材料和试剂

白色，经组织培养处理的（TC）96孔板（Corning，目录号：3917）
非结合V型底板（用于连续稀释；例如，Costar，目录号：3896）
处理过的组织培养（TC）烧瓶（生长面积150或75 cm 2 ；F al con ，目录号：355001或353107）
HEK293细胞
0.05％胰蛋白酶/ EDTA（生命技术，目录号：25300）
Dulbecco的改良Eagle培养基（DMEM）（生命技术，目录号：11995）
胎牛血清（FBS）（HyClone ，目录号：SH30070.03）
100 x青霉素链霉素（Sigma，目录号：P4333）
不带酚红的Opti-MEM（生命技术，目录号：11058）
的FuGENE HD（Promega公司，目录号：E2311）或ViaFect （Promega公司，目录号：E4981 ）注：ø疗法的转染，也可以使用的试剂。
DMSO （Sigma，目录号：D2650-5X5ML）
示踪剂稀释缓冲液（Promega，目录号：N2191）
Nano-Glo HiBiT胞外检测系统（Promega，目录号：N2420或N2421 ）
转染载体DNA（Promega，目录号：E4881）
感兴趣的测试化合物
编码HiBiT标记GPCR融合的DNA构建体
注意：HiBiT标记的GPCR构建体可以从Promega Custom Assays Systems获得，也可以通过克隆到pFN39K secHiBiT CMV-neo Flexi载体（Promega，目录号：N2411）或pBiT3.1-secN [CMV / HiBiT / Blast]载体（Promega ，目录号：N2381）
荧光示踪剂
注：小号everal NanoBRET GPCR示踪剂Promega的定制检测系统获得。此外，可以使用可从Promega Custom Assays Systems获得的构件根据已发布的方案（Robers等，2019）生成荧光GPCR示踪剂。
其他组织培养试剂
DMEM细胞培养基（请参阅食谱）
Opti-MEM测定培养基（请参见配方）

设备

BRET兼容微孔板光度计装有450纳米（带通）和600纳米（长通）滤波器（例如，Promega公司GloMax查询，珀金埃尔默的EnVision ，或BMG Clariostar ）
轨道振动筛
杂项组织培养设备

软件

GraphPad Prism（https://www.graphpad.com/scientific-software/prism）

程序

瞬态牛逼HEK293的ransfection Ç厄尔与HiBiT -牛逼agged GPCR Ç onstructs
注意：建议使用以下所述的转染条件，以使HiBiT标记的GPCR充分转移并在细胞表面表达。这些包括：
将编码HiBiT标签的GPCR的DNA稀释为无启动子的载体DNA。这样可以保持转染DNA的总量，但可以降低整个转染细胞群体的表达水平。通常建议稀释100倍，但是在某些情况下可能需要进一步优化。
DNA：Ť ransfection试剂复合物应占10％（体积/体积）转染的细胞培养物。

先在TC-75或TC-150烧瓶中于培养基（配方1）中培养HEK293细胞或进行测定。
注意：收获时的细胞密度会影响转染能力。为了获得最佳的转染能力使用新鲜传代HEK293细胞（内理想地1 - 2天），在80 - 95％的汇合。
从烧瓶中吸出培养基，分别向TC-75或TC-150烧瓶中加入5 ml或8 ml胰蛋白酶，并使细胞从烧瓶中解离。
使用20 ml或25 ml培养基（分别用于TC-75或TC-150）中和胰蛋白酶，并通过以200 xg离心5分钟沉淀细胞。
使用Opti-MEM分析培养基（配方2）将培养基吸出并将细胞重悬至单个细胞悬液中。
在无菌锥形管中的Opti-MEM分析培养基中，将细胞密度调整为2.2 x 10 5细胞/ ml。
准备转染试剂：DNA复合物。
以下是10 ml培养物转染的示例：
在没有血清的Opti-MEM中制备10 µg DNA溶液。该溶液应包含以下比例的载体DNA和编码带有HiBiT标签的GPCR构建体的DNA ：
9.9 µg / ml的转染载体DNA 。
0.1 µg / ml编码带有HiBiT标签的GPCR的DNA （稀释100倍）。
0.5 ml不含血清的Opti-MEM 。
彻底混合。
结合30微升转染试剂（即，的FuGENE HD或ViaFect ）与0.5ml的Opti-MEM无血清和通过移液混合。
注意：如果使用其他转染试剂，请遵循制造商的建议。
合并DNA和转染试剂溶液，并通过移液10-15次进行混合。
在室温下孵育15分钟，以使转染试剂，DNA复合物形成。
以2.2 x 10 5个细胞/ ml的悬浮液合并一份（例如1 ml）转染试剂：DNA复合物与9份（例如9 ml）HEK293细胞。颠倒5次，轻轻混合，然后以95 µl /孔的速度在白色的经过TC处理的96孔板上进行平板培养。
注意：应使用此比率相应地缩放较大或较小的批量转染。
在37孵育至少20小时 °C + 5％CO 2 。

NanoBRET GPCR-升igand Ë ngagement p rotocols

饱和度b inding一个的BB luorescent牛逼赛车的HiBiT -牛逼agged GPCR
用荧光示踪剂的系列稀释液处理细胞。
制备20 X系列稀释示踪。
首先准备一个100 X连续稀释Tracer在DMSO中。准备从300 µM开始的3倍系列稀释液，这对应于最终的1 x 3 µM浓度。在某些情况下，较高或较低的示踪剂浓度可能会提供更好的测定窗口。
注意：确保在系列稀释液中没有示踪剂对照。
在没有酚红的Opti-MEM中将示踪剂稀释缓冲液（TDB）稀释3倍，以生成0.3 x TDB。
在0.3 x TDB中将100 x连续稀释的Tracer稀释5倍，以生成20 x连续稀释的Tracer。
每转染细胞的孔中加入5 µl 20 x连续稀释的示踪剂（图2描绘了96孔板的设置）。
在轨道振动筛上短暂混合。
为了确定特异性结合，用过量的未修饰化合物处理对照细胞。
制备20 X未修改化合物溶液。
在没有酚红的Opti-MEM中制备10％（vol / vol）的DMSO溶液。
在10％DMSO中制备600 µM未修饰的化合物溶液，该溶液对应于最终的1 x 30 µM浓度。
向对照孔中加入5 µl 20 x未修饰的化合物溶液（图2描绘了96孔板的设置）。
在轨道振动筛上短暂混合。
在避光条件下于室温下孵育板90分钟（以最大程度减少受体内在化），然后进行下面的NanoBRET检测部分。
注：激动剂结合促进受体内在化到不同的程度，这可以通过剂量依赖性癸被检测ř便于供体信号（例如，在450nm处的信号）。尽管如此，在室温（22-25 °C ）下的结合实验仍会降低内在化的速度，而BRET的比例性质进一步最小化了内在化对结合分析的影响。因此，在37 °C下进行结合分析可能需要更短的孵育时间。

图2.用于饱和结合测定的96孔板设置。在不存在和存在（未控制）过量未修饰化合物的情况下，用荧光示踪剂进行系列稀释处理的细胞。

检测NanoBRET
在进行BRET测量之前，立即在没有酚红的Opti-MEM中制备2 x HiBiT检测试剂。该试剂由LgBiT的100倍稀释液和Nano - Glo HiBiT细胞外底物的50倍稀释液组成。通过移液彻底混合。
每孔加入100 µl检测试剂。
在轨道平板振荡器上混合15分钟。
使用兼容NanoBRET的发光计测量供体发射（例如450 nm）和受体发射（例如610 nm或630 nm）。
确定BRET比率和过程数据。
为了产生原始的BRET比率值，将受体发射值（例如610nm）除以供体发射值（例如450nm）。
转换原始BRET单位毫BRET单位（MBU通过1每个原始BRET值乘以），000 NanoBRET方程：
BRET（MBU ）=（受体样品/供体样品）×1 ，000
通过在不存在过量未修饰化合物的情况下从BRET值中减去BRET值来确定特定的BRET。
具体BRET（MBU ）= BRET示踪- BRET示踪+未修饰的化合物
积在数据使用日志（激动剂）与响应可变斜率拟合的GraphPad Prism软件及确定用于示踪（EC表观亲和力50 ）（参见图URE小号3甲和3对于B代表分析）。
使用GraphPad Prism中的特殊计算“查找所有EC”来确定EC 60 -EC 80 。
使用一个位点特异性结合拟合在GraphPad Prism软件中绘制特异性结合数据，并确定结合常数（K D ）（代表性分析请参见图3C ）。

图3 。对于NanoBRET GPCR示踪G-3饱和结合来瞬时代表分析表达HiBiT -β 2 -AR。表达HEK293细胞HiBiT -β 2在协议中所示-AR进行测定。简而言之，在存在或不存在30 µM普萘洛尔的情况下，将细胞转染，生长过夜，然后第二天用连续稀释的NanoBRET GPCR示踪剂G-3（即，先前描述的普萘洛尔-BODIPY （Boursier等，2020 ））处理。结合90分钟后，加入HiBiT检测试剂，并将细胞再孵育15分钟。使用配备有450 nm（8 nm带通）滤光片（施主）和600 nm长通滤光片（受主）的GloMax Discover酶标仪（Promega）来测量滤光片的发光度（n = 3；误差线表示SD ）。A.在存在和不存在过量普萘洛尔的情况下结合，B。特异性结合，以及C.在非对数尺度上的特异性结合。

有竞争力的d一的isplacement ˚F luorescent吨由赛车手ü n修改Ť EST Ç ompound
1.用固定浓度的荧光示踪剂处理细胞。
一种。准备20 x示踪剂溶液。
使用上述示踪剂饱和结合分析，在EC 60至EC 80值之间选择了固定浓度。
首先在DMSO中准备200 x Tracer解决方案。
在没有酚红的Opti-MEM中将示踪剂稀释缓冲液（TDB）稀释3倍，以生成0.3 x TDB。
在0.3 x TDB中将200 x Tracer稀释10倍，以生成20 x Tracer解决方案。
b。每转染细胞的孔中加入5 µl 20 x示踪剂溶液（图4描绘了96孔板的设置）。
C。在轨道振动筛上短暂混合。
2.用系列稀释的未修饰测试化合物处理细胞，
制备20 X系列稀释未修饰的测试化合物。
在没有酚红的Opti-MEM中制备10％（vol / vol）的DMSO溶液。
制备20 X在10％DMSO系列稀释的未修饰的测试化合物。准备从600 µM或200 µM开始的3倍系列稀释液，这对应于最终1x浓度为30 µM或10 µM。
根据测试化合物的结合亲和力，可能需要进一步优化系列稀释范围。
注意：确保在系列稀释液中包括无测试化合物的对照。
每转染细胞的孔中加入5 µl 20 x系列稀释的未修饰测试化合物（图4描绘了96孔板的设置）。
在轨道振动筛上短暂混合。
在室温下孵育板（以最大程度减少受体内在化），避光放置90分钟，然后进行下面的NanoBRET检测部分。
注意：在37 °C下进行结合分析可能需要更短的孵育时间。

图4.用于竞争结合测定的96孔板设置。在固定浓度EC 60 - EC 80的荧光示踪剂存在下，用未稀释的测试化合物进行系列稀释的细胞。

3.检测NanoBRET
在进行BRET测量之前，立即在没有酚红的Opti-MEM中制备2 x HiBiT检测试剂。该试剂由LgBiT的100倍稀释液和Nano - Glo HiBiT细胞外底物的50倍稀释液组成。通过移液彻底混合。
每孔加入100 µl检测试剂。
在轨道平板振荡器上混合15分钟。
使用兼容NanoBRET的发光计测量供体发射（例如450 nm）和受体发射（例如610 nm或630 nm）。
4.确定BRET比率和过程数据。
为了产生原始的BRET比率值，将受体发射值（例如610nm）除以供体发射值（例如450nm）。
转换原始BRET单位毫BRET单位（MBU通过1每个原始BRET值乘以），000 NanoBRET方程：
BRET（MBU ）=（受体样品/供体样品）×1 ，000
使用对数（抑制剂）对响应变量的斜率拟合在GraphPad Prism软件中绘制数据，并确定测试化合物的IC 50 （参见图5进行代表性分析）。
使用IC 50值，根据Cheng- Pursoff方程（Cheng和Prusoff，1973）计算待测化合物（Ki）的结合常数，其中[L]是测定中荧光示踪剂的浓度，K D是其在色谱图中的亲和力。从上面进行饱和结合实验。
K i =（IC 50 ）/（1 +（[Tracer] / K D ）

图5.为NanoBRET GPCR示踪G-3代表分析位移从瞬时表达HiBiT -  2 -AR普萘洛尔。表达HEK293细胞HiBiT -  2在协议中所示-AR进行测定。简而言之，将细胞以最终的EC 80浓度转染，过夜生长，第二天用普萘洛尔滴定与NanoBRET GPCR示踪剂G-3（即，先前描述的普萘洛尔-BODIPY （Boursier等，2020））一起处理。结合90分钟后，加入HiBiT检测试剂，并将细胞再孵育15分钟。使用配备有450 nm（8 nm带通）滤光片（施主）和600 nm长通滤光片（受主）的GloMax Discover酶标仪（Promega）来测量滤光片的发光度（n = 4；误差线表示SD）。

结合ķ一个的inetics ˚F luorescent吨赛车到HiBiT -吨agged GPCR
注意：为了最小化时间间隔并更好地捕获快速结合，建议将测试的示踪剂浓度数限制为4或5（图6描绘了板的设置）。
用检测试剂处理细胞。
在没有酚红的Opti-MEM中准备2个HiBiT检测试剂。该试剂由100倍稀释的LgBiT和50倍稀释的纳米格洛HiBiT细胞外基质。移液10-15次，充分混合。
每孔加到含有转染细胞95 µl检测试剂的平板中，并在定轨平板振荡器上混合。
用过量的未修饰化合物预处理对照孔。
注意：为进行背景校正，请在对照孔中进行预处理（图6描绘的是板的设置），并添加过量的未修饰化合物以阻止示踪剂结合。
准备20倍过量的未改性化合物溶液。
在没有酚红的Opti-MEM中制备10％（vol / vol）的DMSO溶液。
在10％DMSO中制备600 µM未修饰的化合物溶液，该溶液对应于最终的1 x 30 µM浓度。
向对照孔中加入10 µl 20 x过量的未修饰化合物溶液。
在轨道振动筛上短暂混合。
再轻轻混合15分钟，以进行HiBiT / LgBiT互补。
用连续稀释的荧光示踪剂处理细胞。
在15分钟温育制备20 X系列稀释荧光示踪剂。
注意：建议使用10 x EC 50作为最高最终浓度。
首先准备一个100 X连续稀释Tracer在DMSO中。从2倍或3倍系列稀释液开始，并将稀释液数量限制为4或5，以最大程度减少两次读取之间的时间间隔。
在没有酚红的Opti-MEM中将示踪剂稀释缓冲液（TDB）稀释3倍，以生成0.3 x TDB。
在0.3 x TDB中将100 x连续稀释的Tracer稀释5倍，以生成20 x连续稀释的Tracer。
在动力学测量之前，每转染细胞每孔立即添加10 µl 20 x连续稀释的示踪剂。
在轨道平板振荡器上短暂混合，并在与NanoBRET兼容的发光计上开始动力学读数，测量供体发射（例如450 nm）和受体发射（例如610 nm或630 nm）。要捕获快速绑定，请在两次读取之间使用0分钟间隔。

图6.用于荧光示踪剂结合动力学的96孔板设置。（4用荧光示踪的限制连续稀释处理的细胞-在不存在和存在（对照孔）过量未修饰的化合物的5种浓度）。

确定BRET比率和过程数据。
一种。为了产生原始的BRET比率值，将受体发射值（例如610nm）除以供体发射值（例如450nm）。
b。转换原始BRET单位毫BRET单位（MBU通过1每个原始BRET值乘以），000 NanoBRET方程：
BRET（MBU ）=（受体样品/供体样品）×1 ，00 0
C。通过在不存在过量未修饰化合物的情况下从BRET值中减去BRET值来确定随时间变化的特定BRET。
d。使用两个或更多个热拟合浓度的缔合动力学在GraphPad Prism软件中绘制数据，并确定示踪剂的动力学常数（k on和k off ）和结合常数（K D ）（代表性分析请参见图7 ）。
e。计算停留时间（ ）为1 / k off 。

图7.代表性分析结合动力学的NanoBRET GPCR示踪G-3至瞬时表达HiBiT -  2 -AR。表达HEK293细胞HiBiT -  2在协议中所示-AR进行测定。简而言之，将细胞转染，生长过夜，并在第二天用HiBiT检测试剂预处理15分钟，然后再滴定NanoBRET GPCR示踪剂G-3（即先前所述的普萘洛尔-BODIPY （Boursier等， 2020年））。使用配备450 nm（8 nm带通）滤光片（施主）和600 nm长通滤光片（受主）的GloMax Discover Microplate Reader（Promega）进行过滤后的发光的动力学测量（n = 3；误差线表示SD ）。

有竞争力的b inding ķ inetics为Ü n修改Ť EST Ç ompound到HiBiT在-标记的GPCR p的resence ˚F luorescent吨赛车
注意：为了最小化时间间隔并更好地捕获快速结合，建议将测试的未修饰化合物浓度的数量限制为4或5（图8描绘了板的设置）。
用检测试剂处理细胞。
在没有酚红的Opti-MEM中准备2个HiBiT检测试剂。该试剂由100倍稀释的LgBiT和50倍稀释的纳米格洛HiBiT细胞外基质。移液10-15次，充分混合。
每孔加到含有转染细胞95 µl检测试剂的平板中，并在定轨平板振荡器上混合。
用过量的未修饰化合物对预处理进行良好的控制。
注意：要进行背景校正，请在对照孔中进行预处理（图8描绘的是板的设置），并用过量的未修饰化合物阻断示踪剂/测试化合物的结合。
准备20倍过量的未改性化合物溶液。
在没有酚红的Opti-MEM中制备10％（vol / vol）的DMSO溶液。
在10％DMSO中制备600 µM未修饰的化合物溶液，该溶液对应于最终的1 x 30 µM浓度。
向对照孔中加入10 µl 20 x过量的未修饰化合物溶液。
在轨道振动筛上短暂混合。
再轻轻混合15分钟，以进行HiBiT / LgBiT互补。
用固定浓度的荧光示踪剂和系列稀释的测试化合物处理细胞。
在15分钟的孵育过程中，准备20 x固定浓度的示踪剂和系列稀释的测试化合物
准备20 x荧光示踪剂溶液。
使用町上述示踪饱和结合分析ö的EC之间知的固定浓度60至EC 80值。
首先在DMSO中准备200 x Tracer解决方案。
在没有酚红的Opti-MEM中将示踪剂稀释缓冲液（TDB）稀释3倍，以生成0.3 x TDB。
在0.3 x TDB中将200 x Tracer稀释10倍，以生成20 x Tracer解决方案。
准备20 x连续稀释的未修饰测试化合物。
注意：建议使用5-10 x K I作为最高最终浓度。
在没有酚红的Opti-MEM中制备10％（vol / vol）的DMSO溶液。
制备20 X在10％DMSO系列稀释的未修饰的测试化合物。从2到3倍系列稀释液开始，并将稀释液数量限制为4或5，以最大程度减少两次读取之间的时间间隔。
注意：确保在系列稀释液中包括未经修饰的测试化合物对照。
在动力学测量之前，立即添加每孔11微升的20 x连续稀释的未修饰测试化合物和每孔11微升的20 x示踪剂溶液。
在轨道平板振荡器上短暂混合，并在与NanoBRET兼容的发光计上开始动力学读数，测量供体发射（例如450 nm）和受体发射（例如610 nm或630 nm）。要捕获快速绑定，请在两次读取之间使用0分钟间隔。

图8.用于竞争结合动力学的96孔板设置。与未改性的测试化合物的限定系列稀释处理的细胞（4 - 5个浓度包括“0”未修饰的测试化合物）中的荧光示踪剂在固定EC60存在- EC80浓度。用额外过量的未修饰化合物处理的对照孔。

确定BRET比率和过程数据。
为了产生原始的BRET比率值，将受体发射值（例如610nm）除以供体发射值（例如450nm）。
转换原始BRET单位毫BRET单位（MBU通过1每个原始BRET值乘以），000 NanoBRET方程：
BRET（MBU ）=（受体样品/供体样品）×1 ，000
通过在不存在过量未修饰化合物的情况下从BRET值中减去BRET值来确定随时间变化的特定BRET。
积在数据的GraphPad使用动力学竞争性结合配件（Prism软件Motulsky -Mahan模型结合竞争动力学（Motulsky和马汉，1984）），其采取小号在帐户中的示踪剂的浓度以及其ķ上和ķ off值（代表性分析请参见图9 ）。
确定测试化合物的动力学常数（k on和k off ）。
计算未修饰化合物（K D ）与未修饰测试化合物（K off / k on ）的结合常数和停留时间（ ）为1 / k off 。

图9.代表分析结合普萘洛尔以瞬时的动力学表示HiBiT -  2在NanoBRET存在-AR GPCR示踪G-3。表达HEK293细胞HiBiT -  2在协议中所示-AR进行测定。简而言之，将细胞转染，生长过夜，第二天用HiBiT检测试剂处理15分钟，然后进行普萘洛尔滴定和固定的EC 80浓度的NanoBRET GPCR示踪剂G-3（即先前所述的普萘洛尔-BODIPY （Boursier等人，2020））。使用配备450 nm（8 nm带通）滤光片（施主）和600 nm长通滤光片（受主）的GloMax Discover Microplate Reader （Promega）进行过滤后的发光的动力学测量（n = 3；误差线表示SD ）。

菜谱

DMEM细胞培养基
成分终浓度
DMEM 90％
胎牛血清10％
100 x青霉素链霉素1％（1 x ）
Opti-MEM测定培养基
成分终浓度
没有苯酚红的Opti-MEM 98％
胎牛血清2％
100 x青霉素链霉素1％（1 x ）

致谢

该方案源自Boursier等人的工作，该工作发表在《生物化学杂志》上（Boursier等人，2020年）

利益争夺

在开发协议时，所有作者均为Promega员工。

参考文献

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