材料和试剂

B细胞的分离与制备
细胞培养板，6孔（Sigma-Aldrich，目录号：SIAL0516-50EA）
培养皿聚苯乙烯（Sigma Aldrich，目录号：P5481）
27号针（G），1毫升注射器（BD Plastipak，目录号301629 ）
猎鹰细胞过滤器40 µm（Thermo Fischer Scientific，目录号：08-771-19）
康宁50毫升离心管（默克（Merck），目录号：CLS430828）
8至12周的雌性C57BL6 / J小鼠
Ficoll-Paque Plus（GE Healthcare，目录号：17-1440-02 ）
RPMI 1640培养基（不含抗生素）（生命技术，目录号：21870076）
热灭活胎牛血清（Thermo Fischer Scientific，目录号：10100139）
来自大肠杆菌O55的LPS ：B5（Sigma - Aldrich，目录号：L 2637-5MG）
绝对乙醇（Sigma - Aldrich，目录号64-17-5）
鼠IL-4（R＆D系统，目录号：404-ML-010）
抗B220-Alexa fluor 488（Biolegend ，克隆RA3-6B2，目录号：103228）
鼠科CXCL12（Preprotech ，目录号：25020-A）
α-Thy1 （NIM-R1）（腹水）
PBS 1x（请参阅食谱）
Hoechst 33342（Thermo Fisher Scientific，目录号：H3570）
大鼠的TI -中号乌斯CD44 APC-Cy7的（BD Biosciences公司，目录号560568）
70％乙醇

LN的IVM
31 G x 8 mm胰岛素注射器（BD超细，目录号：305106 ）
27 G x 13 mm胰岛素注射器（BD Plastipak，货号：301629 ）
PE10聚乙烯管（Clay Adams ，目录号：427401）
肝素钠5 ，000 UI /毫升（PISA 。墨西哥）
盐酸氯胺酮125 mg / kg（墨西哥阿兰达）
赛拉嗪12.5毫克/千克（阿兰达。墨西哥）
氯化钠0.9％（w / v）（PISA 。墨西哥）
PBS 1x（请参阅食谱）

设备

B细胞的分离与制备
解剖工具包8（Fisherbrand ，目录号08-855）
组织培养罩
解剖板

LN的IVM
涤纶线（一纽约品牌）
2个弯曲钳（Moria MC40 / B。11厘米。精细科学工具）
直夹具（微型Serrefine。13毫米。精密科学工具）
夹钳钳子（14厘米，精细科学工具）
弹簧剪刀（3毫米，精细科学工具）
超细剪刀（13毫米，精细科学工具）
有机玻璃定制的动物舞台（图4）
红外线灯
表面灌流系统（组成2大号玻璃具有适于流量阀和一个PE10管瓶）
体视显微镜（Semi 305，蔡司，德国）
配备鹅颈式光导（CL4500，德国蔡司）
立式显微镜（德国蔡司Axioscope A1）
配备10倍和20倍水浸物镜
汞灯（HBO100，卡尔·蔡司）
滤光片（430-465 nm蓝色）
Axiocam （卡尔·蔡司·卡马拉）

软件

Zen Blue Edition（卡尔·蔡司/德国，https://www.zeiss.com）
ImageJ（美国国立卫生研究院，www.imagej.nih.gov）

程序

B细胞纯化
：注乙待涂覆用于与α-Thy1系单克隆抗体腹水1个小时（NIM-R1）（1:10安伏开始培养皿需要，000）（Chayen和帕克豪斯，1982）。
通过颈椎脱位安乐死8-12周的雌性小鼠。将鼠标放在解剖板上。
用70％乙醇彻底浸透小鼠的皮毛。用鼠标将板转移到组织培养罩中。
使脊髓损伤的皮肤切口ssors Ø n中的左侧（从鼠标的角度来看，对寻找到鼠标时，比较图1 ），然后抓住用双手皮肤和拉掉，露出左边脾脏的腹壁（脾脏位于胃和小鼠the膜的左侧之间）（图1 ）。用镊子提起脾脏，并用剪刀小心切除。脾应完整切除。

Figu重新1.参与LN的IVM有关机关的定位的示意图。此处显示的气管可作为颈动脉定位的参考，颈动脉用于后置导管。脾脏的位置显示为在供体小鼠中切除B细胞而切除的。图下部的两个蓝色箭头指向左，左腹股沟LN，这可通过向其附近注射CXCL12来局部激活。两个LN均可用于IVM。

将脾脏浸入培养皿中的10 ml PBS 1x溶液中。
将脾脏置于40 µm过滤器（Falcon细胞过滤器）的顶部，并使用注射器柱塞将其分解，并用最多10 ml PBS 1x洗涤过滤器。将细胞悬液收集在50 ml离心管中。
将细胞悬浮液转移到装有5ml Ficoll-Paque的15ml管的顶部。将细胞悬液缓慢倒在F icoll层的顶部，而不会破坏细胞悬液与Ficoll之间的相间。在室温下以50 xg离心30分钟（加速和减速速率为1或没有制动）。科尔用1个毫升吸管CT薄白细胞层。
将细胞重悬于5 ml PBS 1x中，并在室温下以50 xg离心5分钟，并重复此洗涤步骤，然后在10 ml PBS 1x中收集脾单核细胞（MNC）沉淀。
将细胞悬浮液置于事先用α-Thy1单克隆抗体腹水（NIM-R1）（1 : 10，000）包被1 h的皮氏培养皿中（Chayen and Parkhouse，1982）（如该过程开始时所述））并在37孵育1小时含5％CO 2的C，以允许其他MNC粘附并富集上清液中的B220 +细胞。
1小时后，将培养皿中的上清液小心地转移到15 ml试管中，并在室温下以50 xg离心5分钟两次。然后，倾析沉淀并将其重悬于2 ml PBS 1x中，并使用抗B220单克隆抗体通过流式细胞仪分析种群的纯度。纯度应超过90％（图2 ）。

FIGUR ê 2 。B细胞的富集和刺激。A. B细胞富集后，使用与AF488偶联的针对B220的单克隆抗体，通过流式细胞术评估纯度。典型地，纯度在90％以上，获得利用α-Thy1系一ntibody涂覆培养皿中。B.用LPS和IL-4刺激48小时后，B细胞上的CD44表达增加。

B细胞活化
在6孔细胞培养板的1孔中的2 ml RPMI 1640中刺激2 x 10 6 B细胞，并添加10 µg / ml补充10％的胎牛血清（补充培养基应在室温下）。来自大肠杆菌O55的LPS ：B5和10U / ml的IL-4。
将细胞在37°C和5％CO 2下孵育48小时。
用1 ml移液器回收细胞，上下移液几次以使其重悬，然后用5 ml PBS 1x洗涤细胞两次。（在室温下以50 xg离心5分钟）。然后，将B细胞重悬于15 ml管中的2 ml PBS 1x中。

B细胞标记
在室温下将1 x 10 7个激活的B细胞放入装有30 ml RPMI1640的50 ml管中，不添加任何补充剂，并加入10 µl Hoechst 33342，持续1 h。
注：重新构建赫斯特33342根据制造商'的说明; 分装并储存在-20°C下。
用不含补充剂的RPMI 1640洗涤细胞两次，并在室温下以50 xg离心10分钟。
在Eppendorf管中将细胞重悬于200μlPBS 1x中。将细胞保存在冰上直至用于实验（不超过1小时）。
注意：如图2 B所示，通过流式细胞术测量的LPS刺激后B细胞CD44表达增加的例子（此步骤为可选步骤）。

将CXCL12注入宿主小鼠
抓住鼠标的脖子以处理该过程。
用手指握住鼠标尾巴，将腹股沟LN定位在腹股沟韧带下方和上腹静脉分叉处。注射可以如先前所述进行（Andorko等，2014）。
使用22 G注射器将趋化因子注入200升CXCL12（25 ng / ml）的腹股沟LN区域（给药前，您可以使用解剖显微镜观察LN定位）。
注意：此过程要小心，因为不正确的穿刺会损坏LN，还可能导致血流量改变。
让鼠标休息1小时。

手术期间需要准备导管和注射器
用稀释至最终浓度为500 UI / ml的100μl肝素溶液填充31 G注射器（使用生理盐水稀释肝素）。
切开约15厘米长的PE管。将管的末端切成45 °角（例如注射针头的尖端）。
将另一端插入注射器的针头（使用钳子方便插入）。
吹扫肝素化的导管（确保注射器或PE管中没有气泡）。
除了肝素化的导管，准备用300另一注射器微升麻醉（氯胺酮盐酸盐125毫克/公斤/甲苯噻嗪12.5毫克/千克）在手术期间全身递送附加麻醉。
准备一个额外的31 G注射器。我T将被采用通过导管递送标记的B细胞。

颈动脉导管插入术
要进行手术的地方，请用70％的酒精清洁和消毒。
麻醉小鼠腹膜内（IP）1 0 ml / k g重量的上述麻醉混合物
例如：F或20 g鼠标，注入IP 200μl的麻醉剂混合物。
等待10分钟；通过用镊子捏爪子，在麻醉诱导过程中监测小鼠的疼痛反射。
麻醉后，将鼠标放在其背部；用胶带将爪子固定在背部位置。另外，用位于牙齿后面的5厘米螺纹固定头部，并用胶带将其固定。线的两端应固定在鼠标鼻子的前面（Jacobs和Hopper-Borge，2014）。
ø ptional：Ť如果1个毫升移液管尖端被定位在导管插入术之前鼠标的颈部之下，他的颈动脉可以是更容易获得。
将鼠标放在解剖显微镜下。确保所有所需的材料都可访问。
在下巴下方，做一个小切口，将剪刀放在皮肤和上颌下腺之间的闭合位置，并通过小心地打开剪刀将它们分开；沿颈部皮肤纵向切2厘米。
颌下腺暴露后，通过切割它们之间的结缔组织将它们分开。通过使用2个弯曲的镊子将它们轻轻分开。之后，使用左镊子将肌肉与气管分开，同时将右镊子插入气管旁边，并仔细解剖围绕颈动脉的筋膜。同样，解剖位于动脉旁的迷走神经（这可以完全隔离动脉，避免在插入导管时出现错误）。
切开约8厘米的聚酯线，并用镊子将其弯曲成发夹状，然后将其拉到颈动脉下方，将等分的线留在动脉旁。剪断线，使两个相等的部分位于颈动脉下方。一部分应朝向胸腔，而另一部分应朝向头部（图3A）。
通过将结尽可能紧紧地绑在头上来关闭通向大脑的血流（图3B，红色箭头）。放空线程的两个极端；导管插入后，它们用于以双结固定导管。
朝着胸腔的方向在动脉最远的部分打一个松结（图3B，黑色箭头）。（该结将保持松动，一旦将其插入动脉内，将用于固定和固定导管）。
用左镊子以不变形的方式拉出松散的结，以稍微抬起颈动脉。用右手，用夹子施加器将直的夹子夹在动脉上。该夹子应放置在松结之后（指向胸部）（图3C）。确保留有足够的空间（大约1厘米长），以将导管插入颈动脉。
一旦牢固地放置了夹具，请使用弹簧剪刀在靠近鼠标头部的动脉部分附近做一个小切口（由于该切口，血液会溢出）。
在将导管插入颈动脉的同时，抓住紧结用右手固定动脉。（将导管的尖端朝上插入；这将避免损坏动脉。一旦导管位于内部，请拧紧松开的结以将导管固定到位；将导管的螺纹朝着头部的方向用双结固定（图3D）。
用夹子施加器慢慢释放夹子。血液会侵入导管的内部。如果正确放置，将看到导管内有血液泵入（图3D）（可以通过使用31 G注射器输送少量盐溶液来测试导管的阻塞情况。这是可选步骤）。

图3.颈动脉导管插入术。A.在颈动脉下方绘制发夹状聚酯线：一根线朝向胸腔；另一根线朝向胸部。另一个朝向头部。B.关闭朝向用双结（大脑血流ř编箭头）; 用另一根线打一个松结（b缺少箭头）。C.放置笔直的夹子以闭合动脉。D.导管插入颈动脉；用两个结固定导管，然后从动脉上松开夹子。血液会侵入导管的内部（黑色箭头）。双箭头指示鼠标的方向。

标记的B细胞注射
将标记的B细胞（1 x 10 7细胞/ 200μl ）转移到31 G注射器中。避免注射器中有气泡。
从导管插入的小鼠上拔下肝素化的注射器，并避免用镊子夹住导管，以免抽血。立即插入装有细胞悬液的注射器。
注意：注射前，将细胞恢复到室温。随时避免细胞悬液暴露在光线下。
通过导管缓慢施用细胞悬液。
拔下装有细胞悬液的注射器。和以前一样，立即用镊子停止血液回流，并用麻醉剂混合物塞入31 G注射器。进行10μl麻醉（此步骤有两个作用：维持麻醉和清洗导管）。
在给予B细胞悬液后，等待1小时以允许LN中的B细胞相互作用。
开始将PBS 1x超级融合系统加热到45 °C 。（在此温度下，而PBS 1X被灌流，它被自然冷却至37 ℃，这应该在每一个实验室进行优化）。

腹股沟淋巴结清扫术
施用B细胞30分钟后，检查典当中的疼痛反射，并在必要时进行更多的麻醉。
小心地将鼠标放在动物台上。通过用胶带固定爪子来固定鼠标。注意：我们的动物载物台（图4）设计为充满硅的区域，可以用别针固定缩回的皮肤。先前已经报道了其他选择（Sellers和Payne，2011）。

图4.显微镜设置，超融合系统和定制的动物载物台。超级融合系统由设置在45 °C的热搅拌板组成，用于加热超级融合缓冲液（PBS或0.9％盐水）。在此设置下，缓冲液在37 °C左右到达组织（需要在每个实验室中进行优化）。个在底部的E出口缓冲器烧瓶被连接到一个塑料管，其上固定有常规磁带到20 X物镜的显微镜的。定制的动物舞台长25厘米，宽15厘米。该动物阶段的目的是控制用于润湿暴露组织的PBS流量。此外，它还包含填充有SILIC一点环上瓦特ħ埃雷缩回皮肤可以固定用针（红色箭头）。这个阶段可用于的IVM的LN，提睾肌，和肠系膜。在该图的右下部分，显示了如何将鼠标固定到动物载物台的示例。同样，它举例说明了在IVM之前应如何固定导管以及鼠标的外观。

在解剖显微镜下，在腹腔中切一个小切口，并在闭合位置插入剪刀，从肌肉中分离出皮肤；然后小心地打开它们。将皮肤切口的长度扩大到2厘米，并向四肢对角切开1厘米的皮肤；解剖结缔组织，避免干扰LN。
收回足够的皮肤以观察腹股沟腹股沟淋巴结，并使显微镜的物镜可接触到它。通过使用2个针固定皮肤（图5A）。
用PBS 1x润湿组织并解剖腹股沟LN周围的结缔组织。
使用镊子清除结缔脂肪组织，直到微脉管系统暴露为止。
注意：切勿触摸或操纵脉管系统，这一点很重要。同样，在将皮肤固定到平台上时过分紧张会扰乱血液流动。由于在这种技术中量化了诸如滚动之类的参数，因此保持完整的血流至关重要。如果必要的话再次弄湿的LN（图小号5B和5 ℃）。

图5. LN准备。A和B。用两个销钉（黑色箭头）将腹部皮肤固定在动物阶段。腹股沟淋巴结应该可见（红色箭头）。C.除去周围的结缔组织和脂肪组织后，LN的外观。使用解剖显微镜可以清楚地看到HEV （黑色箭头）。

腹股沟LN的IVM
准备灌注系统，并用胶带将其固定在PE10管的最末端，固定到20倍物镜上。
将动物放在显微镜下并找到腹股沟LN微脉管系统。开始PBS 1x灌注，方法是滴入保持恒定的组织水分和目标浸入。
注：Ç onstant水分可确保正确的对焦视频。
L将所需的微脉管系统区域覆盖起来以进行记录。使用显微镜的430-465 nm蓝色滤光片。所需的记录区域应包含4种不同口径的HEV（图6）。

图6.混合动力汽车的识别。IV表示腹股沟淋巴结中最薄的HEV，而I表示腹股沟LN中最厚的HEV。可以观察到标记的B细胞与HEV相互作用。（客观20x）比例尺50 µm。

在不同的时间点录制4个或更多5分钟的视频
注：中号在整个过程中aintain麻醉。
拍摄记录区域的照片以找到HEV进行后量化（可选）。
这些步骤之后，导出AVI格式的视频和TIFF格式的图像。

数据分析

ImageJ中的数据导出和分析
从显微镜的工作站将AVI格式的视频导出到外部硬盘。
将视频传输到另一台计算机进行进一步分析（这是一个理想的步骤，因为直接从硬盘进行分析会导致系统性能下降）。
启动ImageJ软件。该程序可以从以下链接免费下载：https : //imagej.nih.gov/ij/。
将视频导入ImageJ。将视频更改为8位，并根据物镜和显微镜相机所覆盖的距离设置比例。例如，在我们的条件下，利用20倍的目标，我们的相机时，480个像素对应于712微米（对于该步骤，一个尺度可以简单地通过获取已知尺度的图像中设置）。这是进一步量化的基础。
可以从该技术获得多个数据。在我们的手稿（Giron-Perez等，2020）中，我们量化了以下参数：
HEV直径。这是通过在小静脉上划一条线并进行测量（Ctl -M）来实现的。

招聘的单元（在不同时间点）

细胞通量（1分钟内通过固定点的细胞数）。可以在每个不同的混合动力汽车（I-IV）中量化此参数

贴壁细胞：在一个固定位置贴壁细胞超过30 s

滚动速度：

滚动速度可以是CATEG orized如通过建立≤5的阈值轧制和慢滚动微米/ s到被认为是慢的滚动。
其他IVM参数也可以使用这些实验设置进行量化（Gavins和Chatterjee，2004; Sperandio等，2006; Xu等，2011 ; Lafouresse等，2015; Vadillo等，2019 ）。

菜谱

PBS 1x（1公升）
溶于800毫升蒸馏水：
8克NaCl（0.137 M）
200 mg氯化钾（0.0027 M）
1.44克Na 2 HPO 4 （0.01 M）
240毫克的KH 2 PO 4 （0.0018 M）
将溶液的pH值调整为7.4，并将蒸馏水的最终体积调整为1 L

ACKNOWL EDG Ë发言：

感谢Lenin Estudillo的Hilda Vargas Robles博士提供的专业技术帮助；和CINVESTAV的动物设施的Ricardo Gaxiola -Centeno照顾老鼠。

利益争夺

作者声明没有任何竞争或经济利益。

伦理

严格按照ARRIVE（动物研究：体内实验报告）规则进行这项研究。CINVESTAV的动物护理和使用委员会批准了所有方案和实验。

参考文献

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