利益

不存在利益冲突或利益冲突。

工具书类

1. Andrade，A.，罗德里格斯，R.A.L.，Oliveira，G.P.，Andrade，K.R.，Bonjardim，C.A.，La Scola，B.，Kroon，E.G.和Abrahão，J.S.（2017年）。填补模仿病毒进入、脱衣和形态发生的知识空白。维罗尔杂志91（22）。
2. Arslan，D.，Legendre，M.，Seltzer，V.，Abergel，C.和Claverie，J.M.（2011年）。具有较大基因组的远距拟态病毒突出了巨病毒科的基本特征。美国科学院学报108（42）：17486-17491。
3. Byrne，D.，Grzela，R.，Lartigue，A.，Audic，S.，Chenivesse，S.，Encinas，S.，Claverie，J.M.和Abergel，C.（2009年）。咪咪病毒转录物的多聚腺苷酸化位点遵循严格的“发夹规则”。基因组研究19（7）：1233-1242。
4. 坎波斯，R.K.，博拉托，P.V.，阿西斯，F.L.，阿吉亚，E.R.，席尔瓦，L.C.，阿尔巴纳兹，J.D.，多纳斯，
F、 P.，Trindade，G.S.，Ferreira，P.P.，Marques，J.T.，Robert，C.，Raoult，D.，Kroon，E.G.，洛杉矶
Scola，B.和Abrahão，J.S.（2014年）。桑巴病毒：一种来自巴西亚马孙雨林的新型拟态病毒。维罗尔杂志11:95。
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