材料和试剂

笔记：
对于该方案，所有材料和试剂都必须不含RNase，这一点至关重要。为此，试剂和材料都是不含RNase的，并且是预制的或易于溶解的，以便尽可能简化程序。只要适用，可使用无RNase的一次性离心管来制备试剂。
DIG试剂有多个试剂盒。此处列出了项目19-23，供读者选择以适合所需的规模。

1.离心管，不含RNase（根据需要提供1.5 ml，2 ml，15 ml和50 ml）
2. QIAzol裂解试剂（Qiagen，目录号：79306）
3.氯仿，分子生物学等级
4.异丙醇，分子生物学等级
5.乙醇，分子生物学等级
6. UltraPure不含DNase / RNase的蒸馏水（Invitrogen，目录号：10977-023）
7. TEMED（国家诊断，目录号：EC-503 ）
8.过硫酸铵（国家诊断，目录号：EC-504 ）
9.尿素（National Diagnostics，目录号：EC-605 ）
10. AccuGel 29：1（30％）（National Diagnostics，目录号：EC-851 ）
11. 3 M醋酸钠溶液，pH 4.5（国家诊断，目录号：EC-905）
12.醋酸钠，3 M溶液，pH 5.2（国家诊断，目录号：EC-906）
13. EDTA，0.5 M，pH 8.0（Thermo Fisher Scientific，目录号：AM9260G）
14.二甲苯氰，分子生物学等级
15.溴酚蓝，分子生物学等级
16. Tris-HCl溶液，1 M，pH 9.0（Sigma-Aldrich，目录号：T2819-100ML）
17. Amersham Hybond -XL膜（GE生命科学，目录号：45-001-148）
18.三- broate -EDTA（TBE）缓冲液，10倍（赛默飞世尔科技，产品目录号：AM9863）
19. DIG RNA升abeling混合物（西格玛- Aldrich公司，目录号：11277073910）
20. DIG RN A标签套件（Roche，目录号：11175025910）
21. DIG系统（罗氏，目录号：12039672910）
22. DIG Easy Hyb （Sigma - Aldrich，目录号：11603558001）
23. DIG洗涤和封闭缓冲液组（Sigma - Aldrich，目录号：11585762001）
24.抗地高辛配基-AP，Fab片段（Sigma - Aldrich，目录号：11093274910）
25. CDP-Star（Sigma - Aldrich，目录号：11685627001）
26. RNase Zap（Thermo Fisher，目录号：AM9780）
27. palustris的生长培养基（PM培养基）（请参阅食谱）
28.酸性尿素凝胶（请参阅食谱）
29.乙酸钠-EDTA运行缓冲液（请参见配方）
30.乙酸钠-EDTA上样缓冲液（请参见食谱）

设备

注意：在使用前，应使用RNaseZap或等同物对RNase进行净化，以清洗工作台以及电泳，转移和Northern blot系统。

直径0.1毫米的氧化锆/二氧化硅珠（Bio Spec Products Inc，制造编号：11079101z ）
Mini-Beadbeater-24（Bio Spec Products Inc，目录号：112011）
电泳，转移和Northern blot系统适合20厘米高的凝胶
温控台式离心机
用于温控培养或等效培养箱的PCR机

小号oftware

图像

程序

从总RNA分离沼泽红假单胞菌
笔记：
为捕获感兴趣的生物选择合适的细胞裂解方法至关重要，以捕获tRNA的天然电荷状态。这里描述的方法基于微珠和打珠器，通常用于我们的研究小组，以从大麦芽孢杆菌和相关α-变形杆菌中分离RNA。我们强烈建议读者针对其感兴趣的生物测试不同的裂解方法（例如，珠子体积与培养基体积之间的比率，细胞跳动循环的次数等）。
关于t RNA充电状态的另一个说明是，正如其他地方所阐述的（Janssen等人，2012；Bullwinkle和Ibba，2016），样品必须始终保持在酸性条件下。整个方案中均使用酸性缓冲液和凝胶系统。
RNA纯化从P rocedure阿可以直接在该协议中的下列步骤中使用。这是因为tRNA的充电状态是根据带电与不带电tRNA的比率计算得出的。因此，DNA和/或蛋白质的轻微污染不会影响此处所述纯化后的最终结果。如果将纯化的RNA用于其他步骤（如RNAseq或体外翻译），则需要进一步纯化。

实验前，为每个样品准备一个螺口盖的2 ml离心管。在每个试管中加入〜500 µl氧化锆/二氧化硅珠，并对所有试管进行高压灭菌。
增长沼泽红假单胞菌文化前进水库所要求的实验问题。我们使用的典型生长条件在Kim和Harwood（1991）中给出。但是，培养基的组成对于我们在此描述的方案并不重要。的典型样品含有3-5毫升培养物在阿布斯660〜1.2。通过以4,000 rpm离心在4 °C下收集细胞，并将沉淀保存在-80 °C下。
将每个冷冻细胞沉淀重悬于1 ml QIAzol Lysis Reagent中。用移液器轻轻混合，然后将重悬的样品转移至带有小珠的试管中。此步骤应在冰上进行。
用3500 rpm的打珠器破碎细胞1分钟，然后将样品放在冰上1分钟。重复此循环3次。
将所有样品在室温下放置5分钟。
向每个样品中加入200 µl氯仿。用手剧烈摇动试管15 s。
将试管在室温下放置3分钟。
在4 °C下以12,000 xg离心样品15分钟。小心地将560 µl无色上层水相转移至新的1.5 ml离心管中。
加入0.5毫升异丙醇并涡旋彻底混合。
在4 °C下以12,000 xg离心15分钟。丢弃上清液。
加入1 ml的75％乙醇。在4 °C下以7,500 xg离心5分钟。
完全去除上清液。短暂地在通风橱中风干RNA沉淀（5-10分钟）。
将每个RNA沉淀重新溶于10 mM的乙酸钠，pH 4.5。纯化的RNA可以在-80 °C下保存至少两周。典型的产量是50 µl总RNA 5 µg / µl。该数量可能会因种类，生长状态和采样量等因素而异。

碱性pH处理可产生脱酰基的（不带电荷的）tRNA对照
取约10 µg纯化的RNA。直接将0.5 M EDTA和1 M Tris-HCl（pH 9.0）的储备溶液添加到样品中，以将最终缓冲液调整为1 mM EDTA和100 mM Tris-HCl（pH 9.0）。将最终体积调整为50 µl。通过移液混合均匀。
将样品在42 °C下孵育60分钟。
向样品中加入5 µl 3 M乙酸钠，pH 5.2。将缓冲液恢复至pH 5.2不会再次使样品酰化。
向样品中加入137.5 µl冰冷的95％乙醇，然后在冰上孵育10分钟。
在4 °C下以13,000 xg离心10分钟以沉淀RNA。
除去上清液，并用1 ml 70％乙醇洗涤RNA沉淀。
在4 °C下以13,000 xg离心10分钟。
完全去除上清液。根据需要风干RNA沉淀。
用〜30 µl 10 mM乙酸钠，pH 4.5溶解脱酰基的RNA。

制备DIG标记的tRNA- Trp探针
DIG RNA标记试剂盒（Roche）在我们的项目中用于生成标记探针，用于后续实验。在适当的情况下，可以替代等效试剂，例如DNase I和T7 RNA聚合酶。其他策略（例如经典的P 32标记）也可以用于此步骤。如果是这样，应相应调整以下实验。作为用于试剂盒DIG的详细协议是可商购的，本节将集中于如何适于它来检测的tRNA色氨酸在沼泽红假单胞菌CGA009。

选出R. palustris CGA009 tRNA Trp中的31个核苷酸作为探针的靶标。以下dsDNA已商业化制备（IDT）作为体外转录的模板：
TGAATTG TAATACGACTCACTATAGGG GGTTTTGGAGACCGGTGCTCTACCAATTGAG
根据我们的经验，dsDNA的基本纯化水平应默认为分子生物学级。我们还订购了两个互补的ssDNA，并将它们退火在一起以形成dsDNA（有关更多信息，请参见参考文献5 ），它也能正常工作。
在上述序列中，阴影部分是T7 RNA聚合酶的启动子，下划线部分是我们在tRNA Trp上靶标的反向互补。在启动子之前添加7 bp的钳位以促进聚合酶结合。必须逐案选择tRNA靶序列，并鼓励读者尝试几种候选序列。
按照DIG RNA标记试剂盒的说明制备反应混合物。以下是我们用于项目的示例（试剂盒中除模板外的所有其他试剂）。可以根据需要放大或缩小音量。
9 µl无RNase的水
4 µl转录（5 x ）缓冲液
4 µl DIG标记混合物
2 µl T7聚合酶
1 µl dsDNA模板（10 ng / µl足够）
将反应混合物在42 °C孵育1.5小时。
对于每个反应，添加2 µl DNaseI，并在37 °C下孵育15分钟。
无需进一步纯化探针。将反应产物稀释并准备用于进一步的步骤。可以使用测试Northern印迹法（例如带有总RNA的点印迹法）来确定用于实际实验的探针的最佳稀释倍数（例如，将探针进行系列稀释10倍，然后进行测试哪种浓度在阅读器的检测系统中产生最佳的信噪比）。

酸性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳
建议使用至少20 cm高的电泳系统分析tRNA的充电状态。凝胶/间隔物的厚度无关紧要，只要可以将孔中的尿素充分清除即可。带电和不带电的tRNA之间的差异很小。较小的凝胶可能适合分析某些肽基-tRNA，但通常不提供分析氨酰基-tRNA的分辨率。对于每次运行，必须包括不带电荷的tRNA样品作为阴性对照。

用酸性脲凝胶组装电泳系统。添加冷的乙酸钠-EDTA电泳缓冲液，并在20 V 4预运行凝胶30分钟℃下。预运行的目的是提高凝胶的温度。看到公司的网页更多的信息（见参考文献erence 6）。
将样品在72 °C下孵育3分钟。短暂旋转样品，并将其与上样缓冲液按1：1比例混合。对于20厘米高的凝胶，通常每孔上样〜20 µl样品，总共2.5-5 µg总tRNA。所需的最小和最大样品量需要根据具体情况进行测试和确定。
用注射器和针头清洁装载井。这需要在将样品施加到孔之前立即进行。对于酸性脲凝胶，尿素继续在孔中积聚。如果未正确清洁，这可以防止样品沉淀在井底。
加载样品。染料的颜色不应改变。在4 °C下以15 W运行凝胶12小时（对于20厘米高的凝胶）。这是至关重要的，弹出并保持凝胶的操作温度DUR荷兰国际集团的运行，恒功率因此设置以及上述规定的预运行（见参考文献erence 5 F或更多信息）。

Northern印迹分析
电泳后，可以使用适合现有系统的任何标准方案将RNA从凝胶转移到膜上。在本例中，我们使用0.5 x TBE作为传输缓冲区。我们在4 °C （20 V过夜或650 mA 30分钟）下进行了标准的湿法转移。两种设置之间未观察到明显差异。然后将膜准备交联并进行Northern印迹。根据我们的经验，暴露于紫外线灯箱中10-15分钟就足够了，并且可以作为起点。
的DIG系统的标准协议（罗氏，见参考文献erence对于m 7矿石信息）瓦特作为用于Northern印迹阻挡，洗涤和检测步骤。简而言之，使用tRNA Trp探针检测膜上的tRNA Trp ，然后与Anti-Digoxigenin-AP和CDP-Star相互作用以产生化学发光信号。任何合适的成像系统，例如胶片或数字成像仪，都可以用来检测和量化结果。

数据分析

ImageJ用于定量胶片上的图像。对于使用数字成像仪获得的结果，使用随附的软件进行定量。tRNA的充电率计算如下：

此处简要介绍了tRNA充电凝胶分析。如图1所示；泳道1含有未处理的来自生长的拟南芥的总RNA ，主要含有带电荷的tRNA。相同的样品按照该方案中的描述进行脱酰基处理，并在泳道2中进行分析。待分析的样品在泳道3中。对应于带电和不带电tRNA的谱带通过参考泳道1和2中的谱带确定。使用ImageJ分析各个波段。一个例子，也可在图中找到URE 5d和5e从阴等。（2019）。

图1. Northern印迹显示带电和未固定的tRNA Trp的分离

菜谱

R. palustris生长培养基（PM培养基）
1 ，000毫升PM
800毫升蒸馏水
25毫升0.5 M Na 2 HPO 4
25毫升0.5 M KH 2 PO 4
10毫升10％（NH 4 ）2 SO 4
1毫升浓缩碱（见下文）
0.1 M Na 2 S 2 O 3· 5H 2 O
2 mg / ml对氨基苯甲酸
带来体积为1 ，000毫升

1 ，000毫升浓碱
20克次氮基ACD （NTA-无酸）
28.9 g无水MgSO 4
6.7克CaCl 2 · 2H 2 O
18.5毫克（NH 4 ）6 Mo 7 O 24 · 4H 2 O
198毫克FeSO 4 · 7H 2 O
100 ml金属44（请参阅下文）
将NTA分别溶于600 ml水中，并用KOH（14.6 g KOH）中和。添加其他成分，并按照给定的顺序溶解。使为1最终体积之前调节pH至6.8 ，000毫升。甲沉淀物，用KOH（需要约100ml 1M的KOH）调节时从6.8的酸性侧pH值，但最终将与搅拌再溶解。当pH接近6.8时，溶液的颜色从深黄色变为稻草色。然后，对过滤器进行消毒，然后将其存储在铝折膜包装的玻璃瓶中。存放在冰箱中。至少一年有效。
1 ，000毫升金属44
2.5克（游离酸，不是钠盐）
10.95 g ZnSO 4 · 7H 2 O
5克FeSO 4 · 7H 2 O
1.54 g MnSO 4 · H 2 O
392毫克CuSO 4 · 5H 2 O
250毫克Co（NO 3 ）2 · 6H 2 O
177 mg Na 2 B 4 O 7 · 10H 2 O
在搅拌下将EDTA加入800毫升蒸馏水中，并用10 M NaOH将pH调节至约5.0，以除去EDTA 。按给定顺序添加其他金属。在上一个组件完全溶解之前，请勿添加组件。然后带来的1的终体积，000毫升（最终pH为2.4左右，明确和石灰绿的溶液）。然后过滤除菌并储存在铝箔包裹的玻璃瓶中。可以无限期保存在复印机中。
酸性尿素凝胶
在50 ml离心管中制成酸性尿素凝胶溶液。50 ml的12％酸性尿素凝胶溶液的配方如下：
22.5克尿素
1.5 ml 3 M乙酸钠，pH 5.2
93.8 µl 0.5M EDTA，pH 8.0
18 ml 30％丙烯酰胺（29：1）
加入无RNase的水，使总体积达到45 ml
加入1毫升10％APS
轻轻颠倒试管进行混合
然后加入20 µl TEMED，轻轻颠倒试管进行混合
立即将溶液倒入凝胶盒中
乙酸钠-EDTA运行缓冲液
如下制备乙酸钠-EDTA运行缓冲液。运行前，应将缓冲液预冷至4 °C 。
100 mM醋酸钠，pH 5.2
1毫米EDTA
乙酸钠-EDTA上样缓冲液
使用以下配方准备乙酸钠-EDTA上样缓冲液：
10毫升无RNase的水
4.8克尿素
20 μ升的0.5M EDTA，pH 8.0中的
33 μ升的醋酸钠，pH 5.2
少量的二甲苯腈和溴酚蓝

致谢

这项工作得到了美国陆军研究办公室授予CSH的W911NF-15-1-0150资助。我们感谢华盛顿大学的小田康弘博士在R. palustris中的广泛RNA工作。我们还要感谢俄亥俄州立大学的Michael Ibba教授对tRNA的出色建议。该协议源自我们先前于2019年发表的工作（Yin等人，2019）。

利益争夺

作者声称没有任何金融或非金融竞争利益。

参考文献

TJ Bullwinkle和M.Ibba（2016）。翻译质量控制对于细菌对氨基酸胁迫的反应至关重要。美国国家科学院院刊113（8）：2252-2257。
Janssen，BD，Diner，EJ和Hayes，CS（2012）。通过凝胶电泳分析氨基酰基和肽基tRNA。方法分子生物学905：291-309。
Yin，L.，Ma，H.，Nakayasu，ES，Payne，SH，Morris，DR和Harwood，CS（2019）。细菌寿命需要蛋白质合成和严格的反应。mBio 10（5）。
金，M 。ķ 。和Harwood，C.S 。（1991）。暗纹假单胞菌中苯甲酸酯-辅酶A连接酶的调控。FEMS微生物学快报83：199-203。
https://www.idtdna.com/pages/education/decoded/article/annealing-oligonucleotides。
https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/run-conditions-denaturing-page。
https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Roche/Bulletin/1/12039672910bul.pdf。