材料和试剂

1. 副膜
2. 50毫升猎鹰管
3. 1毫升移液管尖端
4. S、酿酒细胞
5. 0.1 mg/ml牛血清白蛋白（Sigma-Aldrich）
6. 10纳米金纳米粒子（BBI溶液，一般条款10)
7. 蒸馏水中50%（v/v）乙醇，0.2µm过滤（500 ml）
8. 18 MΩH2O，0.2µM过滤（1 L）
在使用之前，确保水和乙醇中没有碎屑，因为碎屑会损坏金刚石刀具。
9. 右旋糖酐（Mr~6000）（Sigma-Aldrich，目录号：31388）
10. 加压乙烷气
11. 液氮

设备

工具（标准）
1. 涂有连续碳膜的平行棒电磁网格（电子显微镜科学，目录号：G150PB-CU）
2. EM网格框
3. K100X辉光放电（Quorum Emitech）
注：该产品已于2010年停产。电流等效于SC7620微型溅射镀膜机/辉光放电系统。
4. 用于处理电磁网格的尖头和自锁镊子（Ted Pella，Inc.）
5. 金属卡盘（包括UC7/FC7）
6. 卡盘适配器（0.45 mm）（包括在UC7/FC7中）
7. 塑料FC7盖（包括UC7/FC7）
8. UC7/FC7（徕卡微系统公司）
注：RMC产品提供的另一种低温切片机可在市场上买到。但是，我们对该产品没有任何经验。
9. 金刚石切边刀（硅藻土）
10. 克莱恩（徕卡微系统公司）
11. 离心机
12. 金刚石刀
13. 镊子

工具（非标准）
1. 纤维工具（图1A）
2. 豚鼠毛（可从宠物店或畜牧业设施购买）
3. 微操作器（Narishige Scientific Instrument Lab，目录号：MN-151S[6 mm操纵杆行程]）（图1B）（灵感来自Ladinsky等人，2006；Ladinsky，2010；Studer等人，2014）注：任何市面上可买到的微操作器均可用于冷冻切片。
4. 铜管（内径0.45 mm，外径0.65 mm）和将样品拉入铜管的线工具（第733-1部分，工程办公室M Wohlwend GmbH）（图1C）
5. 扁嘴钳（图1D）
6. 铜管切割装置（零件。732，工程办公室M Wohlwend GmbH）（图1E）
7. 用于储存铜管的钢桶（图1F）（根据Zuber实验室的低温切片工具设计）
8. 铝支架（底座和插入件）（图1G）
9. 开槽塑料FC7盖【修改自（Studer等人，2014年），以尽量减少冰污染】
（图1H）
10. 空气除尘器


图1。用于实现连续冷冻切片的工具。A、定制纤维工具，用于在冷冻切片时操作冷冻带。B、定制微操作器，用于精细控制光纤工具。在冷冻切片过程中，微操作器用磁性支架固定在一个沉重的钢块上。C、将铜管（直径为45毫米）加压拉制成铜管（直径为45毫米）的铜管。D、在冻结前用钳子把铜管的末端夹紧。E、沿青色虚线切断铜管平端的装置。注意，无法完全清除的锈迹不会影响切割设备的性能。用户也可以考虑用易生锈材料制成的切割机。F、定制钢桶，用于储存含有冷冻样品的铜管。钢桶可以很容易地装进一个50毫升的猎鹰管。G、底座和镶块铝支架，可以组装在金刚石刀上。H、开槽塑料FC7盖，带切口，用于（i）镊子，（ii）Crion，（iii）纤维工具，和（iv）用于冷冻切片时的观察。封盖的半透明性不影响冷冻切片的工作流程。

软件软件

1IMOD（马斯特罗纳德，1997年）(https://bio3d.colorado.edu/imod/)

程序

A、电磁栅格准备
1. 等离子体清洁电磁网格使用K100X辉光放电（15毫安，45秒）以增加亲水性网格。
2. 使用自锁镊子固定格栅。
3. 用4µl 10 nm金纳米粒子和46µl 0.1 mg/ml牛血清白蛋白覆盖网格的碳侧。
注：金纳米粒子被用作倾斜序列校准的基准点，用于断层重建。
4. 隔夜风干格栅，然后将其储存在干燥箱中直到使用。

B、自增压冷冻（Leunissen and Yi，2009）
1. 使用离心机（5000 x g，4°C，5分钟）将50 ml酿酒酵母细胞（OD600~1）制成颗粒。
2. 丢弃上清液。
3. 使用1毫升移液管尖端将细胞颗粒重新悬浮在等体积的50%右旋糖酐中。
注意：使用一个1毫升的移液管尖端有助于细胞颗粒在粘性50%右旋糖酐中再悬浮。4用移液管将~20μl混合物移到一片副薄膜上。
5将焊丝工具穿过铜管，然后将铜管的一端浸入液滴中，通过拔出焊丝工具将混合物吸入管中。
笔记：
a。为防止将空气吸入铜管，在抽取样品之前，确保铜管末端完全浸没在液滴中。
b。重复2-3次，确保铜管中没有气泡。
6. 用平嘴钳夹住铜管的两端。
7. 将铜管放入液态乙烷中进行自增压冷冻。
8. 将铜管移入切割装置，切断铜管的平端（图1E）。

自加压冷冻对我们的酵母酱样品很有效。冷冻法（Dubochan-1995）是高压冷冻制备样品的替代方法。

C、冷冻切片机设置（图2A-2D）
1. 将金刚石刀具和样品架（卡盘和卡盘适配器）放入FC7中并拧紧。
2. 用塑料FC7盖上FC7，以防止冰晶在冷冻室中积聚。
3. 将系统冷却至-150°C。
4. 确保修边刀处于切边位置（图2E）。
5. 将装有铜管样品的钢桶转移到FC7中，并将其放在FC7后面的平台上（图2A；“背面”的定义也见图2）。


图2。用于装配工具的冷冻切片。A、将镊子定位在内置微操作器上，并将装有铜管样品的钢桶放置在FC7后面的平台上。B、用于操作低温带的微操作器和纤维工具。C、在FC7室中定位工具，以便将冷带转移到碳涂层的EM网格上。D、卡盘和卡盘合上。刀台处于（E）准备位置和（F）切割位置进行修整。G-I.将铝支架装配到切割刀上。

6. 用冷却镊子从钢桶中取出一根铜管冷冻样品，并迅速转移到FC7低温室中。
减小运动幅度将减少对气流的干扰，从而限制冰污染进入低温室。
7. 将铜管插入样品架，确保铜管牢固固定到位。

D、修边
1. 将切边刀移到靠近铜管的位置（图2F），使刀刃刚好擦过铜管的外表面。
笔记：
a。修剪只能从铜管的末端开始。
b。切铜不会对金刚石刀造成伤害，但刀在与铜管碰撞时很容易被侧面损坏。
2. 插入Crion并让其冷却10分钟。
3. 在UC7上设置微调设置（500 nm进给，50 mm/s切割速度，中等返回速度）。
4. 打开Crion并将其设置为排放模式，以防止碎屑粘到刀刃上。注意：如果Crion不能保持刀口足够干净，则逐滴倒入液氮，以冲走积聚在刀口上的碎屑。
5. 开始修剪，直到样品表面看起来光滑和黑暗，表明玻璃状冰。
笔记：
a。如果整个样品看起来不光滑和黑暗，那么它可能不是玻璃质的。
b。对于自增压冷冻样品，与铜管内表面接触的薄层样品可能因为不是玻璃质而出现结霜。这种少量的结晶冰是可以接受的，只要有足够的玻璃质冰靠近管的中心，形成一个方形台面（见下一节）。
6. 将修整速度减慢至25 mm/s，中等返回速度，200 nm进给，然后再修剪1µm。

E、整块以形成100 x 100 x 30µm的方形台面（图3A-3C）
1. 在UC7上设置微调设置（200 nm进给，25-50 mm/s切割速度，中等返回速度）。
注：降低修整速度可减少样品修整时引入系统的振动，从而使台面斜坡上的表面更光滑，这对于低温切片到低温切片的连接至关重要。
2. 向右平移切边刀，使其左角距铜管右内壁约0.1 mm。
3. 向前移动切边刀，使刀口轻轻接触样品表面。
4. 修整至约30µm深。
5. 将修边刀向后平移约50µm。
6. 将修边刀向左平移，使刀片右角距离
新创建的台面边缘。
7. 修整至约30µm深。
8. 将修边刀向后平移约50µm。
9. 打开金属卡盘，将铜管旋转90°，锁定卡盘，重复步骤E2-E8。
10. 现在应该有一个100µm的方形台面，30µm高。
台面的长度（沿切割方向，如图3F中的L所示）可以缩短，以增加每单位长度低温带的冷冻切片数量。

F、冷冻切片
1. 旋转刀台，使切割刀面向样品。
2. 将铝支架的底座放在切割刀上（图2G和2H）。
3. 将光纤工具插入FC7中，等待5分钟，等待工具冷却。
4. 慢慢将刀口靠近样品表面。
5. 将豚鼠毛发靠近样品。
笔记：
a。确保豚鼠毛不接触样品表面或刀口。
b。检查豚鼠毛发是否能从样品管开口端向FC7背面移动至少3 mm。
6. 在UC7上输入切割设置（100 nm进给，1 mm/s，慢速返回）。
7. 打开Crion并将其设置为放电模式。
8. 开始切割。
9. 在前几个（100µm台面约3-5个低温切片）制作完成后，停止切割。
10. 使用纤维工具，轻轻地从第二个冷冻段提起冷冻带，并将其向上循环，然后朝向刀口（图3D）。
笔记：
a。确保低温带的新边与刀刃保持连接。
b。使用微操作器上的定位旋钮上/下移动光纤工具，使用操纵杆向前/向后移动光纤工具。
11. 在保持环路位置的同时进行2-3次切割（图3E）。这将导致低温切片在切割位置熔合，在冷带开始处产生一个环路，可用于固定和操纵低温带。
12. 将豚鼠的毛尖穿过环。
13. 再次开始切割，同时使用微操作操纵杆在低温带上保持恒定张力（图3F）。
14. 一旦冷带长度超过3毫米，停止切割。
一条3毫米长的冷冻带将跨越电磁网格的直径，使连续冷冻切片的数量最大化，因此对于串行冷冻-ET来说非常重要。
15. 用镊子拿起电磁栅格。确保电磁栅极的铜排平行
用冷丝带。
16. 将镊子放在内置的微操作器上，将EM网格插入FC7，然后等待约1分钟，等待网格和镊子冷却。
注意：不要让电磁栅格接触刀口。
17. 将电磁栅格放置在低温带下方。使用光纤工具，使低温带与电磁栅极的铜棒平行并在其之间对齐（图3G）。将冷冻带放置在网格中间附近，以使可成像的连续冷冻切片的数量最大化。


图3。低温带制备和网格定位。A-C.获得光滑的玻璃冰表面后，如（A）所示，在相互垂直的两个方向（B和C）修剪管的外缘，以形成台面。D、在最初的几个冷冻切片制作完成后，将豚鼠毛发放在冷冻带下，并将其绕向刀口，如（E）所示。保持环在适当的地方，再切两到三个切口，将低温带的末端熔合到新的冷冻切片机上。F、将豚鼠的毛发穿过线圈，然后在剩下的切割过程中使用它来操纵冷丝带。较短的冷冻切片（冷冻切片的长度由L定义）将导致每个冷冻带有更多的冷冻切片。G、切割后，在连接之前，使用纤维工具将Cryotribbon与EM网格的棒平行对齐。应将栅极加载到低温电子显微镜中，使栅极的平行杆垂直于显微镜台的倾斜轴。为了便于可视化，冷冻切片和网格条不按比例绘制。H、左图：一张附有3毫米长冷冻带的平行棒电磁栅格照片。右侧面板：左侧面板中显示的附加低温带的放大。

18. 在CRI模式下，将冷离子带连接到图上，持续3秒。
19. 从FC7上卸下光纤工具。
20. 在液氮中冷却铝支架的插入件，并将其放在切割刀上的底座上（图2I）。
在实验结束时添加插入件可以提供一个干净的表面，以便在准备电磁栅格盒时存储电磁栅格。
21. 将EM格栅轻轻地放在铝支架上，然后小心地从FC7上拆下纤维工具和镊子。
注意：将电磁栅格放在平台上可以更容易地传送到电磁栅格盒中。
22. 在液氮中冷却电磁栅格箱，并将其放入FC7。
注：这是在实验结束时进行的，目的是尽量减少格栅箱中的冰污染。
23. 将电磁栅格放入电磁栅格盒，并将其储存在液氮中直到成像。

G、打包和工具维护
1. 停止FC7的液氮冷却。
2. 立即取下刀片和刀台，在刀口上倒入500毫升18 MΩH2O，然后再倒入500毫升50%乙醇，然后再次倒入500毫升18 MΩH2O进行清洗。
3. 使用空气吹尘器清除刀片上的任何可见碎屑，然后使用Kimwipe在不接触刀片的情况下干燥刀片的其余部分。
4. 把所有的刀都放在干燥的柜子里。
5. 在存放之前，使用吹风机吹干所有其他工具。

H、系列冷冻切片上的倾斜系列采集
1. 在低温电子显微镜中加载电磁网格，使平行杆垂直于倾斜轴（图3D）。
注意：这种几何结构确保网格条不会在高倾斜度下阻塞冷冻切片。
2. 在低倍镜下，在靠近网格边缘的一个冰冻切片中选择一个感兴趣的细胞进行成像，然后在多个连续的冰冻切片上定位并记录同一细胞的阶段位置，以进行倾斜序列采集。
注：如果电池位置与EM网格上的碳很好地连接，则很可能在低温带的其他低温段上的相同位置也会很好地连接。
3. 记录每个细胞位置的倾斜序列，记下每个倾斜序列沿冷冻带的顺序。
4. 使用IMOD程序Etomo重建断层图，并将它们连接在一起作为一个连续断层图（图4A）。

数据分析

结果
我们改进的冷冻切片工作流程和定制的工具使我们能够重复制作3毫米长的冷冻带。这些冷冻带的质量使我们能够确定最薄的酵母冷冻切片，使用我们的设置。我们最薄的可用低温切片是用20nm的进料制成的（图4B）。10nm的进料导致低温切片结块，无法使用低温电子显微镜成像。用较薄的进料切割低温切片也会导致低温切片更严重的压缩（图4C）。


图4。对冷冻切片工作流程的增加使长冷冻带的生产成为可能，允许进行连续的冷冻电子断层扫描。A、使用100nm进料切割的7张断层图的横截面。纺锤体微管的纵切面可以看到横跨7张断层图中的6张（黑色矩形）。B、使用从100纳米到10纳米的进料生产的单个冷带。10纳米的切割进料导致低温切片结块。C、使用20nm进料切割会导致冷冻切片产生更严重的压缩伪影，如酿酒酵母细胞的椭圆度增加所示（黑色轮廓）。压缩伪影会导致细胞成分变形。

通过描述切割温度和切割刀类型对冷冻切片的影响，我们进一步测试了冷冻切片的设置（Al-Amoudi等人，2005；Han等人，2008）。我们发现，在-140°C（而不是-150°C）下切割会导致低温切片表面出现不太严重的裂缝伪影，而用25°刀而不是35°刀切割时，低温切片的压缩程度更小（图5）。


图5。不同温度和不同金刚石刀切割酵母冷冻切片的比较。A、在-140°C（而不是-150°C）下切割时，裂缝伪影会减少。当比较对细胞外缓冲液（白色矩形）的裂缝影响时，这种差异尤为显著。B、当切割温度超过140℃时，切割断面的生物切割深度从约为140℃减小到约为34纳米。这里显示的所有冷冻切片都是用100纳米的进料制作的。

笔记

一般提示：
1. 为避免受伤，请勿触摸刀片。接触刀口也可能损坏刀口，影响低温切片的质量。
2. 冰污染很容易阻碍连续倾斜系列的收集。因此，在实验的所有步骤中都要采取预防措施，以尽量减少蒸汽进入FC7低温室。注意事项如下：
a、缓慢而谨慎地移动，以避免干扰FC7内的气流。减少对气流的干扰将减少冰污染。
b、使用塑料盖尽量减少FC7低温室暴露于外部环境。
c、在冷冻切片时戴上手术面罩，以减少呼吸造成的水蒸气污染。
3. 切边或冷冻切片后，将刀从样品上移开，朝FC7的背面移动，然后将刀架向侧面移动，以防损坏样品表面。
4. 将所有工具冷却后再靠近样品。

致谢

我们感谢陈晨在实验室建立了初步的冷冻切片术，Gemma An建议使用平行杆电磁网格，并感谢Olivia Ma在准备图形和对手稿的反馈方面的帮助。我们也感谢甘实验室的成员对冷冻切片的反馈和建议。我们感谢Satoru Chomabayashi（Narishige）在修改MN-151以增加操纵杆行程方面的帮助，以及Eddie Lee（JEG工程供应）制造其他定制工具。该方案用于（Ng等人，2019年）。
C、 T.Ng和L.Gan由新加坡教育部拨款MOE2018-T2-2-146资助。M、美国国立卫生研究院（National Institutes of Health grant）（2 P50 GM082545-08）向帕梅拉提供资助
J、比约克曼。

相互竞争的利益相互竞争的利益

作者声明没有竞争性的经济利益。

工具书类

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