材料和试剂

1.细胞培养皿（60 x 15毫米）（Corning，目录号：CLSE430166）
2. 2毫升玻璃小瓶（安捷伦，目录号：5190-9062）
3. 100毫升玻璃瓶（Therfmo Fisher Scientific，目录号：FSBFB33144）
4. 96孔荧光定量微孔板（Thermo Fisher Scientific，目录号：M33089）
5. 1.5 ml微量离心管（Sarstedt ，目录号：72.690.001）
6. 5 ml，10 ml和25 ml血清移液管（Corning，目录号：CLS4487、4488、4489）
7.带过滤器的移液器吸头（Interpath Services，目录号：24750、24900）
8.猎鹰管，15 ml，25 ml（Corning，目录号：CLS430829，430791）
9. HeLa细胞系（ATCC CCL-2 TM ）
10.荧光脂质定量试剂盒（Cell Biolabs ，Inc.，目录号：STA-617）
11. Dulbecco的改良Eagle's Medium（DMEM）（Gibco ，目录号：11995073）
12.胎牛血清（FBS）（Bovogen ，目录号：FFBS-500）
13.青霉素-链霉素-谷氨酰胺（100 x ）（Gibco ，目录号：10378016）
14. DPBS，无钙，无镁（Gibco ，目录号：14190250）
15.来自牛血清的油酸-白蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：O3008-5ML）
16.甲醇（Univar，目录号：AJA2314-2.5LGL）
17.己烷（VWR International，目录号：VWRC24577.323）
18.氯仿（澳大利亚Chem -supply Pty Ltd，目录号：RP1027E-G2.5L）
19.异丙醇（Unichrom ，目录号：2323-2.5GL）
20.氢氧化钠（Univar，目录号：AJA482-500G）
21.用于蛋白质测定的双辛可宁酸试剂盒（Sigma-Aldrich，目录号：BCA1-1KT）
22.氯化钠（Chem- Supply，目录号：SA046-500G）
23. TRIS（羟甲基）氨基甲烷（Univar的，目录号：1.08382.0500）
24.牛血清白蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：A1933）
25.缓冲区A（请参阅食谱）
26.缓冲区B（请参阅食谱）

设备

生物安全柜（NuAire ，型号：5437-400E）
CO 2培养箱（粘合剂，型号：CB 150）
通风柜（Dynaflow ，型号：FC1800 ）
加热块（Labnet International，型号：D1100）
涡旋混合器（Ratek ，型号：IC-VM1）
POLARstar Omega酶标仪（BMG Labtech ，目录号：415-0704）
水浴锅（Ratek ，型号：IC-WB1200D）
程序

细胞培养
将HeLa细胞接种在6厘米培养皿中（每个培养皿5 x 10 5个细胞），放入3 ml的DMEM中，添加10％FBS和1 x青霉素-链霉素。
在37孵育细胞在5％的CO 2加湿培养箱中于24 °C下放置24 ℃。
通过将0.24 ml的原液（3.3 mM ）添加到1.76 ml的培养基中，用来自牛血清的400 µM的油酸-白蛋白处理细胞。

脂质提取
用2 ml缓冲液A清洗培养皿中的细胞两次。
用缓冲液B洗涤细胞一次。
用移液器吸头吸去缓冲液残留物。
向每个培养皿中加入2 ml的己烷-异丙醇（3：2），并在带盖的通风橱中于室温下孵育30分钟。
注意：己烷和氯仿对呼吸有害。因此，这些试剂的处理应在安全通风到实验室外部的化学通风橱中进行。
将每个皿中的有机溶剂转移到2 ml玻璃小瓶中。
用1毫升相同的溶剂短暂冲洗每个培养皿，然后合并到同一玻璃瓶中。小心除去所有有机溶剂，并保存培养皿以进行蛋白质测定。
通过使小瓶在通风橱中保持不开盖的状态，将溶剂蒸发到通风橱中干燥（大约需要16小时）。

蛋白质测定
向原始细胞培养皿中加入1 ml的0.1 M NaOH水溶液，并通过上下吹打溶解细胞残余物。
取出一式两份的20 µl等分试样，并在20 µl水中稀释以进行BCA测定，以确定每个培养皿中的总蛋白质（每次测定的蛋白质量x 50）。每盘的典型的蛋白产量为500 - 600微克。

使用Cell BioLabs的试剂盒＃STA-617进行脂质定量和改进
在100 ml玻璃瓶中将50 ml甲醇与25 ml氯仿混合。存放在室温下。
彻底重悬从每个所提取的TAG样品步骤B7，在使用涡旋混合器以高速进行30秒加盖玻璃小瓶加入200μl甲醇/氯仿混合物中。涡旋后放在冰上。
在甲醇/氯仿混合物中制备脂质标准品的系列稀释液，浓度范围为0至5 µg / µl（表1）。在进一步稀释之前，将每个标准品充分混合。
表1.连续稀释的脂质标准品

管号
甲醇/氯仿混合物（微升）
脂质标准
（微升）
最终浓度
（微克/微升）
1个
390
10微升x 200微克/微升
5
2
200
200＃1
2.5
3
200
200名＃2
1.25
4
200
200名＃3
0.625
5
200
200名＃4
0.3125
6
200
第5名的200名
0.15625
7
200
第6名的200名
0.078125
8
200
0
0

将一式两份的40 µl标准品或TAG样品加至96孔微孔板中，以进行基于荧光的测定。
通过将板在设定为55 °C的加热块顶部温育30分钟或直至在安全化学通风橱中变干来蒸发有机溶剂。
在37 °C水浴中加热100 x荧光试剂储液直至融化。
通过在50 ml猎鹰管中将0.5 ml解冻的100 x原液添加到49.5 ml水中，制备1 x荧光试剂。
将96孔板在冰上冷却2分钟。
将40 µl异丙醇加入标准品或TAG样品中。轻轻地上下移液，以混合各孔。
向每个孔中加入200 µl 1 x荧光试剂。
在室温下于黑暗中孵育平板10分钟。
用POLARstar Omega微孔板读板器在490 nm激发和585 nm发射下读取板。

数据分析

通过相对于相对荧光单位（RFU）绘制脂质标准液的量来生成标准曲线。带有方程式的标准曲线示例如图1所示。

图URE 1.荧光为TAG定量标准曲线

使用标准曲线图（图1）中所示的公式计算96孔板每个样品孔中TAG的数量。
通过在样品中有五个TAG的量乘以以及计算TAG的从每个样品的总量（因为40微升出200微升每测定孔）。表2显示了每6厘米培养皿中HeLa细胞的TAGs和蛋白质的典型产量（约90％融合）。

表2.每道HeLa细胞培养皿中TAG和蛋白的产量

TAG（微克）
总蛋白（毫克）
TAG /蛋白质（µg / mg）
控制

14.361
0.530319
27.07994
15.739
0.602128
26.13897
15.027
0.580515
25.88562
16.311
0.562389
29.00307
11.937
0.487094
24.50657
17.485
0.574241
30.4489

样品＃1

55.519
0.634895
87.44597
39.329
0.616071
63.8384
37.483
0.590276
63.50083
41.503
0.586093
70.81303
38.221
0.552628
69.16222
41.447
0.581212
71.31127

用步骤C中确定的蛋白质总量对TAG总量进行标准化（表2）。甲的最终结果N实施例示于图2。

图URE在HeLa细胞中TAG 2量（控制组。样品＃1）确定由所述荧光测定法

菜谱

缓冲液A
150毫米氯化钠
50 mM的Tris-HCl ，pH 7.4
2 mg / ml牛血清白蛋白
缓冲液B
150毫米氯化钠
50 mM的Tris-HCl ，pH 7.4

致谢

这项工作得到了澳大利亚国家卫生与医学研究委员会（APP1041301、1141939和114472）的项目拨款的支持。
该协议中描述的TAG提取程序改编自定义明确的早期方法（Goldstein等，1983）。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考文献

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