材料和试剂

HPLC级甲醇（Fisher Chemical，目录号：A452-4）
HPLC用水CHROMASOLV TM （霍尼韦尔Riedel-de Haen TM ，Fisher Chemical，目录号：60-048-247）
FlowLogic U闪烁鸡尾酒（LabLogic ，目录号：SG- BXX -05）

设备

HPLC设备：Agilent 1260 Infinity II高效液相色谱系统
流射探测器：LabLogic β -RAM 6
Thermo Scientific Accucore C18色谱柱；3×150毫米，2.5微米球形固体芯颗粒。（Thermo Fisher，目录号：17126-153030）
Accucore C18保护柱; 3×10毫米，2.6微米的球形固体芯颗粒（热费舍尔，目录号：17126-013005）

软件

LabLogic Laura版本6.0.1.40
GraphPad Prism版本8.1.2（332）

程序

样品p赔偿
使用基于时间的馏分收集方法，通过正相HPLC方法从叶脂提取物中分离出MGDG，如Zhou等人的方法。（2020），或通过薄层色谱法（Karki等，2019）。
在温和的N 2流下干燥收集的MGDG馏分。
将分离的MGDG溶解在小体积（例如25 µl）HPLC级甲醇中，以通过Radio-HPLC分析。图1中所示样品分析的进样溶剂体积为10μl ，每次进样的总放射性约为每分钟17,500崩解度（DPM）。对于MGDG分子种类的分析，理想的是，每次向HPLC中注入最小量的溶剂，其总MGDG放射性至少为5,000 DPM。
将甲醇中的MGDG转移到带有少量插入物的自动进样器样品瓶中，以进行HPLC分析。弹簧底部插入件非常适合小体积（10-100 µl）的样品，几乎可以注入所有样品。

反相放射HPLC- 14 C MGDG分子种类分析
接通HPLC模块的电源；泵，自动进样器，多柱室，紫外线二极管阵列检测器（UV-DAD）和流量无线电检测器。
HPLC参数和在线液体闪烁计数器均由LabLogic Laura软件控制。
在Laura中用空白甲醇设置序列，作为序列中的第一个样品。开始分析前，让色谱柱平衡20分钟。由于该方法使用等度条件，因此在每个样品之间无需进行柱平衡。
保存序列后，将加载分析方法。HPLC分析的方法条件如下：
四元泵：溶剂A：甲醇，溶剂B：水。该方法使用流动相的等度洗脱– 95％A / 5％B。流量设置为0.35 ml / min，运行时间为35分钟。
自动进样器：自动进样器温度设置为20°C。样品进样溶剂：甲醇。将方法中的注射器设置如下：抽针速度- 200微升/分，针弹出š小便- 400微升/分钟，拉伸后的等待时间- 1.2秒。
多柱温箱：柱温箱的温度设置为35°C。在进入色谱柱之前，允许流动相通过快速连接热交换器。紧接分析柱之前，安装了一个短的10 mm保护柱，其中包含与固定相相同的材料。
UV-DAD：将洗脱液从色谱柱流向UV-DAD。如图1A和原始研究论文（Zhou et al。，2020），补充图S4A所示，样品在210 nm处的UV吸收将为样品中包含不饱和酰基链的分子提供显着的质量丰度。
β-Ram6无线电探测器：将洗脱液从UV-DAD引到无线电探测器。将分析类型设置为不间断HPLC。无线电检测器配备有500微升促进所述无线电计数过程可调体积流动池。设置流动池体积到300微升。在进入流通池之前，将来自UV-DAD的洗脱液与闪烁混合物混合，该混合物的流量由闪烁泵控制。将闪烁剂流量设置为1.05 ml / min（洗脱液：闪烁混合物的比例为1：3 ）。对于这些流量设置，在流通池中的最终停留时间为12.9 s。流量计数的建议停留时间大于5 s。将来自放射检测器的与闪烁剂混合的洗脱液引导至固定在辅助废物容器中的，正确标记的放射性HPLC废物容器。在该方法中，如下调整无线电1通道的检测器设置：测量单位– CPM，停留时间– 1 s，移位时间– 0 s，下限– 200，上限– 9000。
HPLC数据采集完成后，继续进行数据分析。

图1. HPLC分析-野生型烟叶中的MGDG分子种类连续用[ 14 C]乙酸酯标记2 h。A. 210 nm处的UV色谱图。B.放射性每分钟计数（CPM）。来自B的单个分子种类的标识如下：1-18：3/16：3，2-18：3/16：2> 18：2/16：3，3-18：3/18：3，4 -18：2/16：2> 18：3/16：1、5-18：3/18：2、6- 18：2/16：1、7-18：3/16：0> 18：2 ：18：2、8-18：3/18：1、9-18：2/18：1、10-18：2/16：0、11-18：1/16：0。该图转载自Zhou，XR，Bhandari，S.，Johnson，BS，Kotapati ，HK，Allen，DK，Vanhercke ，T.和Bates，PD（2020）。通过积油烟草叶片中脂质代谢网络对酰基通量的重组。植物生理学182（2）：739-755。www.plantphysiol.org。“美国植物生物学家版权协会”。

数据分析

通过LabLogic Laura分析无线电HPLC数据，处理后的样品色谱图如图1B所示，原始研究论文（Zhou等，2020）补充图S4B。
按顺序加载第一个MGDG样品，并按洗脱顺序选择所有显着的峰。
每个峰将被指定为一个区域，并且编号以相同的洗脱顺序分配。
通过批处理分析序列中的多个样品，其中将基于第一个色谱图选择色谱图中的所有区域。理想的情况是遍历每个色谱图并确保已选择所有重要的峰。这也有助于识别由于分析错误而引起的任何峰漂移。
处理后的色谱图的数据表提供以下信息：每个峰的保留时间，CPM峰下的面积，总百分比和目标区域百分比（％ROI）。
通过简单的复制粘贴功能将数据表导出到Microsoft Excel。
色谱图中每个已鉴定峰的总和％用于确定MGDG样品中每个分子种类的相对标记。有关MGDG分子种类分析的更多信息，请参见注释。
如表1所示，根据峰的保留时间识别单个分子种类。MGDG种类是根据碳链长度和酰基链中的不饱和数确定的。在Prism中绘制的分子种类之间的相对％14 C标记数据，在原始研究论文（Zhou等，2020）补充图S5和S6中得到了说明。

表1 。WT烟草中已鉴定的14 C MGDG分子种类的保留时间
峰号
分子种类
无线电跟踪的保留时间（分钟）
1个
18：3/16：3
7.5
2
18：3/16：2> 18：2/16：3
9.3
3
18：3/18：3
10.4
4
18：2/16：2> 18：3/16：1
11.7
5
18：3/18：2
12.8
6
18：2/16：1
15.1
7
18：3/16：0> 18：2：18：2
16.5
8
18：3/18：1
17.5
9
18：2/18：1
19.9
10
18：2/16：0
21.0
11
18：1/16：0
28.1

笔记

对于分子种类的鉴定，使分析进行的时间比我们报告的方法运行时间更长的时间总是理想的。这是为了确保除已报告的物种外没有其他物种。
如果保留时间关闭，则需要确定每个峰的身份。一个过程是收集每个14 C峰值，则转换为脂肪酸甲基酯，并确定14 Ç脂肪酸经由argentation TLC和磷光成像分析如报道贝茨等人。（2009年），此程序被用于周等人的原始识别每个标记的MGDG分子种类。（2020）。
通过调整方法参数（例如使用不同的固定相（例如，具有较长碳链的RP色谱柱）或尺寸不同（例如，长度增加的色谱柱））进行进一步的方法优化可能有助于分离MGDG的共洗脱分子。

致谢

这项研究得到了美国农业部国家粮食与农业研究所的支持（批准号：2017-67013-26156、2017-67013-29481和Hatch伞项目号：1015621）和国家科学基金会（批准的号：1930559））。

利益争夺

作者报告没有利益冲突。

参考文献

1 Bates，PD，Durrett，TP，Ohlrogge，JB和Pollard，M.（2009年）。在发育中的大豆胚中通过三酰基甘油合成的多种途径进行的酰基通量分析。植物生理学150（1）：55-72。
2 N.Karki，BS约翰逊和PD Bates（2019）。磷脂酰胆碱的代谢独特池参与将脂肪酸运出叶绿体或运出叶绿体以产生膜。植物细胞31（11）：2768-2788。
3 Yamauchi，R.，Kojima，M.，Isogai，M.，Kato，K.和Ueno，Y.（1982）。高效液相色谱法分离和纯化半乳糖脂的分子种类。农业与生物化学46（11）：2847-2849。
4 Zhou，XR，Bhandari，S.，Johnson，BS，Kotapati，HK，Allen，DK，Vanhercke，T.和Bates，PD（2020）。通过积油烟草叶片中脂质代谢网络对酰基通量的重组。植物生理学182（2）：739-755。