图3.培养皿支撑板。ģ小姑娘底部P ETRI菜肴使用定制支撑板压痕测量期间固定装配到显微镜的平移台上的板适配器。钍的电子温度P ETRI菜使用温度控制器，一个热电偶，以及一镍铬合金加热元件调节。
软件

以下软件用作此生物识别协议和数据分析过程的一部分：
尼康NIS-Elements AR成像软件（版本4.30.02）
National Instruments LabView（2014版）
FIJI ImageJ（https://imagej.net/Fiji）（版本1.52g）
Microsoft Excel（Office 365）
OriginPro绘图软件（8.5版）

程序

细胞培养和Acini生长
注意：Zhang等报道了细胞培养方案，细胞系发育和腺泡结构生长的完整描述。（2019）。
按照用于解冻，喂养和传代的标准细胞培养方案培养和维护MDCK II细胞。在潮湿的5％CO 2环境中于37 ° C孵育细胞。该协议的配方部分中提供了细胞培养基成分及其相应浓度。
在进行机械压痕测量之前一周，在8孔腔玻片中诱导MDCK II细胞的腺泡形成。
将Matrigel涂在8孔的Nunc Lab-Tek腔室玻片上，方法是在腔室玻片的每个孔中涂抹40-45 µl的Matrigel。在37 ° C下孵育至少30分钟，或直到凝胶完全固化。
按照标准细胞培养程序胰蛋白酶消化MDCK II细胞。将细胞以125 xg离心15分钟，然后除去上清液。将MDCK II细胞重悬于MDCK acini压痕培养基中。该方案的配方部分中提供了MDCK acini压痕培养基成分及其相应浓度。
用MDCK压痕培养基以〜5,000个细胞/孔的接种密度将MDCK II细胞接种到Matrigel包被的8孔室玻片中。在湿润的5％CO 2环境中于37 ° C孵育室载玻片约7天，或直到MDCK细胞已形成腺腺泡结构。
转移腺泡结构到玻璃底P ETRI菜为压痕测量。
涂覆玻璃底P ETRI盘用0.01重量％的聚-L-赖氨酸。地方200μl的0.01重量％的聚-L-赖氨酸到玻璃底P ETRI培养皿中并让坐在1个小时。除去聚-L-赖氨酸溶液，并用1x PBS溶液冲洗。聚-L-赖氨酸应防止在压痕过程中痤疮结构的任何打滑。
从基质胶生长基质中除去腺泡。在1 ° C PBS溶液中于4 ° C洗涤Matrigel包被的8孔腔玻片中的腺泡。在含有5 mM EDTA，1 mM NaVO 4的1x PBS溶液中孵育包含生长的腺泡的Matrigel包被的8腔室玻片。，以及1.5 mM NaF从腺泡结构中去除Matrigel生长基质。通过在4 ° C下以125 xg离心15分钟，从Matrigel支持基质中分离出腺泡结构。除去上清液，并用在4 ° C下制备的1x PBS溶液冲洗所得沉淀物。再次以125 xg的离心力离心结构15分钟，除去上清液。重悬沉淀成1×PBS中的溶液在4 ° C和腺泡转移到聚-L-赖氨酸包被的玻璃底P在〜1000腺泡/的接种密度ETRI菜肴P ETRI菜。它保持腺泡密度相对低的玻璃中的底部是很重要的P ETRI菜肴，以避免压痕实验期间接触多个腺泡结构。
用钙黄绿素AM染色acini结构，以检查单个acini的活力，并在压痕过程中对acini进行荧光共聚焦显微镜检查。用补充了1：2,000份钙黄绿素AM细胞染料的适当细胞生长培养基替换PBS溶液。在湿润的5％CO 2环境中于37 ° C孵育痤疮20分钟。除去培养基和钙黄绿素AM溶液，并替换为新鲜的细胞培养基。继续在潮湿的5％CO 2环境中于37 ° C孵育杆菌，直到进行压痕实验为止。

仪器设置
安装生物压痕仪和P ETRI盘支撑板到共焦显微镜。生物压痕仪通过冷凝器插槽安装在共焦仪上；将生物压痕仪的安装法兰滑入冷凝器插槽中，并拧紧安装螺钉，直到牢固地安装了生物压痕仪。将P etri皿支撑板放入共聚焦显微镜平移台上的板适配器中。将P etri盘支撑板连接至温度控制器和电源设备，并调整电源设置以保持37 ° C的温度。
在压痕尖端上涂上F-127普朗尼克，以减轻玻璃压痕尖端与acini结构之间的粘附作用。通过从安装螺母上松开安装螺钉，从双叶悬臂梁上卸下压痕尖端。用O 2等离子清洁器等离子清洁压痕尖端1分钟。等离子清洁后，立即将压痕尖端浸入0.1 wt ％F-127普朗尼克溶液中10分钟。用1x PBS溶液冲洗压痕尖端，然后将压痕尖端重新安装到双叶悬臂梁上。
调整电容探头的高度，以确保双叶悬臂梁在电容探头的检测范围内。电容式探头应足够靠近以检测悬臂梁，但又要足够远，以使压痕期间悬臂梁的挠度保持在电容式探头的检测极限之内。
将压痕尖端对准显微镜物镜的中心。从最低幅度的物镜开始，降低压痕尖端并调整物镜焦点，直到压痕尖端处于焦点内。使用XY线性平移台，调整压痕尖端的位置，以使压痕尖端的中心与显微镜视场的中心对齐。将反射滤镜立方体安装到共聚焦显微镜的检测器单元中，然后将反射成像设置加载到NIS-Elements软件中（图2B）。调整共聚焦显微镜的焦平面以找到压痕尖端的顶点。继续将压痕尖端的中心与显微镜视场的中心对齐。
使用逐渐提高的物镜放大倍数重复对准步骤，直到压痕尖端居中位于20x显微镜物镜的正上方。建议在缩进期间使用1.5倍光学变焦功能。将压痕对准显微镜物镜后，从共聚焦显微镜的检测器单元上取下反射率立方体，重新安装438/24滤镜立方体，然后在NIS-Elements软件中选择DAPI / FITC / TRITC成像设置（图2A））。建议此时检查压痕尖端是否有任何可能导致压痕尖端与acini结构之间不规则表面接触的碎屑。
固定玻璃底P上的共焦显微镜的平移台上ETRI菜。放置玻璃底P含有腺泡结构到ETRI盘P ETRI盘支撑板。使用两个安装臂将P etri盘固定到支撑板上。
确定P etri皿的玻璃表面的位置，并将压痕仪的力和位移值清零。导航到P etri盘中央的区域，显微镜视野中没有痤疮。启动压痕软件并将力和位移测量值清零。使用压电z平台将压痕尖端朝着P etri碟的表面驱动100 µm ；此时，压痕尖端不应与表面接触，并且力的测量值应在0 N左右波动。使用聚光镜台的焦距调节手动降低压痕仪，直到压痕尖端与玻璃表面接触可以从测得的力突然而急剧地增加，以及力测量中的噪声降低中看出。一旦与表面接触，请使用聚光镜台的焦距调节缓慢升高压痕仪，直到压痕尖端不再与表面接触，并且测得的力返回到0N。将压痕尖端提高100 µm使用压电z平台。现在，压痕尖端应位于P etri皿的玻璃表面上方约100 µm的位置–足够高，可避免在移动共聚焦显微镜的平移台时与痤疮结构接触，但应足够低以在压痕测量期间实现接触。

Acini结构的机械压痕
进行腺腺体结构的机械压痕，以确定腺体结构发生机械性破坏的平均施加压力。压痕尖端以固定的压痕速率缓慢下降至与单个腺泡结构接触，同时通过细胞的同时荧光成像记录所施加的力。当压入力超过测得力中的背景噪声水平时，观察到的腺泡结构变平坦。进一步增加在腺泡持续变形所施加的力的结果，直到有导致细胞泡和/或细胞的破裂（图的形成的结构坍塌URE 4A）。这些破裂事件在变形腺泡使我们能够查明在该第一破裂事件发生的时间（图11的荧光图像捕获URE 4B）。初始断裂后，压痕尖端会继续推入腺结结构，直到测得的施加载荷达到指定的最大压痕力为止。一旦达到最大压入力，压入尖端将以指定的压入速率拉出结构，返回到起始z位置。要执行acini结构的机械压痕：
找到一个隔离的痤疮结构，并将其在显微镜视场的中心对准压痕尖端的正下方。重要的是，在显微镜的视场内隔离痤疮结构，以避免与其他痤疮结构接触。建议在放置腺泡结构时使用明场成像，以避免腺泡结构长时间暴露于共聚焦激光和荧光染料的光漂白。
Acini结构的未对准可能导致压痕尖端与acini之间的表面接触不规则，导致压痕尖端在acini结构破裂之前与玻璃基板接触，从而导致力测量不正确。力与位移曲线的突然近乎垂直的增加是一个强烈的信号，表明acini结构没有正确地与压痕尖端对齐。
将共焦显微镜的焦平面导航到所需的成像平面以进行压痕测量。它建议编选择一个焦平面接近于腺泡结构的底部完全捕捉期间压痕过程（图4A）的变形; 如果焦平面选择得太高，可能会导致破裂结构在发生破裂事件之前从成像平面中变形出来。
注意：这是可选的，此时执行共焦z扫描以在压痕测量之前捕获acini结构的形状。
准备共焦显微镜用于压痕测量。在共聚焦软件中启动完美聚焦，并调整共聚焦软件的目标区域和捕获延迟，以实现最快的成帧速度。在压痕测量过程中，较高的帧速率将在确定Acini结构的破裂压力时改善时间分辨率。
准备用于压痕测量的压痕仪。在压痕仪软件中，设置压痕率和最大压痕力的参数。我们建议压入速度为0.1 µm / s，最大压入力为100 µN。更快的压痕速率将降低整个测量过程中捕获的荧光图像的时间分辨率。当确定破裂压力时，较慢的压入速度会改善时间分辨率，但会增加实验时间和细胞的激光照射时间。最大压入力应设置得足够高，以使acini结构在达到最大力之前就破裂。根据我们的经验，最大压痕载荷为100 µN，足够高，足以引起痤疮破裂。但是，更高的最大压痕力不会改变测量结果。
同时在共聚焦显微镜上开始对痤疮结构的压痕测量和成像延时。记录压痕测量开始时间和成像延时中的所有差异。

数据分析

一旦压痕完成，从压痕仪测量的法向接触力和荧光图像测得的接触面积就确定了腺泡结构的破裂压力。

使用共聚焦显微镜（图4B）捕获的延时图像确定痤疮结构首次破裂的时间。校正压痕测量的开始时间和共焦延时之间的任何时间差。
在首次观察到破裂事件的时刻测量acini结构的接触面积（图4B）。可以使用NIS Elements软件或FIJI ImageJ来完成。接触面积可以通过在破裂时在acini结构周围绘制最佳拟合圆来测量。
通过破裂时的痤疮结构确定正常的接触力体验。可以使用Microsoft Excel或OriginLabs绘图软件来完成此步骤。将力对时间数据加载到绘图软件中，并在先前确定的断裂时间记录压入力。
根据所测得的接触面积和所测得的法向接触力计算acini结构的破裂压力。球的赫兹接触的平均接触压力为< P > = F / A ，其中F是从压痕仪测得的法向力，A是从共焦图像测得的接触面积。

图4.来自微压痕测量的数据分析。A.生物压痕实验的示意图。选择成像平面靠近Acini结构的底部，以捕获压痕测量过程中的全部变形。B.通过共聚焦显微镜捕获的荧光图像显示整个压痕中的腺泡结构的变形。随着力的增加，可以在随后的帧之间观察到细胞泡的形成和/或细胞的破裂，这表明了腺泡结构的破裂。在给出的示例中，我们观察到t = 812 s时痤疮破裂，这可以通过细胞破裂和钙黄绿素染料释放到周围介质中来看出。在观察到破裂的情况下，通过手动将圆形拟合到痤疮结构来确定接触面积。Ç 。断裂时的压入力由生物压入仪器的力测量值确定。（µN：微牛顿）

讨论区
生物压痕为探索生物材料的材料特性以及细胞系统对外部作用力的集体行为提供了一种手段。通过将机械压痕与荧光图像耦合，我们直接观察到由外部施加的机械力导致的单个腺腺泡结构的变形和破裂。开发该协议是我们探索LINC复合体在腺腺泡结构的发展和维持中所起的作用的一部分（Zhang等，2019）。由具有破坏的LINC复合物的MDCK II细胞形成的Acini在比施加由完整LINC复合物形成的那些更高的施加压力下失效。这些结果似乎与观察到的具有破坏的LINC复合物的腺泡结构中充满的管腔一致。此外，用Y-27632处理LINC破裂的痤疮可将破裂压力恢复到未破裂的水平。
尽管此处介绍的协议侧重于对单个棘突结构进行生物压痕测量，但是可以开发类似的压痕协议来探索各种生物系统。例如，已经使用类似的微压痕方案研究了MDCK单层的弹性模量和渗透性，以及破坏3T3成纤维细胞核包膜所需的最低压力（Schulze等人，2017; Halfmann等人，2019）。此外，可以通过添加第二个称重传感器来测量横向力来研究剪应力和摩擦对生物系统的影响（Urueña等人，2018）。继续探索生物系统对外力和机械排队的反应对理解集体细胞行为和发育生物学至关重要。

菜谱

以下是用于培养MDCK细胞和执行生物识别方案的各种解决方案的配方：
MDCK细胞生长培养基
DMEM培养基
4.5 g / L葡萄糖
10％v / v DBS
MDCK acini压痕介质
DMEM培养基
4.5 g / L葡萄糖
10％v / v供体牛血清
2％v / v Matrigel基质基底膜
基质胶洗涤液
1x PBS溶液
5毫米EDTA
1毫米Na 3 VO 4
1.5 mM NaF
阿奇尼染料培养基
细胞生长培养基
钙黄绿素（1：2000）
F-127普朗尼克解决方案
水
0.1 wt ％F-127普朗尼克

致谢

这里介绍的缩进协议是Zhang等人研究工作的一部分。（2019）。这项工作得到了TP Lele的NIH（授予R01 EB014869）的支持和TE Angelini的NSF （授予DMR-1352043）的支持。作者要感谢Kyle D. Schulze博士和W. Gregory Sawyer博士在开发此协议中使用的微压痕仪方面所做的贡献。作者还要感谢Jennifer Lippencott-Schwart博士慷慨捐赠了MDCK II细胞。

利益争夺

作者没有任何经济利益冲突可宣布。

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