材料和试剂

陪替氏培养皿（90 mm）时，热科学TM Sterilin TM标准（Fisher Scientific公司，目录号：11389273）
Fisherbrand TM L型细胞分布器（Fisher Scientific ，目录号：15615467）
Microspec TM无菌塑料接种环（Fisher Scientific ，目录号：15792105）
1.25厘米x 10厘米微孔胶带卷（Medical World Group ，目录号：MA1530-125）
15 ml无菌猎鹰管（Sarstedt ，目录号：64554002）
50 ml无菌猎鹰管（Sarstedt ，目录号：6254704）
分光光度计10×10×45分的比色皿（格雷纳乙IO- ø NE ，目录号：61301）
200 ml玻璃锥形瓶，盖有双折铝盖
200 µl黄色超尖刻度吸头（StarLab ，目录号：S1113-1006）
1000微升蓝色，超点刻度尖端（STARLAB ，目录号：S1111 - 6001）
45 µm无菌一次性过滤器（Sarstedt ，目录号：831826）
5 ml无菌一次性注射器（BD Emerald ，目录号：307731）
1.5 ml的的Eppendorf微量离心管（格雷纳乙IO- ø NE ，目录号：616 201）
灯管（Polylux XL ，货号：F30W / 840）
拟南芥生态型Landsberg erecta （Ler ）细胞悬浮培养。（最初从已故的Tony Slabas教授的实验室获得，现在由RHUL的Devoto实验室和达勒姆大学的Steve Chivasa博士实验室维护）
的根癌农杆菌GV3101含有载体pBin19PLUS（范恩格伦等人，1995）与所述内含子标记COI1 :: HIA构建体（Devoto等人，2002）
胰蛋白.。酪蛋白制蛋白ept（默克（Merck），目录号：VM944113 749）
酵母提取物（VWR ，目录号：1.03753.0500）
CaCl 2 （Sigma ，目录号：C1016-100G）
NaOH（Sigma ，目录号：221465-500G）
琼脂-琼脂超纯（VWR ，目录号：1.01613.1000）
植物琼脂（Melford ，目录号：P1003）
硫酸庆大霉素盐（Sigma ，目录号：G1264-250MG）
硫酸卡那霉素从链霉菌ķ anamyceticus （西格玛，目录号：K1377）
利福平（Sigma ，目录号：R8626-1G）
Timentin [ Ticarcillin /克拉维酸钾混合物15：1的比例]，5克（Melford Laboratories Ltd. ，目录号：T36000-5.0）
LS Media＆Vitamins（Duchefa ，目录号：L0230.0050）
蔗糖（Sigma ，目录号：84100）
萘乙酸（Sigma ，目录号：N1641）
激动素（Sigma ，目录号：K3253）
96-99％乙醇（VWR ，目录号：20821.330）
LS介质（请参阅食谱）
TY培养基和琼脂（请参见食谱）
1 M NaOH（请参阅食谱）
庆大霉素的含量为50 mg / ml（请参阅食谱）
卡那霉素50 mg / ml（请参阅食谱）
利福平25 mg / ml（请参阅食谱）
Timentin 16 0 mg / ml（参见食谱）
设备

200 µl微量移液器（Gilson）
1 ，000微升微吸管（Gilson）将
10毫升烧杯
锥形烧瓶
磁力搅拌棒
植物摇床培养箱（Bottmingen Infurs ，型号：CH-4103）
植物培养箱（三洋，型号：MLR-352-PE）
细菌摇床培养箱（New Brunswick Scientific，型号：Innova 4000）
细菌培养箱（Memmert ）
生物光度计（Eppendorf，型号：6131 01139）
离心机（Eppendorf，型号：5810R）
涡流（Spinmix ，型号：SGP-205-010X）
层流罩（Bassaire ，型号：AH191）
pH计（HANNA Instruments，型号：pH210）
磁力搅拌器（Nickel Electro Ltd.，型号：MSU-1）
程序

细胞悬浮培养的转化和建立
拟南芥Ler的悬浮培养物（见材料和试剂为源细节）被维持在（22℃下在恒定的光80微摩尔米- 2个小号- 1张在LS培养基和传代培养，每7天为强度在恒定搅拌（100rpm）下中所述小号挠度B.
注意事项：

所有仪器应保持清洁和无菌状态，以最大程度地减少交叉污染。
当前方案中列出的所有步骤均在层流罩下进行，以在整个过程中保持无菌条件。
上TY介质条纹琼脂含有板适当的抗生素农杆菌含有pBin19PLUS矢量GV3101菌株（范恩格伦等人，1995）与感兴趣的基因（或构建体）（图1A）。在这种情况下，使用内含子标签的COI1 :: HiA构建体（Devoto等人，2002; Bömer等人，2018）以及以下抗生素：
庆大霉素（50 µg / ml）。
利福平（25 µg / ml）。
卡那霉素（50 µg / ml）用于质粒选择。
将板盖在培养箱中，在28°C下孵育2-3天，以避免凝结。
条纹一个的单一菌落根瘤农杆菌从板和GRO瓦特为〜48 ħ在摇床（28℃ 180rpm下在所述暗）在50ml含有含7毫升TY培养基无菌Falcon管中：
庆大霉素（50 µg / ml）。
利福平（25 µg / ml）。
卡那霉素（50 µg / ml）用于质粒选择。
48小时后或当OD 600 nm = 0.8-1.0时，取1 ml农杆菌悬浮液，并将其添加到200 ml锥形瓶中，最终体积为50 ml的TY培养基，如步骤A 2所示，添加抗生素（图1A）。
当OD 600 nm = 0.8-1.0（约12小时后）时，将培养物从锥形瓶转移到50 ml猎鹰管中，离心（在室温下为3,100 xg，持续10分钟），然后重悬在5 ml中，从而回收细菌沉淀。无菌新鲜TY培养基。该培养物已准备好感染拟南芥细胞。
注意：培养12小时后，根据根癌农杆菌的生长速率，每1-2小时测量OD 600 nm 。当OD 600 nm = 0.8-1.0时，细菌已做好感染准备（O'Brien等人，2012）。

在感染的同一天，必须在新的锥形瓶中对新鲜的拟南芥细胞进行传代培养（图1B）。
放入预先消毒的200毫升锥形瓶中，装有45毫升新鲜的LS培养基。
加入5 ml 6-7天的均质Ler细胞悬浮培养物（图1E）。如Bömer等人所述，使用填充细胞体积（PCV）测量密度。（2018 ）并在注释5中详细说明。
保持在100rpm，22℃，连续光照制度80摇动微摩尔米-2小号-1强度，直到执行变换。
应将大约1 x 10 10 （2 ml）根癌农杆菌细胞添加到50 ml新鲜的亚培养拟南芥Ler （WT）细胞培养物中。
加入含有目的质粒的根癌农杆菌后，应立即将悬浮液在黑暗中静置约2小时，不要搅拌。
然后，必须将含有转化细胞培养物的锥形瓶（称为COV（表达过量的COI1））在22 °C下以100 rpm的恒定搅拌保持在黑暗中。
共培养三天后，从振荡器上移走COV细胞悬液5-10分钟，以使细胞沉淀或在室温下以18 xg （800-1,000 rpm）的速度在50 ml Falcon管中旋转3-5分钟，使其沉降。
取出旧培养基，将新鲜的无菌LS培养基添加到沉淀的感染细胞中，使其总体积为50 ml。
在每个继代培养物中添加以下浓度的抗生素，以进行选择并从培养物中消除根癌农杆菌。使细胞保持在100rpm，22℃，连续光照制度80微摩尔米-2小号-1强度。
卡那霉素（50 µg / ml）用于质粒选择。
Timentin （200 µg / ml）。
为了维持稳定的COV细胞系，应每周在35 ml新鲜无菌LS培养基中亚培养15 ml COV细胞，使其总体积为50 ml，其最终浓度与步骤A1 3中相同。
一旦细胞被稳定并达到均匀consi stency（图小号1E和2A，参见注5）的培养物体积逐渐增大到100毫升（时间轴增加是1或2个月之间，这取决于的生长速率培养通常以15毫升（例如，从50毫升至65毫升至80毫升，最多100毫升）的增量步骤进行。

图1.拟南芥Ler细胞悬浮培养物直接稳定转化的实验方案。将含有目的质粒的根癌农杆菌在选择培养基上划线2-3天，然后生长过夜。最终50ml培养物接种用1ml过夜培养物，并用于接种新鲜子培养拟南芥细胞（参见步骤小号TEP S A 2 -甲5 ）。B.细胞培养转化的按时间顺序的图示表示，从准备好进行转化的新鲜亚培养细胞开始。变换用根瘤土壤杆菌含有载体pBin19PLUS与所述内含子标记COI1 :: HA然后进行构建和随后的传代培养周期进行。当细胞培养物均匀时，进行愈伤组织诱导。经过多次传代培养周期的愈伤组织小菌落被隔离，以减少非均质性及新鲜无菌LS培养基接种（参见步骤小号TEPS阿7 -甲1 5一个第二B1-乙7）。C和D。通过SDS-Page和Western Blot分析筛选转化细胞。C.检测在光照（COV和COV2，两个独立转化的细胞系）和黑暗（COV深色）条件下生长的标记COI1蛋白（COI1 :: HiA ）的表达，以确认转化的发生（〜69 kDa ）。注意野生型（WT）细胞中不存在标记蛋白。可以在COV和COV2中观察到不同的COI蛋白表达水平。D.表达转化的细胞培养物的筛选COI1 :: HIA ，选自始发愈伤组织的小菌落（：选择菌落SC）。E.传代培养（DAS ）后约7天的稳定细胞培养。

微量移液器：查看图像，猎鹰管：https：//contacts.google.com/？hl = zh_CN＆ tab = iC＆authuser = 0

愈伤组织诱导以建立单菌落细胞悬浮培养物
从6-7旧天小号稳定转化的细胞悬浮液（图小号1E和2A），1-2毫升致密培养物（密度由PCV评价的如由Bömer等人。（2018 ），并在注详述5和图将2B）均匀地铺在LS-琼脂培养基板上，其中由单个转化细胞形成的细胞聚集体将能够生长，其中抗生素如下：
卡那霉素（50 µg / ml）用于质粒选择。
Timentin （200 µg / ml）。
用微孔带密封板的边缘。
将平板在正常生长条件下：22℃，在连续光照方案80微摩尔米-2小号-1强度。
愈伤组织将在3-4周内生长到汇合状态（图2C），并且应根据愈伤组织的不同，每3-4周定期转移到新板中。
4-5个周期后，当愈伤组织被连续继代培养和维持后，选择一个细胞“小菌落”；（约5毫米直径）从已建立的愈伤组织（图2C）中获得稳定的转化细胞培养物，这种培养物来自数量减少的细胞以减少异质性。
将小菌落置于新鲜的LS-琼脂培养基上，并按照与步骤B3和B4相同的参数和条件进行培养。
后4-5个循环，从已建立的板转移小菌落到一个新的锥形瓶中用新鲜无菌LS培养基，并保持在100rpm下，22 ℃，连续光照制度80微摩尔米-2小号-1强度。
不是es ：

重新启动由愈伤组织菌落培养在LS介质，例如更小的体积，35毫升该愈伤组织开始后〜6-7天增殖。随着部分易碎的愈伤组织块开始与原始的分离，并产生新的独立的愈伤组织块，这将变得很明显（图2A）。约3-4周后，培养物将达到融合和密度，如C节和注释5所述进行亚培养。
愈伤组织阶段是选择微菌落以使培养物在遗传上均质所必需的，并且从长远来看，这是有利的，因为它减少了液体培养物的处理，从而提供了更长的传代间隔。

图2.细胞培养和愈伤组织生长。A.在一定时间内从愈伤组织微菌落中繁殖细胞培养物。悬浮培养物中的细胞最初以小聚集体的形式生长。然后，由于搅拌，聚集体分裂，得到均匀的培养物。左，中和右面板：〜1、2、3-4周；有关详细说明，请参见B节。B.在3-4周后在琼脂平板上生长的已建立的融合愈伤组织。C.第0天（右）和第7天（左）的细胞培养物的包装细胞体积（PCV）。

拟南芥细胞悬浮液的传代培养
从装有85 ml新鲜无菌LS培养基的200 ml玻璃锥形瓶（烧瓶1）和装有7天细胞培养液的烧瓶（烧瓶2）中取下铝箔盖。
从烧瓶2中取出15 ml细胞，然后将其加入装有新鲜培养基的烧瓶1中。
如果合适，添加抗生素（步骤A 13 ）。
用铝箔盖关闭。
将细胞悬液放回摇床上。
笔记

在高压釜中于15 psi和121°C下对装有培养基的锥形瓶进行灭菌15分钟。
本规程中使用的微量移液器吸头在所有步骤中均必须清洁且无菌。
在进行继代培养之前，应对200 ml锥形瓶进行灭菌，其中应装有45 ml已制备的LS培养基，并将pH值调节至5.7-5.8。使用双重折叠的铝箔盖覆盖锥形瓶的开口和颈部。所有工作均在层流罩下进行。
几周细胞后小号按上述步骤可以是子培养阿7和C部分在连续光照制度80生长微摩尔米-2小号-1强度，22℃和100rpm。
填充细胞体积（PCV）用于评估适当的细胞密度（图2B）。为了确定PCV并收集有关细胞培养物生长速率的信息：1 ）。需要8毫升细胞培养物（在第0和7 d AYS一压脚提升小号UB -文化（DAS），并将其转移到一个的15mL无菌Falcon管中; 2 ）。让细胞在室温下静止状态下沉淀1小时；3 ）。确定沉淀前后的体积。通常，在7 DAS时，WT细胞悬浮培养物的PCV（从8 ml起）约为2.5 ml或培养物体积的30％。
将WT细胞悬浮培养物保存在200 ml装有85 ml无菌LS培养基（具体条件请参见注释1）的锥形瓶中，并将pH调节至5.7-5.8。一个双向折叠箔铝帽用于盖住锥形瓶开口颈部。15毫升一个6-7day的小号旧均匀的Ler细胞悬浮培养物中添加，并保持在100 rpm振摇，22℃，连续光照制度80微摩尔米-2小号-1强度和100rpm。
在正常生长条件：细胞悬浮培养物，并铺板两个愈伤组织被保持在22℃和连续光照制度80微摩尔米-2小号-1强度和连续振荡（100rpm）下。然而，出于其他研究目的，细胞培养物和带有愈伤组织的平板均在黑暗条件下生长。
通过SDS-PAGE和Western进行变换的确认b很多如由Devoto等。（2002 ）。
菜谱

LS媒体
4.43克LS培养基和维生素

30克蔗糖

溶于900毫升水
加入500 µl萘乙酸
加入50 µl 1 mg / ml激动素
用1 M NaOH调节pH 5.7-5.8
用ddH 2 O加满1 L
如果需要，添加1克/ 100毫升植物琼脂
TY培养基和琼脂
5克胰蛋白Try

3克酵母提取物

0.671克CaCl 2

使用ddH 2 O时最大容积可达1 L

如果需要，添加9克琼脂/升

1 M氢氧化钠
2克氢氧化钠

50毫升含d dH 2 O

庆大霉素50 mg / ml
在15 ml无菌Falcon管中加入500 mg庆大霉素
加入10毫升ddH 2 O
剧烈涡旋直至溶液看起来清晰透明
在层流罩中将庆大霉素溶液倒入10毫升烧杯中
使用5毫升无菌一次性注射器吸除庆大霉素溶液
放置45 µm无菌一次性过滤器，然后将1 ml倒入10个1.5 ml Eppendorf微量离心管中。
将装有庆大霉素溶液的微量离心管保持在-20°C。避免除霜两次以上
卡那霉素50 mg / ml
在15毫升无菌Falcon管中加入500毫克卡那霉素
加入10毫升ddH 2 O
剧烈涡旋直至溶液看起来清晰透明
在层流罩中，将卡那霉素溶液倒入10毫升烧杯中
使用5毫升无菌一次性注射器吸取卡那霉素溶液
放置45 µm无菌一次性过滤器，并将1 ml倒入10个1.5 ml Eppendorf微量离心管中
将装有卡那霉素溶液的微量离心管保持在-20°C。避免除霜两次以上
利福平25 mg / ml
在15毫升无菌Falcon管中加入250毫克利福平
加入10毫升96-99％的乙醇
剧烈涡旋，直到团块完全溶解并且溶液的颜色看起来均匀
在层流罩中，将利福平溶液倒入10 ml烧杯中
使用5毫升无菌一次性注射器吸取利福平溶液
放置45 µm无菌一次性过滤器，并将1 ml倒入10个1.5 ml Eppendorf微量离心管中
将装有利福平溶液的微量离心管保持在-20°C。避免除霜两次以上
Timentin 160毫克/毫升
在15毫升无菌Falcon管中加入1.600克Timentin
加入10毫升ddH 2 O
剧烈涡旋，直到团块完全溶解并且溶液的颜色看起来清晰均匀
在层流罩中，将Timentin溶液倒入10 ml烧杯中
使用5毫升无菌一次性注射器吸吮Timentin溶液
放置45 µm无菌一次性过滤器，并将1 ml倒入10个1.5 ml Eppendorf微量离心管中
将装有Timentin溶液的微量离心管保持在-20°C。避免除霜两次以上
致谢

刘凯（Kel Liu）因在细胞培养，愈伤组织维护和照相方面的技术帮助而闻名。BBSRC（BB / E003486 / 1）向AD支持了这项工作；ED得到CONACyT （墨西哥科学技术理事会，第472007号奖学金）的支持；JAO通过支持丰多国立DESARROLLO Científico Ý Tecnológico （科技基金）Nº1181358和授予BBSRC BB / E021166; IPS是支持由WestFocus公园种子基金投资奖和H2020-MSCA-IF-2015＃705427; JK得到了RHUL的BBSRC DTP学生奖学金（BB / J014574 / 1 – 100609005）的支持，MB得到了AD的SWAN（西南伦敦联盟网络）资助的支持

作者贡献：

AD最初的构思，设计研究，获得资金，进行研究，分析数据，编写和编辑论文。

JAO原始构思，设计研究，进行研究，分析数据，编辑论文。

ED进行了研究，分析了数据，撰写并编辑了论文。

IPS，JK，MB进行了研究，分析了数据，并对论文进行了编辑。

竞争我nterests

没有任何经济，个人或专业利益影响该工作。

参考文献

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