材料和试剂
注意：可以从任何合格的公司订购未提供公司和目录号的材料和试剂，以用于本实验。
移液器吸头（美国阿克西根）
1.5 ml微量离心管（Eppendorf，目录号：T9661）
封口膜（Sigma-Aldrich，目录号：P7793）
铅笔
一次性乳胶手套
Poly-Prep色谱柱（Bio-Rad，目录号：7311550）
一次性PD-10脱盐柱（GE Healthcare，目录号：GE17-0851-01）
纯化的异戊二烯基二磷酸合酶[用于该方案的长春花玫瑰花GPPS大亚基（CrGPPS.LSU）]
Rosetta 2（DE3）感受态细胞（Novagen，目录号：71400-M）
pET-28a（+）载体（Novagen，目录号：69864）
含Ni 2+的次氮基三乙酸（NTA）琼脂糖（Bio-Rad，目录号：7800800）
Luria Bertani Broth，Miller（HIMEDIA，目录号：M1245）
Luria Bertani Agar（HIMEDIA，目录号：M1151F）
硫酸卡那霉素（Sigma-Aldrich，目录号：10106801001）
氯霉素（Sigma-Aldrich，目录号：C0378 ）
咪唑（Sigma-Aldrich，目录号：I5513-25G ）
鸡蛋清中的溶菌酶（Sigma-Aldrich，目录号：10837059001）
二磷酸异戊烯基（Echelon Biosciences，目录号：I-0050）
二磷酸二甲基烯丙基（Echelon Biosciences，目录号：I-0051）
Geranyl diphosp ha te（Echelon Biosciences，目录号：I-0100）
法呢基二磷酸酯（Echelon Biosciences，目录号：I-0150）
马铃薯中的磷酸酶（Sigma-Aldrich，目录号：A6132）
小牛肠中的碱性磷酸酶（CIP）（Sigma-Aldrich，目录号：P4978）
香叶醇（Sigma-Aldrich，目录号：48798）
法尼醇（Sigma-Aldrich，目录号：43348）
香叶基香叶醇（Sigma-Aldrich，目录号：G3278）
TLC硅胶60 RP-18 F 254 s（Merck，目录号：105560）
甘氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：G7126-100G ）
10％的Mini-PROTEAN ® TGX TM预制蛋白凝胶（Bio-Rad公司，目录号：4561033）
十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma-Aldrich，目录号：L3771-100G）
Bradford蛋白测定染料试剂（伯乐（Bio-Rad）公司，目录号：5000006）
考马斯亮蓝（CBB-R-250）（Sigma-Aldrich，目录号：B-7920-10G）
溴酚蓝（Sigma-Aldrich，目录号：B5525-5G）
乙醇（Emsure，目录号：1.00983.0511）
水HPLC级（Sigma-Aldrich，目录号：270733）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
3-Morpholino-2-hydroxypropanesulfonic acid（MOPSO）（Sigma-Aldrich，目录号：M8389）
1,4-二硫苏糖醇（DTT）（Sigma-Aldrich，目录号：10197777001）
氯化镁（MgCl 2 ）（HIMEDIA，目录号：GRM4340）
碘（I 2 ）晶体（Sigma-Aldrich，目录号：229695）
Ñ正己烷（Merck公司，目录号：104369 ）
盐酸TRIS（Tris-HCl）（HIMEDIA，目录号：MB030）
甲醇（Merck，目录号：60600905001730）
异丙基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷（IPTG）（Sigma-Aldrich，目录号：I5502-5G）
裂解缓冲液（请参见食谱）
洗涤缓冲液（请参见食谱）
洗脱缓冲液（请参见配方）
存储缓冲区（请参见食谱）
分析缓冲液（请参见配方）
脱磷酸缓冲液（请参见配方）
流动相（请参见食谱）
TG缓冲液（请参见食谱）

设备
注意：可以从任何合格的公司订购未提供公司和产品目录号的设备以用于本实验。
P ipettes
的Eppendorf热混合器® F1.5仪（Eppendorf，目录号：5384000012 ）
玻璃矩形显影室20 x 20 cm（带盖）
测量缸
比例尺
镊子
剪刀
容量500毫升的硼硅酸盐烧杯
跷板（GeNei，货号：107106GB ）
可变容量移液器（Eppendorf）
电磁搅拌器（GeNei，目录号：117795GB）
吸附式TLC刮板（Sigma-Aldrich，目录号：Z265268）
真空浓缩器（Savant Speed Vac，目录号：SPD131DDA）
通风柜
Sonicator（PRO Scientific，目录号：H-1021-2）
循环冷冻水浴
ThermoMixer C（Eppendorf，目录号：5382000015 ）
涡旋混合器（GeNei，目录号：106887GB）
5424 R离心机（Eppendorf，目录号：5404000014）
数码相机或扫描仪

软件
ImageJ（美国国立卫生研究院，https：//imagej.nih.gov/ij/）

程序

重组异戊二烯基二磷酸合酶蛋白的表达与纯化
用带有目标IDS的质粒转化大肠杆菌Rosetta-2细胞（此处，我们使用了pET28a：CrGPPS.LSU）。核苷酸和蛋白质序列的GeneBank位点ID分别为JX417183和AGL91645。有关CrGPPS.LSU酶特性的更多信息，请参阅Rai等人，2013年。
在装有37 mg / ml氯霉素和50 mg / ml卡那霉素的25 ml Luria-Bertani（LB）培养基中接种单个菌落。
在37°C下以200 rpm的速度过夜生长（16 h），然后将5 ml过夜生长的培养物转移到1,000 ml含37 mg / ml氯霉素和50 mg / ml卡那霉素的LB培养基中。
将培养瓶置于设置在37°C和200 rpm的恒温振荡器中，并使细胞生长直至OD 600达到0.5。
加入异丙基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷（IPTG）的终浓度为0.4 mM，并在18°C下继续培养18 h。
在4°C下以6,000 xg离心培养10分钟，以获得细胞沉淀。
继续进行下一步或将沉淀保存在-80°C直至进一步使用。
将细胞沉淀重悬于裂解缓冲液中，每克细胞沉淀2-5 ml。
向细胞悬液中加入1 mg / ml溶菌酶，并在冰上放置30分钟。
使用配备了微尖端的超声仪对细胞悬液进行超声处理，并在10 s的冷却时间内发出6个10 s的脉冲。
通过在4°C下以12,000 xg离心20分钟回收裂解物，然后转移至50 ml管中。
取1毫升的50％的Ni 2+ -NTA琼脂糖浆液，并以1去除由短暂离心所述存储溶液，000 ×g离心15秒和重悬的Ni 2+在裂解缓冲液的琼脂糖-NTA。在上一步中，将1 ml重悬的Ni 2+ -NTA树脂添加到回收的裂解物中，并将试管在4°C下保持在转子振荡器上1 h。
将Ni 2+ -NTA树脂（包含捕获的His标记的蛋白）转移到0.8 x 4 cm的Poly-Prep色谱柱中，并通过重力沉降。
用含有10 mM咪唑的5倍柱体积的裂解缓冲液平衡柱。
用5倍柱体积的含有20 mM咪唑的洗涤缓冲液洗涤Ni 2+ -NTA树脂，以去除未结合的蛋白质。
洗脱结合的蛋白质，并用3 ml含有250 mM咪唑的洗脱缓冲液收集级分。
用4 ml储存溶液平衡PD - 10脱盐柱，然后将蛋白质洗脱液转移到该柱上。
加入2 ml的储存缓冲液，并以0.5 ml的馏分（E1-E4）收集洗脱液。
将30 µl蛋白质样品上样到10％SDS凝胶上，并在Tris-甘氨酸（TG）缓冲液中进行电泳。
确定使用纯化蛋白的浓度的Bradford法（布拉德福德，1976）。

异戊二酸二磷酸合酶测定
通过添加等摩尔浓度（执行IDS测定10 μM到IPP的80μM）和DMAPP，IPP和GPP ，和IPP和在200μl的测定缓冲液的单独的1.5ml离心管中，终体积FPP。
向每个试管中加入5 µg纯化的IDS酶（在此测定法中为CrGPPS.LSU）以引发反应。
取三个单独的1.5 ml管，并在最终体积为200 µl的测定缓冲液（含等摩尔浓度（40 µM）的IPP和DMAPP，IPP ）中加入5 µg加热灭活（95°C，10分钟）的CrGPPS.LSU作阴性对照。和GPP ，以及IPP和FPP。
INCU在30贝特含有IDS分析反应混合物中的所有管℃的循环水浴或恒温6小时。
加入200μl脱磷酸化缓冲液中并继续incub吃16小时，在30在一个℃的恒温以水解所有二磷酸酯（未反应的底物，以及异戊烯基产品）。
加入1ml ñ -己烷和剧烈涡旋30秒以提取已水解的反应产物和底物（异戊烯醇）。
在25 °C下以12,000 xg离心30 s 。
仔细含有上部己烷级分（约800微升）转移异戊烯醇到一个使用1ml移液器新的1.5毫升离心管中。
使用SpeedVac（在30°C下30分钟）将收集的含有异戊二烯醇的己烷馏分浓缩至25 µl，并立即用于TLC分析。

确定IDS产品资料
取一个500毫升的烧杯，并加入流动相溶剂至约0.5厘米的深度。用石蜡膜密封烧杯，轻轻旋转，然后静置2至5分钟以使反应室饱和。
采取反相TLC硅胶板用一个5.0×7.5cm的尺寸。绘制的水平线一个铅笔1厘米以上从底部的两个边缘。
沿TLC硅胶板上的线等距离（相距约5-7 mm）标记五个点，以涂覆含异戊二烯醇的己烷馏分。
制备在含有40μM的每个香叶醇，金合欢醇己烷异戊二烯醇标准溶液，和香叶基香叶醇。
使用10 µl移液管将样品小心地标记在TLC硅胶板上的标记点上。发现每个样品后，在TLC板上轻轻吹动以蒸发掉溶剂。
现货含有GOH，FOH标准溶液，并在GGOH车道S.
在第1泳道点点20 µl阴性对照的浓己烷馏分。
从不同酶促反应中提取的异戊二烯醇产物中的20 µl己烷在相应的TLC板上点样（图2）。
使用镊子放置异戊二烯基醇在含有烧杯斑TLC硅胶板的流动相。
通过用封口膜密封烧杯，进行TLC色谱分离，并使溶剂前沿向上上升。
从溶剂前沿之前到达顶端（约15分钟）的烧杯中取出TLC硅胶板，标记溶剂前沿与一个铅笔并允许TLC硅胶板上干燥5-10分钟。
在含有碘晶体的矩形玻璃室内将TLC板暴露于碘蒸气中3至5分钟，以对其染色（图3b，Kumar等，2020）。
通过与参考标准进行比较，可视化对应于产物和底物的异戊二烯醇斑点（Rai等人，2013）。
使用数码相机或扫描仪记录带有异戊二烯醇斑点的TLC图像。
可以使用ImageJ软件相对定量地记录所记录的产品斑点。

异戊烯醇机生产线的验证CTS
记录TLC图像后，圈出斑点，并使用TLC刮板刮除平行于参考化合物的异戊二烯基二磷酸异戊酯产物的相应斑点。
洗脱异戊二烯基diphosph一个在甲醇TE产品和参比化合物。
在N 2气流下浓缩洗脱的化合物。
根据Kumar等人所述的协议执行标准液相色谱质谱（LC-ESI-MS）。（2020年）以肯定的方式确认异戊二烯基二磷酸产物，并排除酸水解反应可能造成的污染（图3c，Kumar等人，2020年）。

数据分析

在这种方法中，非放射性测定法IDS已被用来测量，其提供代谢通量对于初级的CrGPPS.LSU的活性和在专门的代谢产物长春花（RAI等。，2013）。CrGPPS.LSU已被很好地表征，因此可作为一种适当的参考酶，以验证使用该非放射性测定法生成的异戊二烯醇产物谱。在CrGPPS.LSU存在下进行IDS分析，并进行异戊烯醇（GOH和GGOH）的形成和可视化（图2）。通过探测在使用不同浓度的底物后产生的产物斑点的强度，探索了异戊烯醇产物鉴定的最佳条件。的对应于GOH斑点，和GGOH异戊二烯醇产物瓦特ERE可见在≥ IPP和DMAPP基板20μM浓度（图2A）。然而，对应于GGOH斑点是在一个线性范围检测和在清晰可见≥ IPP和GPP基板10μM浓度（图2B）和≥ 40 μM浓度IPP和FPP基板（FIGUR ë2C）。因此，吨他从结果非放射性IDS分析表明，大约4 0 - 80μM的IPP和DMAPP / GPP / FPP衬底浓度是理想的，以实现所述最佳和检测水平的异戊二烯基醇产物从所述测定（图2）。

图2.重组（His）6 -CrGPPS.LSU的体外IDS分析。在TLC板上的斑点对应于从使用IPP CrGPPS.LSU测定反应产物和DMAPP（板A），IPP和GPP（板B），和IPP和FPP（板C）。形成的产物用箭头表示，虚线框中的斑点是未反应的底物。通过将斑点与真实的香叶醇（GOH），法尼醇（FOH）和香叶基香叶醇（GGOH）标准品（泳道S）进行比较来确认产品。泳道1中A，B ，和C TLC板表示，其中阴性对照煮沸CrGPPS.LSU PROT EIN用各自分别IPP和DMAPP，IPP和GPP，IPP和FPP和，40μM测定。泳道2-5代表用10μM，20μM，40μM测定CrGPPS.LSU蛋白质的反应产物，和80μM每个IPP和DMAPP（板A），IPP和GPP（板B）的，和IPP和FPP（板C）。泳道S：正宗异戊二烯醇标准混合物。

笔记

在异戊烯醇产品的所有色谱分离中，未使用标准香叶醇，法尼醇和香叶基香叶醇作为载体。
加入脱磷酸缓冲液后，必须在30 °C过夜孵育才能完全水解二磷酸酯。
为了最大程度地减少背景污迹并实现更好的色谱分离，请小心除去己烷部分（有机层）（在B8步骤中）。
处理TLC板污染时请戴手套。
样品点样直径不应超过3-4毫米。
具有非常轻轻标出TLC板一个铅笔，以避免损坏硅胶。
将TLC板放入烧杯中时，流动相的水平不应覆盖斑点。
始终使用新鲜配制的流动相溶剂，以更好地分辨斑点和结果重现性。
的产物和底物斑点应当与盘旋一个在去除从碘蒸气室TLC板的铅笔如它们消失后离开一个几分钟。

菜谱
裂解缓冲液（10毫升）
50毫米NaH 2 PO 4
300毫米氯化钠
10 mM咪唑，pH-8.0
洗涤缓冲液（100毫升）
50毫米NaH 2 PO 4
300毫米氯化钠
20 mM咪唑，pH-8.0
洗脱缓冲液（5毫升）
50毫米NaH 2 PO 4
300毫米氯化钠
250 mM咪唑，pH-8.0
储存缓冲液（50毫升）
25 mM MOPSO，pH值至7.0
15％[v / v]甘油
测定缓冲液（10毫升）
25 mM MOPSO，pH值至7.0
10％[v / v]甘油
2毫米DTT
10毫米MgCl 2
脱磷酸缓冲液（2毫升）
0.2 M Tris-HCl，pH-9.5
2单位CIP（原液18单位/毫克）
2个单位的马铃薯腺苷三磷酸酶（原液25.2单位/毫克）
流动相溶剂（50毫升）
甲醇：水[95：5 v / v]
TG缓冲液
25 mM Tris
192 mM甘氨酸
0.1％SDS

致谢
该协议是通过修改Orlova等人的方法开发的。（2009年）和Rai等人。（2013）。这项工作得到了生物技术部支持的项目BT / HRD / 35/24/2006和DAN的BT / PR6109 / AGII / 106/857/2012的支持。AR得到了印度新德里大学教育资助委员会研究奖学金的支持。本文的机构通信号码为CIMAP / PUB / 2020 / APR / 21。

利益争夺
作者宣称没有利益冲突。

参考文献
MM，布拉德福德（1976）。利用蛋白质-染料结合原理快速，灵敏地定量蛋白质的微克量。肛门生物化学72：248-254。
库马尔（Kumar，SR），赖（Rai），A.，孟山（Bomzan），DP，库马尔（Kumar），K.，Hemmerlin，A.，Dwivedi，V.，Godbole，RC，Barvkar，V.，Shanker，K.，Shilpashree，HB，Bhattacharya，A. ，Smitha，AR，Hegde，N.和Nagegowda，DA（2020）。质体定位的真品香叶基香叶基二磷酸合酶在长春花中的单萜吲哚生物碱生物合成中起着必要的作用。植物J 103（1）：248-265。
Nagel，R.，Gershenzon，J.和Schmidt，A.（2012年）。液相色谱-串联质谱法检测植物粗提物中异戊二烯基二磷酸合酶活性的非放射性分析。Anal Biochem 422（1）：33-38。
I. Orlova，Nagegowda，DA，Kish，CM，Gutensohn，M。Maeda，H.，Varbanova，M.，Fridman，E.，Yamaguchi，S.，Hanada，A.，Kamiya，Y.，Krichevsky， A.，Citovsky，V.，Pichersky，E.和Dudareva，N.（2009）。金鱼草香叶基二磷酸合酶的小亚基修饰了植物中烟草香叶基香叶基二磷酸合酶的链长特异性。植物细胞21（12）：4002-4017。
Rai，A.，Smita，SS，Singh，AK，Shanker，K.和Nagegowda，DA（2013）。长春花（Catharanthus roseus）的异聚和同聚香叶基二磷酸合酶及其在单萜吲哚生物碱生物合成中的作用。摩尔工厂6（5）：1531-1549。