材料和试剂
5 ml血清移液管（Fisherbrand，目录号：13-678-11D）
10 ml血清移液管（Fisherbrand，目录号：13-678-11E）
25毫升血清移液管（Fisherbrand，目录号：13-678-11）
过滤的10μl微量移液器吸头（MultiMax，目录号：JM2015-108）
过滤的200μl微量移液器吸头（MultiMax，目录号：B-2104-SH）
过滤的1 ，250个微升微量提示（MULTIMAX，目录号：B-2105-L）
15 ml锥形离心管（TrueLine，目录号：TR2000）
50 ml锥形离心管（TrueLine，目录号：TR2003）
1.5毫升Optimum微量离心管（生命科学产品，目录号：8215-0500N）
96孔PCR板（Fisherbrand，目录号：14230232）
用于PCR的无菌2密耳密封膜胶带（生命科学产品，目录号：ST-3099）
铝箔PCR板密封件（Fisher Scientific，Axygen，货号：14-222-343）
96孔细胞培养板（Falcon，目录号：353077）
12孔细胞培养板（Falcon，目录号：353043）
6孔细胞培养板（Falcon，目录号：353046）
10厘米组织培养皿（Falcon，目录号：353003）
T25组织培养瓶（Thermo Scientific Nunc，目录号：156367）
T75组织培养瓶（Thermo Scientific Nunc，目录号：156499）
5 ml一次性注射器（BD，货号：1482945）
的Millex HV针筒式滤器，0.45 μ米（密理博，目录号：SLHV033RS）
注射器过滤器，0.2 μ米（康宁，目录号：431219）
宽孔过滤嘴（ART，货号：212362C）
1.8 ml冷冻管（Thermo Fisher Nunc，目录号：377267）
不育的14毫升圆底试管（猎鹰，产品目录号：352059）
Caplugs无菌聚丙烯培养管，4 ml（Evergreen Scientific，目录号：05-551-2）
快速流无菌一次性过滤装置，500毫升，0.2 μ M（Nalg烯，目录号：569-0020）
15口钝套管（Covidien Monoject，目录号：22-652-085）
100 μ米细胞滤器中（Falcon，目录号：352360）
10厘米培养皿（Fisher b rand，目录号：08-757-12）
合成双链DNA片段（TWIST Bioscience或Integrated DNA Technologies，定制）
细胞系
5KC α - β- （中山实验室，可应MTA要求提供）
Phoenix-ECO（ATCC，目录号：CRL-3214）
K562（ATCC，目录号：CCL-243）
293FT（Fisher，货号：R70007）
向量
8xNFAT-ZsG-hCD8（Addgene，目录号：153417）
鼠CD3WTdelta-F2A-γ-T2A-ε-P2A-zetapMIA II [CD3-AM]（Addgene目录号：52093）
CD3-2A_pMI-LO [CD3-LO]（Addgene，目录号：153418）
pMSCVII（Addgene，目录号：162750）
pMSCVII-AM [pMSCV-AM]（Addgene，目录号：162751）
pMSCVII-LO [pMSCV-LO]（Addgene，目录号：162754）
pMSCVII-BFP [pMSCV-BFP]（Addgene ，目录号：162755）
pMSCVII-tdTomato [pMSCV-TM]（Addgene，目录号：162752）
pMSCVII-E2Crimson [pMSCV-CR]（Addgene，目录号：162756）
pMSCVII-mChe [pMSCV-mChe]（Addgene，目录号：162753）
MBC1为空（Addgene，目录号：162748）
MBC2为空（Addgene，目录号：162749）
CaP2AIII_pK18 [CaP2AIII]（Addgene，目录号：153421）
pUS（Addgene，货号：153416）
A2_uSFFV（Addgene，目录号：153415）
pCL-ECO（Addgene，目录号：12371）
pMD2.G（Addgene，目录号：12259）
psPAX2（Addgene，目录号：12260）
限制酶（新英格兰生物实验室）
BspEI（NEB，目录号：R0540S）
HindIII（NEB，货号：R0104S）
MfeI（NEB，目录号：R0589S）
HpaI（NEB，货号：R0105S）
EcoRI（NEB，目录号：R0101S）
XhoI（NEB，目录号：R0146S）
MscI（NEB，目录号：R0534S）
AleI-v2（NEB，目录号：R0685S）
SalI（NEB，货号：R0138S）
BglII（NEB，目录号：R0144S）
MluI-HF（NEB，货号：R3198S）
SbfI（NEB，货号：R0642S）
引物（DNA综合技术）
BspEI-F（GCGGGCGCCCGAAGGTCCT）
后Seq-R（GGCTTCAGCTGGTGAAGCTT）
CD3-Seq（ATGGCCTTTACCAGGGTCTC）
SalI-Seq（GCATGCTAGCTATAGTTCTAGAG）
5pMIG（GCCTCCTCTTCCTCCATCCG）
3LTR-2（AATTTGCGCATGCTAGCTATAG）
TRAC1-R（CAGGCAGAGGGTGCTGTCCTG）
5个MAC3（AGAGACCAACGCCACCTACC）
3TRBC（CAAGGAGACCTTGGGTGGAG）
Cas9-S14（CACATAGCGTAAAAGGAGC）
Cas9-S16（AAGAGCTCACAACCCCTCAC）
P2A-R（GAAGTTCGTGGCTCCGGAG）
PGK-F2（CATTCCACATCCACCGGTAG）
P2A-F（CTCCGGAGCCACGAACTTC）
P2A-R2（GGGACCGGGGTTTTCTTCCAC）
3LTR（GCAAAATGGCGTTACTTAAGC）
IRES-Seq（CTGATCTGGGGCCTCGGTGC）
LB汤（Gibco，目录号：10855-021）
LB琼脂（BD Difco，目录号：244520）
氨苄青霉素现成溶液（Sigma - Aldrich，目录号：A5354-10ML）
QIAQuick凝胶提取试剂盒（Qiagen，目录号：28704）
QIAQuick PCR Clean-up Kit（Qiagen，货号：28104）
Qiagen Minelute凝胶提取试剂盒（Qiagen，目录号：28604）
NEBuilder HiFi DNA Assembly预混液（NEB，目录号：E2621L）
NEB 5-alpha感受态大肠杆菌（HE）（NEB，目录号：C2987H）
琼脂糖（Fisherbrand，目录号BP160-500）
溴化乙锭，10 mg / ml（Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：15-585-011）
PreMix D（Lucigen，目录号：MO7205D）
Taq DNA聚合酶（Sigma，目录号：D1806-20X250UN）
100 bp DNA阶梯（Fisher Scientific，Invitrogen，货号：15628-019）
1 Kb Plus DNA阶梯（Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：10-787-018）
Qiagen Plasmid Plus Midi试剂盒（Qiagen，目录号：12943）
胎牛血清（FBS）（Atlanta Biologicals，目录号：S11150H）
Lipofectamine 2000（Invitrogen，目录号：11668-500）
分子生物学级水（HyClone，目录号：3053801）
聚-D-赖氨酸（PDL）氢溴酸盐冻干粉（Sigma - Aldrich，目录号：P6407-10x5MG）
细胞培养级无菌水（HyClone水，细胞培养级（无内毒素），目录号：SH3052901）
磷酸盐缓冲盐水（PBS），pH 7.4（Gibco，目录号：10010023）
青霉素/链霉素（pen / strep），无菌过滤（Sigma - Aldrich，目录号：P0781）
胰蛋白酶-EDTA，0.25％（Gibco，目录号：25200-056）
Dulbecco的改良鹰培养基（DMEM）（Gibco，目录号：11965-092）
Iscove的改良Dulbecco培养基（IMDM）（Gibco，目录号：12440079）
RPMI 1640介质，无酚红（Gibco，目录号：11835030）
MEM非必需氨基酸溶液（MEM-NEAA）（100x）（Gibco，目录号：11140-050）
HEPES Buffer，1 M（Gibco，货号：15630-080）
丙酮酸钠，100 mM（Gibco，目录号：11360-070）
2-巯基乙醇[14.3 M]（Sigma - Aldrich，目录号：M3148）
二甲基亚砜（DMSO）（Fisher Bioreagents，货号：BP231-100）
硫酸鱼精蛋白粉（MP Biomedicals，目录号：ICN19472901）
PE标记的抗人CD8抗体（Biolegend，克隆SK1，目录号：344706）
抗小鼠CD3e抗体，功能等级（BD，克隆145-2C11，目录号：553057）
PE标记的抗小鼠CD3e抗体（BD，克隆145-2C11，目录号：553064）
PE标记的抗HLA-ABC抗体（BD，克隆G46-2.6，目录号：560964）
小鼠CD3e微珠试剂盒（Miltenyi Biotec，目录号：130-094-973）
Zombie NIR可固定生存力套件（BioLegend，目录号423105）
转染培养基（请参见食谱）
5KC介质（请参阅食谱）
凤凰中等（请参阅食谱）
5KC冷冻介质（请参阅食谱）
无酚红RPMI（请参阅食谱）
硫酸鱼精蛋白5 mg / ml溶液（请参阅食谱）
PDL，0.1 mg / ml（请参阅食谱）
LB氨苄青霉素肉汤（请参阅食谱）
LB-氨苄青霉素板（请参见食谱）

设备

移液器控制器（Fisherbrand，目录号：FB14955202）
微量移液器（Fisherbrand Elite Kit，目录号14-388-100）
多通道移液器（Fisherbrand Elite系列）
水浴（Fisher Scientific，康宁，6升数字水浴，目录号：07-202-156）
超低冷冻柜（Thermo Scientific，TSX系列，目录号：TSX50086A）
干浴（Fisherbrand，等温数字热双链DNA片段，目录号：88-860-021）
电泳凝胶盒（Fisher Scientific，Owl D4水平电泳系统，目录号：09-528-205）
电泳电源（Fisherbrand，目录号：FB200Q）
PCR热循环仪（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems ProFlex 96孔PCR系统，货号：4484075）
NanoDrop 2000分光光度计（Thermo Scientific，型号：NanoDrop TM 2000）
摇动培养箱（New Brunswick Scientific，型号：Innova 43）
GelDoc Go凝胶成像系统（B io -R ad ，目录号：12009077）
微量离心机（Fisherbrand accuSpin TM Micro 17，目录号：13-100-675）
Countess II自动细胞计数仪（Invitrogen，目录号：AMQAX1000）
伯爵夫人II幻灯片（Invitrogen，货号：C10228）
倒置光学显微镜（奥林巴斯，型号：IX53）
台式离心机（Thermo Scientific的，SORVALL TM图例TM XT / XF离心机和转子的软件包，目录号：75-333-839）
生物安全BSL2舱等（NuAire，米Odel等：NU-425-400）
CO 2培养箱（Fisherbrand Isotemp CO 2培养箱，目录号：11-676-600）
Cytoflex（Beckman Coulter，https: //www.beckman.com/flow-cytometry/instruments/cytoflex ）
弗罗斯蒂先生冷冻容器（Thermo Scientific，目录号：15-350-50）
MS色谱柱（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-201）
OctoMACS分离器（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-109）
MilliQ水机（Millipore-Sigma，批号：F8BA18025）

软件

Sequencher，基因密码公司（http://www.genecodes.com/）
SnapGene版本5.0.4（https://www.snapgene.com/）
FlowJo v10（https://www.flowjo.com/）
棱镜GraphPad（https://www.graphpad.com/）
NCBI核苷酸网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/）
FP数据库（https://www.fpbase.org/）
IMGT网站（http://www.imgt.org/IMGTrepertoire/Proteins/index.php#B）
HLA数据库（https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/MHC/allele.html）

程序

程序概述

该协议的工作流程如图2所示。第一步，使用如步骤T1至A4中所述制备的载体生成TCR表达细胞系。转染和转导用于将载体（图1）引入5KCα-β-杂交瘤T细胞，以生成具有TCRα和β链以外的所有报告基因系统组件（以及八个不同的荧光标记）的TCR表达细胞系。（步骤B1至B2c）。这些TCR表达细胞系可以扩增和冷冻，然后重复用于多轮TCR报告基因细胞系生成。在第二步中，产生具有TCRα和β链的载体（步骤A5），并将其转导到TCR表达细胞系中，从而产生功能性报告T细胞（步骤B2d）。在步骤3中，根据所分析的TCR的来源，生成表达具有生物学相关性的MHC基因的APC细胞系。步骤A6描述了MHC表达载体的产生，然后将载体转导到APC细胞系中（步骤B3）。在步骤4中，通过组合8种不同的FP识别的T细胞报告基因系并与APC和抗原共培养来进行多重刺激测定（步骤C1-C4）。最后，流式细胞术用于通过诱导报告基因颜色ZsGreen-1来测量阳性刺激的细胞（步骤C5）。

图2.过程工作流程。该协议分为四个主要步骤。第一步生成TCR表达细胞系，然后将其用于步骤2中以制成TCR报告基因细胞系。可以与步骤1和2同时进行步骤3（生成APC细胞系）。在步骤4中，使用与APC细胞和抗原共培养的TCR报告基因系进行多重刺激测定。流式细胞仪用于测量阳性刺激细胞中ZsGreen-1的表达。

A.矢量DESCRIPTIO ñ和构造方法，减税
请参阅表1，以获取A节中提及的所有载体的列表，这些载体可从Addgene获得。表2列出了A节中用于载体构建以及通过PCR和测序验证的所有引物。

表1.以下协议中使用的载体，其来源和目录号

表2.用于PCR和测序的引物

*各图显示引物的位置。

hCD8-8xNFAT报告载体。该载体将引入T细胞活化报告基因以及TCR共受体基因，例如人CD8。如图3所示，8xNFAT-ZsG-hCD8报告基因载体是具有8xNFAT-ZsG报告基因构建体（连续8个NFAT结合位点重复，随后是TATA框和ZsGreen-1基因）插入了截短的gag基因后面的位点。当转导到5KC α - β -细胞与重组TCR基因，所述8xNFAT-ZSG报道基因会诱发荧光蛋白ZsGreen的-1的表达时细胞被适当的抗原刺激。该载体在PGK启动子下游包含人类CD8（hCD8）α和β基因，用于组成型hCD8表达。hCD8基因可以替换为其他TCR共受体基因，例如人CD4（hCD4）。多亚基基因插入，诸如用于hCD8 α和hCD8 β在这个例子中，采用一个猪teschovirus-1 2A切割肽序列（P2A），它连接亚基的基因序列。

图3. 8xNFAT-ZsG-hCD8报告载体。A. 8xNFAT-ZsG构建的示意图。8xNFAT-ZsG报告基因构建体由8个NFAT结合位点（GGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGT）重复序列，一个TATA框和ZsGreen-1基因组成。B.8xNFAT-ZsG-hCD8的质粒图。Ť他8xNFAT-ZSG-hCD8报道载体骨架具有可以用于去除hCD8 BspEI位和HindIII限制性酶切位点α -P2A-hCD8 β基因构建体。然后可以通过Gibson大会插入包含与线性化载体末端重叠的序列的TCR共同受体基因片段。所述hCD8的C.示意图α -P2A-hCD8 β基因构建体。对于hCD8序列α和hCD8 β基因（栗色）由P2A（粉红色）接合。PGK启动子（白色）的部分切除时，消化BspEI位的矢量由除了5' hCD8的端恢复α作为5'的一部分的DNA片段末端。蓝色方括号表示5'和3'DNA片段末端的位置。面板A改编自Mann等人发表的文章。（2020）在《免疫学前沿》（doi 10.3389 / fimmu.2020.00633）中获得CC BY 4.0（https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）的许可。载体的序列也可在Mann等人中获得。（2020）。

可选步骤：用hCD4基因或其他TCR共同受体替换hCD8基因。请参阅NCBI核苷酸网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/），以获得hCD4或所需基因的编码序列。
设计要插入载体的DNA片段的核苷酸序列。对于多亚单位基因的插入，诸如用于HCD4 α和β在这个例子中，使用一个P2A切割肽加入亚基基因序列。
P2A（ADD编3之间'的第二基因序列的起始ATG的第一个基因序列的结束，省略了终止密码子，和）：

5 ' -GGCTCCGGAGCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGACGT

GGAAGAAAACCCCGGTCCC - 3 '

P2A的氨基酸序列：GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP

将5'和3'DNA片段末端添加到基因序列中，每个末端都包含与线性化载体重叠的序列：

5'的DNA片段末端（包括当该载体通过限制线性化BspEI位消化被去除PGK启动子的部分序列;地方d在基因起始密码子的前部）：

5 ' -GGGCGGGCGCCCGAAGGTCCTCCGGAGGCCCGGCATTCTGCACGCTTCAAAAGCGCACGTCTGCCGCGCTGTTCTCCTCTTCCTCATCTCCGGGCCTTTCGACCTGCATCCCGCCACC - 3 '

3 ' DNA片段末端（位置d基因终止密码子后）：

5 ' -AAGCTTCACCAGCTGAAGCCTA - 3 '

序列的每个部分，应在以下，以包括整个DNA片段：Ť他5'的DNA片段末端，第一个基因（例如，HCD4 α ），不包括终止密码子，P2A，第二基因（例如，HCD4 β ）（包括终止密码子）和3'DNA片段末端。确保从第一个基因的起始密码子到第二个基因的终止密码子的完整编码序列符合读框，并提供正确的氨基酸序列。
从TWIST Bioscience或Integrated DNA Technologies订购合成的双链DNA片段。重建分子生物学级水中的DNA片段。
挖EST 5 μ克8xNFAT-ZSG-hCD8用BspEI位和HindIII根据制造商的说明。
隔离6 ，通过分离249碱基对的载体骨架片段在1％琼脂糖凝胶上，随后使用Qiagen QIAquick凝胶提取试剂盒根据制造商的说明用凝胶纯化。
再净化6 ，根据制造商的说明书使用QIAquick PCR清洁试剂盒249 bp的载体骨架片段，并在20洗脱微升分子生物学级水。
根据制造商的说明，使用NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix执行Gibson装配。使用载体骨架与基因片段插入物的摩尔比为1：2。
转化NEB 5-alpha大肠杆菌。
1）根据制造商的说明，向25μl具有化学活性的NEB 5-alpha细胞中加入2μl吉布森装配反应，并通过热激法转化细胞。
注意：当NEBuilder高保真DNA装配主混合物用于吉布森组件，NEB 5-α感受态大肠杆菌被推荐为最佳变换变换效率分析ÿ 。

2）热LB氨苄青霉素平板（见ř ecipes）在37 °C培养箱。

3）将整个转化混合物铺在预热的LB-氨苄青霉素板上，并在37 ℃下孵育过夜。
生长单个菌落的微型培养物，并进行PCR验证DNA片段插入片段的存在。表2列出了用于PCR的所有引物的序列。
1）选择每个矢量的和接种4-8良好分离的菌落于50微升LB氨苄青霉素液体培养基（见ř ecipes）在96孔PCR板的各个孔中。
2）用铝箔板密封盖住微型培养物，在37 °C下孵育4 h ，以250 rpm摇动。
3）准备表3中给出的组分比率的PCR预混液。将微培养（3μl ）直接添加到包含以下引物的17μl反应预混物中。在F引物（BspEI位-F）一个第二的R引物（SEQ兴-R）的BspEI位识别位点之前，并在6的HindIII识别位点定位的后面，分别249 bp的载体骨架片段，（图3）。

BspEI位-F（F引物）5' - GCGGGCGCCCGAAGGTCCT - 3'

后SEQ-R（R引物）：5' - GGCTTCAGCTGGTGAAGCTT - 3'

表3.小型培养PCR的PCR预混液

4）根据表4中给出的条件，使用56 ℃的退火温度和2.5分钟的延伸时间进行PCR 。

表4.小培养PCR的PCR方案

5）可视化通过分离PCR产物在1％琼脂糖0.5凝胶μ克/ ml溴化乙锭。正确的DNA条带大小取决于插入的基因片段的长度。对于hCD8 α -P2A-hCD8 β正确的大小是1 ，639个碱基（即，1 ，503个碱基插入合成的双链DNA片段的加载于载体骨架136碱基对）。
准备用于转染的载体。如通过微型培养PCR所确认的那样，从一个具有正确大小的PCR产物的菌落的微型培养开始大规模培养质粒的制备。
1）接种40毫升LB-氨苄青霉素用20个肉汤μ升微型培养。在37 °C过夜生长，以225 rpm摇动。
2）根据制造商的说明，使用Qiagen Plasmid Plus Midi Kit提取质粒DNA。洗脱在150质粒DNA μ升分子生物学级水。
3）通过NanoDrop分光光度法定量质粒DNA，并用分子生物学级的水将DNA浓度调节至1,000 ng / μl 。质粒制备物可在-20 °C下保存。
4）通过使用表2中所示8xNFAT-ZsG-hCD8引物提交Sanger测序样品，检查载体的正确序列和插入的DNA片段的比对。
注意：载体序列必须与设计的框内核苷酸序列完全匹配，且无突变，这可能由于连接错误，PCR引入的突变或DNA片段合成错误而发生。如果发现突变，请选择另一个菌落进行Midi制备和测序。确认序列正确的载体可直接用于细胞转染。

CD3矢量。示出在图4中，所述CD3-2A_pMI-LO（CD3-LO）载体是鼠干细胞病毒（MSCV）表达所有四个鼠CD3逆转录病毒载体δγ ε ζ亚基，以及一个LSSmOrange（LO）荧光蛋白（ FP）基因构建在内部核糖体进入位点（IRES）下游，用于质粒标记。传感5KC α - β -细胞与附加鼠CD3基因确保TCR表达不会被表达不足的内源性CD3的限制（威廉姆斯。等人，2018）。由于在没有TCR基因的情况下CD3不会由T细胞表达，因此需要荧光标签作为标记，以鉴定成功转导的细胞。为了增加复用方案的灵活性，可以将LSSmOrange FP基因替换为其他FP基因。在此处所述的方案中，鼠CD3WTdelta-F2A-γ-T2A-ε-P2A-zetapMIA II （CD3-AM，Holst等人，2008年），它含有紫黄晶（AM）而非LO，而CD3- LO已生成，也被使用。

图4. CD3-2A_pMI-LO载体。A.CD3-2A_pMI-LO的质粒图。显示了鼠CD3亚基（绿色），IRES（灰色）和LO FP基因（橙色）的位置。限制性酶切位点MfeI和HpaI可用于切除IRES-FP基因盒。B.具有IRES-FP基因片段插入物和侧翼载体序列的DNA片段的示意图。蓝色方括号表示添加到FP基因序列中的重叠矢量的DNA片段末端。用原始FP基因切除的IRES被替换为添加到新FP基因片段5'末端的DNA片段。

可选步骤：用另一个FP基因替换LO FP基因。请访问FPbase网站（https://www.fpbase.org/）以获取所需FP基因的编码序列。
设计将双链DNA片段插入载体的序列。将以下5'和3'末端序列添加到FP编码基因序列中，每个末端序列均包含与线性化载体重叠的序列：

5'DNA片段末端（载体重叠加IRES；在FP基因起始密码子前面放置d ）：

3'DNA片段末端（FP基因终止密码子后第d位）：AACAACCGGTACCTCTAGAAC

从TWIST Bioscience或Integrated DNA Technologies订购合成的双链DNA片段。重构分子生物学级水中的DNA片段。
根据制造商的说明，用MfeI和HpaI消化CD3-2A_pMI-LO。
隔离7 ，通过分离263碱基对的载体骨架片段在1％琼脂糖凝胶上，随后使用Qiagen QIAquick凝胶提取试剂盒根据制造商的说明用凝胶纯化。
再净化7 ，根据制造商的说明书使用QIAquick PCR清洁试剂盒263 bp的载体骨架片段，并在20洗脱微升分子生物学级水。
根据制造商的说明，使用NEB HiFi Gibson Assembly Master Mix执行Gibson装配。使用载体骨架与基因插入物的摩尔比为1：2。
如步骤A2a所示，转化NEB 5-alpha大肠杆菌。ix以上。
培养单个菌落的微培养物，并进行PCR以验证DNA片段插入片段的存在，如步骤A2a所示。x以上。如表3所示，用以下引物准备微培养PCR反应：
CD3-SEQ（F引物）：5' - ATGGCCTTTACCAGGGTCTC - 3'

SalI位-SEQ（R引物）：5' - GCATGCTAGCTATAGTTCTAGAG - 3'

在F引物（CD3-SEQ）和R引物（SalI位-SEQ）的MfeI之前定位识别位点和behi ND在7所述的HpaI识别位点，分别263 bp的载体骨架片段，（图4）。使用表4中给出的条件进行PCR，所不同的是退火温度为50 °C ，延伸时间为2.5分钟。
可视化的PCR产物进行分离与0.5的1％琼脂糖凝胶μ克/微升溴化乙锭。正确的DNA片段插入将导致PCR产物等于FP基因的长度加上746 bp。
准备用于转染的载体。如步骤A2a中那样，通过小培养PCR证实，从具有正确大小的PCR产物的一个菌落的小培养开始大规模培养质粒制备。xi
通过提交样品进行Sanger测序，并使用表2中针对CD3-2A_pMI-LO的引物进行Sanger测序，以检查载体的正确序列和插入的DNA片段的比对。
荧光蛋白（FP）载体。如图5所示，该图以FP mCherry [pMSCVII-m Che （pMSCV-mChe），图5A]为例，将FP基因亚克隆到非复制的基于MSCV的逆转录病毒载体中（pMSCVII，图5B ）用于FP基因的组成型表达。此协议中描述的复用策略需要六个不同的FP矢量：紫黄晶（AM），LSSmrange（LO），TagBFP2（BFP），tdTomato（TM），E2Crimson（CR）和mCherry（mChe）。其他FP基因可以用于增加多路复用方案的灵活性。

图5.荧光蛋白载体。A.pMSCVII-mChe（pMSCV-mChe）的质粒图。B.pMSCVII的质粒图。C.具有FP基因序列和侧翼载体序列的DNA片段的示意图（黑线）。EcoRI和XhoI限制酶位点用箭头表示，DNA片段末端载体重叠序列的位置用蓝色括号表示。

设计所需FP基因片段的序列，以将其插入载体。请访问FPbase网站（https://www.fpbase.org/），以获得所需FP的FP编码基因序列。
将以下5'和3'端载体重叠序列添加到编码基因序列中。

5'DNA片段末端（基因起始密码子前面的d ）：CACTCCTTCTCTAGGCGCCGGAATTCAGCCACC

3'DNA片段末端（基因终止密码子后的d ）：
CTCGAGCCTGCAGGCATGCAAGCTTC

从TWIST Bioscience或Integrated DNA Technologies订购合成的双链DNA片段。在分子生物学级水中重建DNA片段。
Lineariz E（5）μ克pMSCVII通过用EcoRI和XhoI按照制造商的说明书消化。
根据制造商的说明，使用Qiagen PCR纯化试剂盒纯化线性化的pMSCVII 。
根据制造商的说明，使用NEB HiFi Gibson Assembly Master Mix执行Gibson装配。使用载体骨架与双链DNA片段插入片段的摩尔比为1：2的载体。
按照上述步骤A2a.ix，转换NEB 5-alpha大肠杆菌。
培养单个菌落的微培养物，并进行PCR以验证DNA片段插入片段的存在，如上述步骤A2a.x所示。如表3所示，用以下引物准备微培养PCR反应：
5pMIG（F引物）：5' - GCCTCCTCTTCCTCCATCCG - 3'

3LTR-2（R引物）：5' - AATTTGCGCATGCTAGCTATAG - 3'

F引物（5pMIG）和R引物（3LTR-2）分别位于pMSCVII中的EcoRI识别位点之前和XhoI识别位点之后（图5）。

使用表4中给出的条件进行PCR，所不同的是退火温度为54 °C ，延伸时间为1.5分钟。
可视化的PCR产物进行分离与0.5的2％琼脂糖凝胶μ克/微升溴化乙锭。正确的DNA片段插入将导致PCR产物等于FP基因的长度加上226 bp。
准备用于转染的载体。如步骤A2a.xi所示，从一个具有正确大小的PCR产物的菌落的微型培养物中继续进行大规模培养质粒制备。
通过使用表2所示的pMSCVII引物提交Sanger测序样品，检查载体的正确序列和插入的D NA片段的比对。
TCR向量。为了表达在人TCR的小鼠5KC α - β -细胞，鼠TCR α和β可变区的信号肽序列（分别TRAV信号肽和TRBV信号肽，）和鼠TCR α和β恒定区（分别为TRAC和TRBC，）是用于侧翼的人TCR α和β可变基因区段，（V- α和V- β ，分别地），从而产生鼠-人嵌合TCR α和β链。嵌合TCR α和β链通过P2A切割肽序列（P2A接合; GGCTCCGGAGCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGACGT
GGAAGAAAACCCCGGTCCC）。

通过将三个DNA片段插入非复制型基于MSCV的逆转录病毒骨架载体中，构建表达TCR的载体。载体骨架包含鼠TRAV5D-4信号肽序列（ATGAAAACATATGCTCCTACATTATTCATGTTTCTATGGCTGCAGCTGGATGGGAGGAGTGAGCC AA）和鼠TRBC区域（图6A）。TCR载体主链MBC1-null含鼠TRBC1 * 01，MB C2-null含鼠TRBC2 * 03。通过用SalI和BglII消化将MBC1-null或MBC2-null载体主链线性化，并使用Gibson组装连接三个片段和载体主链。

三个插入的DNA片段：1）人TCR α可变基因区段（V- α ），2）鼠TRAC *01克烯段加P2A序列（C α -P2A），和3）人TCR β可变基因片段（V- β ），如图6B和6C所示。的C α -P2A片段还包含鼠TRBV5信号肽序列（ATGAGCTGCAGGCTTCTCCTCTATGTTTCCCTATGTCTTGTGGAAACAGCACTCATG）

P2A之后（图6C）。

图6. TCR向量。A.MBC1-null和MBC2-null的质粒图谱。每个载体在基于MSCV的逆转录病毒载体中含有鼠TRAV信号肽序列和鼠β恒定区TRBC1 * 01（MBC1-无效）或TRBC2 * 03（MBC2-无效）。多克隆位点（SalI-BglII）位于鼠TRAV信号肽序列（深粉红色）和TRBC基因（浅紫色）之间。B.实施例的质粒1）人V-插入后完成的TCR向量的地图α DNA片段（暗紫色），2）C α -P2A DNA片段（浅紫色光粉红色暗粉色），和3）人V- αDNA片段（深紫色）。C.插入到MBC2-无效载体中的TCR区域的示意图。三个DNA片段，1）人V- α基因区段（DNA片段1; V- α ），2）鼠TR AC * 01-P2A鼠TRBV信号肽序列（DNA片段2; C ^ α -P2A），和3）将人V- β基因区段（DNA片段3；V- β ）插入到骨架载体的鼠TRAV信号肽和鼠TRBC序列之间。

合成V- α和V- βDNA插入片段。
设计DNA片段1 V- α的核苷酸序列。此片段由5'与线性化载体，所述人TCR的重叠序列α可变基因区段（V- α ），和3'与DNA片段2 C重叠序列α -P2A。信号肽序列是由载体提供的，因此V- α片段以TRAV信号肽序列之后的第一个氨基酸开始。此外，鼠标TRACSeğmen市t从DNA片段2 C供给α -P2A，因此V- α区段末端与所述连接区（TRAJ）的最后一个氨基酸。DNA片段1 V- α的示例如图7所示。
1）准备一个人TCR α从单个细胞测序或等同方法的兴趣链序列。V- α片段序列是从TRAV的信号肽序列之后的第一个密码子到TRAJ的最后一个密码子。请参考IMGT网站（http://www.imgt.org/IMGTrepertoire/Proteins/index.php#B），以识别1）TRAV片段信号肽序列之后的第一个密码子，以及2）密码子的最后一个密码子。 TRAJ段。请注意，TRAJ基因区段仅包含最后一个氨基酸密码子的第一个核苷酸。从TRAC段被设置在最后两个核苷酸，并且因此确认编包括TRAJ在V-最后一个核苷酸α段。
2）加入5'和3' DNA片段末端序列，对应于重叠的C-端的3'的线性化载体和5'端序列α -P2A片段，所述V- α片段序列。
V- α （包含鼠标TRAV信号肽序列与线性化载体端的重叠;地方5'的DNA片段末端序列d的V-之前α片段序列）：

5' - CTGCAGCTGGATGGGATGAGCCAA - 3'

V-α3'DNA片段末端序列（与Cα-P2A片段重叠；在V-α片段序列之后放置d ）：

5' - ACATCCAGAACCCAGAACCTGCTGTGTAC - 3'

3）确保整个V-α片段相对于载体主链TRAV信号肽序列在读框内。

图7. DNA片段1 V- α的示例。DNA片段1以鼠TRAV信号肽序列的最后8个密码子（绿色，5'DNA片段末端序列）开始，紧接着是人TRAV12-3 * 01序列（红色），从信号肽后的第一个密码子开始序列，重组连接序列（TC，紫色）和TRAJ4 * 01序列（蓝色）。最终TRAJ密码子（T）的第一个核苷酸将连接恒定区的前两个核苷酸（AC，黑色），成为TRAJ的最后一个密码子。这两个AC核苷酸加上TRAC段（黑，3'的DNA片段末端的序列）的后续的密码子9被添加到重叠的DNA片段2 C α -P2A。

设计DNA片段3V- β的核苷酸序列。此片段由5'与DNA片段2 C重叠序列α -P2A，人TCR β可变基因区段（V- β ），和3'与线性化的载体的重叠序列。信号肽序列是从DNA片段2 C供给α -P2A，因此V- β段与TRBV的信号肽序列后的第一个氨基酸开始。而且，小鼠T RBC片段是由载体提供的，因此V- β片段以连接区域（TRBJ）的最后一个氨基酸结尾。图8显示了一个示例DNA片段3V- β 。
1）准备一个人TCR β从单个细胞测序或等同方法的兴趣链序列。V- β片段序列是从TRBV的信号肽序列之后的第一个密码子到TRBJ的最后一个密码子。请参考IMGT网站（http://www.imgt.org/IMGTrepertoire/Proteins/index.php#B），以识别1）TRBV段信号肽序列之后的第一个密码子，以及2）密码子的最后一个密码子。 TRBJ段。注意，TRBJ基因区段仅包含最后一个氨基酸密码子的第一个核苷酸。从TRBC段被设置在最后两个核苷酸，并且因此确认编包括TRBJ在V-最后一个核苷酸β段。
2）加入5'和3'的DNA片段末端的序列，对应于该重叠的3'的C末端序列α -P2A和5'的线性化载体的末端。
V- β 5'的DNA片段末端序列（重叠以C α包含鼠标TRBV信号肽序列-P2A;地方d的V-前β片段序列）：GTCTTGTGGAAACAGCACTCATG

V- β （包含鼠标TRBC段与线性化载体端的重叠;地方3'的DNA片段末端序列d的V-后β片段序列）：AGGATCTGAGAAATGTGACTCCACCCAAG

3）确保整个V- β片段相对于载体主链TRBV信号肽序列在读框内。

图8.DNA片段3V- β的实例。DNA片段3从鼠TRBV信号肽序列的最后9个密码子开始（绿色，5'DNA片段末端序列），紧接着是人TRBV2 * 01序列（红色），从信号肽序列之后的第一个密码子开始，重组连接序列（CG，紫色）和TRBJ2-5 * 01序列（蓝色）。最终TRBJ密码子（G）的第一个核苷酸将连接恒定区的前两个核苷酸（AG，黑色），成为TRBJ的最后一个密码子。加入这两个AG核苷酸加上TRBC区段的随后9个密码子（黑色，3'DNA片段末端序列）以与线性化载体重叠。

从TWIST Bioscience或Integrated DNA Technologies订购V- α和V- β合成双链DNA片段。
制备的DNA片段2 C α -P2A。
为了使DNA片段2 C α -P2A，消化5 μ克CaP2AIII_pK的18（图9）与NEB限制酶MSCI和ALEI-V2，在37 ℃下4小时至过夜，依照制造商的说明进行操作。
纯化523碱基对片段插入物（DNA片段2 C α -P2A）由上，根据制造商的说明书，使用QIAquick凝胶提取试剂盒在2％琼脂糖凝胶分离。洗脱Ç α -P2A片段在25微升分子生物学级水。
柱纯化洗脱的C ^ α使用根据制造商的指示一个QIAGEN试剂盒MiniElute片段-P2A（第二纯化），在10洗脱最终产物μ升分子生物学级水。
通过NanoDrop分光光度计检查DNA纯度和浓度，并将纯化的DNA片段存储在-20°C直至需要。

图9. CaP2AIII_pK18的质粒图。DNA片段2 C α -P2A（栗色）含有鼠TRAC * 01（浅紫色）-P2A（浅粉红色）-murine TRBV信号肽序列（深粉色），插入b切口白内障手术挽的MSCI和ALEI限制性消化CaP2AIII_pK18的位点。

准备M BC1-null或MBC2-null矢量主干。MBC1-null用于具有TRBJ1-＃的V- β ，MBC2-null用于具有TRBJ2-＃的V- β 。
文摘10 μ克适当骨架载体，MBC1-null或MBC2空（图6A），具有NEB SalI和BglII位37 ℃下4小时至过夜，依照制造商的说明进行操作。
色谱柱使用QIAGEN MiniElute试剂盒根据制造商的说明纯化消化的MBC1无效或MBC2无效的主链载体，并在10μl分子生物学级的水中洗脱最终产物。
通过NanoDrop分光光度计检查DNA纯度和浓度，并将纯化的线性化载体保存在-20°C直至需要。
吉布森议会
根据表5中的反应比率设置Gibson组装反应。
将反应液在50°C下孵育1.5小时，然后保持在4°C下。
孵育后，反应可在4°C过夜保存，并于第二天用于转化NEB 5-alpha感受态大肠杆菌。

表5. Gibson组装反应预混液

按照上述步骤A2a.ix，转换NEB 5-alpha大肠杆菌。
培养单个菌落的微培养物，并进行PCR以验证DNA片段插入片段的存在，如上述步骤A2a.x所示。如表3所示，使用以下引物准备α和β链的微型培养PCR反应：

α链引物：

5pMIG（F引物）：5' - GCCTCCTCTTCCTCCATCCG - 3'

TRAC1-R（R引物）：5' - CAGGCAGAGGGTGCTGTCCTG - 3'

在F引物（5pMIG）和R引物（TRAC1-R）在MBC1（或2）的SalI识别位点之前定位-null和DNA片段的2 C内α -P2A，分别。

β链引物：

5MAC3（F引物）：5' - AGAGACCAACGCCACCTACC - 3'

3TRBC（R引物）：5' - CAAGGAGACCTTGGGTGGAG - 3'

F引物（5MAC3）和R引物（3TRBC ）分别位于DNA片段2Cα -P2A内和MBC1（或2）-null中BglII识别位点的后面。

按照表4给出的条件进行PCR，不同的是使用60 °C的退火温度和1.0 min的延伸时间。
可视化的PCR产物进行分离与0.5的2％琼脂糖凝胶μ克/微升溴化乙锭。正确插入DNA片段将导致PCR产物对α为600 ± 20 bp，对β为680 ± 20 bp 。
准备用于转染的载体。如步骤A2a.xi所述，从一个菌落的微培养物开始大规模培养质粒的制备，该菌落的微培养PCR产物具有正确大小的α和β链PCR产物。
通过使用表2所示的TCR载体引物提交Sanger测序样品，检查载体的正确序列和插入的DNA片段的比对。
MHC向量。将表达主要组织相容性I类（MHC I）或II类（MHC II）基因的载体转导到永生化的人类骨髓性白血病细胞（K562细胞，ATCC目录编号CCL-243）中，以产生抗原呈递细胞（APC），用于TCR刺激测定。如图10所示，将MHC基因盒插入非复制型慢病毒载体的多克隆位点（MCS）中，该载体包含普遍存在的染色质开放元件（UCOE）之前的脾脏聚焦形成病毒（SFFV）启动子（pUS，图10A）。图10B示出了MHC I基因载体A2_uSFFV，其在B部分的示例性刺激测定中使用。

MHC I类基因需要人β2微球蛋白才能在细胞表面表达。猪破伤风病毒-1 2A切割肽序列（P2A； GGCTCCGGAGCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGAGAGATGTGAGAGACACCC CGGTCCC）用于将MHC I基因连接至人β2微球蛋白基因序列。因此，I类MHC基因盒组成的MHC I基因P2A-的β 2微球蛋白基因（图10C）。对于II类MHC基因，MHC IIα和MHC IIβ链基因的核苷酸序列由P2A连接。MHC II类盒由所述MHC II的α基因P2A-MHC II β基因（图10D）。M HC I类和II类基因盒的侧翼是与线性化载体重叠的DNA片段末端，可通过Gibson组装体连接到pUS。

图10. MHC载体构建。A.非复制慢病毒主链载体pUS的质粒图。普遍存在的染色质开放元件（UCOE）位于脾脏聚焦形成病毒（SFFV）启动子之前（Adamson等人，2016）。MluI-SbfI克隆位点位于SFFV启动子之后。B.示例的MHC I载体A2_uSFFV的质粒图。通过用MluI和SbfI消化pUS骨架载体并通过Gibson组装体插入HLA-A * 02：01基因-P2A-人β2微球蛋白基因盒来构建A2_uSFFV载体。C.MHC I基因-P2A-人β2微球蛋白基因盒的示意图。D.MHCIIα基因-P2A-MHCIIβ基因盒的示意图。蓝色括号表示添加到MHC基因序列中的5'和3'DNA片段末端的位置。。

合成MHC基因盒DNA片段。
设计所需的MHC I基因盒的核苷酸序列，该序列由MHC I基因-P2A-人β2微球蛋白基因组成。请参阅免疫多态性数据库（https://www.ebi.ac.uk/ipd/），以获得所需MHC I基因的序列信息。
在MHC I基因序列的起始密码子之前和最后一个氨基酸编码密码子之后（省略终止密码子）分别添加以下5'和3'DNA片段末端序列：

5'MHC I类DNA片段末端（与线性化载体重叠；位于MHC I基因起始密码子之前）：CTGGAGCTCTCGAGAATTCTCACGCGTCTGCCACC

3' MHC I类的DNA片段3'末端（含有P2A随后由人β 2微球蛋白的核苷酸序列;代替MHC I基因的最后一个氨基酸的密码子后，省略了MHC I终止密码子）：GGCTCCGGAGCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGACGTGGAAGAAAACCCCGGTCCCATGTCTCGCTCCGTGGCCTTAGCTGTGCTCGCGCTACTCTCTCTTTCTGGCCTGGAGGCTATCCAGCGTACTCCAAAGATTCAGGTTTACTCACGTCATCCAGCAGAGAATGGAAAGTCAAATTTCCTGAATTGCTATGTGTCTGGGTTTCATCCATCCGACATTGAAGTTGACTTACTGAAGAATGGAGAGAGAATTGAAAAAGTGGAGCATTCAGACTTGTCTTTCAGCAAGGACTGGTCTTTCTATCTCTTGTACTACACTGAATTCACCCCCACTGAAAAAGATGAGTATGCCTGCCGTGTGAACCATGTGACTTTGTCACAGCCCAAGATAGTTAAGTGGGATCGAGACATGTAACGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGATATCAAG

对于II类MHC基因表达，α和β基因都需要核苷酸序列，并通过P2A连接。设计为所需的MHC II基因的核苷酸序列盒，由MHC II的α基因P2A-MHC II β基因（示意地示于图10D）b Ÿ增加了MHC II下列DNA序列α和β基因：
5' MHC II类α DNA片段末端（与线性化载体的重叠;地方d的MHC II前α基因起始密码子）：CTGGAGCTCTCGAGAATTCTCACGCGTCTGCCACC

P2A（在MHC IIα基因3'端之间的位置d ，省略了终止密码子和MHC IIβ基因的起始密码子）：

5'-GGCTCCGGAGCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGACGT

GGAAGAAAACCCCGGTCCC - 3'

P2A的氨基酸序列：GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP

3' MHC II类的DNA片段端部（与所述线性化的载体的重叠;地方d的MHC II后β基因终止密码子）：CGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGATATCAAG

从TWIST Biosciences或Integrated DNA Technologies订购MHC基因盒DNA片段。在分子生物学级水中以10 ng / μl重构DNA片段。
消化5 μ根据制造商的说明书克为pUS与NEB MluI位-HF和SbfI位。
根据制造商的说明，使用QIAGEN MiniElute试剂盒纯化消化的pUS骨架载体，并在10μl分子生物学级的水中洗脱最终产物。
通过NanoDrop分光光度法定量骨干载体，并用分子生物学级水将浓度调节至75 ng / μl 。
根据表6和表7中所示的反应比设置Gibson组装反应。
表6.用于MHC I类DNA片段的吉布森装配预混液

表7. MHC II类DNA片段的Gibson装配预混液

将Gibson装配反应在50 °C下孵育1.5 h，然后在4 °C下保温。
孵育后，该反应可在4 °C下保存过夜，并于第二天用于转化NEB 5-alpha Competent E. coli 。
按照上述步骤A2a.ix，转换NEB 5-alpha大肠杆菌。
培养单个菌落的微培养物，并进行PCR以验证DNA片段插入片段的存在，如上述步骤A2a.x所示。如表3所示，用以下引物准备微培养PCR反应：

Cas9-S16（F引物）：5' - AAGAGCTCACAACCCCTCAC - 3'

Cas9-S14（R引物）：5' - CACATAGCGTAAAAGGAGC - 3'

F引物（Cas9-S16）和R引物（Cas9-S14）分别位于pUS载体MCS之前和之后。

使用表4中给出的条件进行PCR，所不同的是退火温度为50 °C ，延伸时间为2.5分钟。
可视化的PCR产物进行分离与0.5的1％琼脂糖凝胶μ克/微升溴化乙锭。正确的DNA片段插入将导致的PCR产物1 ，740 ± 20bp的用于MCH我载体和1 ，840 ± 20bp的用于MCH II载体。
准备用于转染的载体。如步骤A2a.xi所述，从一个含有正确大小的PCR产物的小菌落的微型培养物中继续进行大规模培养质粒的制备。
通过使用表2中所示的MHC载体引物提交样品进行Sanger测序，检查载体的正确序列和插入的DNA片段的比对。

B.细胞系
总览
使用逆转录病毒和慢病毒系统的转染和转导产生细胞系。用于产生TCR细胞系的所有载体是逆转录病毒，而用于MHC细胞系的载体是慢病毒。此处使用的逆转录病毒载体中的MSCV启动子在5KC细胞中提供了稳定的表达，而造血细胞中其他逆转录病毒系统的转基因表达却降低了。慢病毒载体使用脾脏聚焦形成病毒（SFFV）启动子，然后使用普遍存在的染色质开放元件（UCOE）减少基因沉默。我们凭经验发现，在K562细胞中，UCOE-SFFV慢病毒系统比MSCV系统具有更高的转基因表达。表8和9概述了逆转录病毒和慢病毒转染以及转导中使用的细胞和试剂。图11亲VID ES一个用于转染和转导的步骤和时间线图形表示。
请注意，在美国，所有转染和转导都应按照生物安全2级进行。其他国家/地区的研究人员应确认对其机构的生物安全限制。
我们强烈建议在开始转染和转导实验之前优化细胞系的生长条件，包括选择合格的FBS批次并以适当的浓度培养细胞。见Ñ在详细建议注释部分OTES 7和8。

表8.逆转录病毒和慢病毒转染所需的试剂和细胞类型

表9.逆转录病毒和慢病毒载体的转导条件

图11.通过转染和转导产生细胞系的时间表和工作流程的概述。以逆转录病毒系统为例。

T细胞系
图12说明了在每一轮转导过程中添加的载体。这些转导的最终产物是用颜色编码的报告基因T细胞系。

用于创建过程的图12概述TCR表达NFAT-记者5KC α - β -细胞复用。在小号TEP 1，hCD8-8xNFAT报告载体（8xNFAT-ZSG-hCD8，在步骤A2中产生）和含有任一紫黄晶（AM）或LSSmOrange（LO）荧光蛋白基因（CD3-AM或CD3-LO CD3载体，在步骤A3）产生共转导到5KC α - β -细胞。在第二步中，将AM或LO荧光蛋白载体（pMSCV-AM或pMSCV-LO）与其他四个荧光蛋白载体（在步骤A4中生成）之一进行转导。最后，将TCR载体（在步骤A5中生成）添加到包含8xNFAT报告基因，hCD8，CD3和荧光标识符的细胞中。

使细胞系表达8xNFAT报告基因，人类CD8和CD3基因以及LSSmOrange（LO）或紫黄晶（AM）。这得以实现通过引入两个向量，8xNFAT-ZSG-hCD8和CD3-AM或CD3-LO，成5KC α - β -细胞。（图12，š TEP 1）。
转染。注意，表8列出了逆转录病毒转染中使用的细胞和试剂。
1）在37 ℃ ，5％CO 2的Phoenix培养基（配方3）中，在10厘米组织培养皿中培养Phoenix-ECO细胞（ATCC CRL-3214）。细胞接种的密度应在24小时内不超过80％融合度。每天根据ATCC指令传代培养细胞。
2）与款待10cm组织培养皿聚d赖氨酸（PDL）上转染前一天如下：加入3毫升0.1毫克/毫升PDL溶液（配方7）盘，覆盖底部完全的菜，并在室温下孵育5分钟。
3）除去PDL溶液，并用10 ml PBS洗涤板两次。将第二次PBS冲洗在平板上，直到准备好铺板细胞为止。或者，按照Sigma建议的PDL板制备说明进行操作（https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p6407?lang=zh_CN®ion=US）。
4）通过用胰蛋白酶-EDTA去除并在室温下以168 × rcf离心2分钟来收集Phoenix细胞。除去细胞沉淀上方的培养基，将细胞重悬于新鲜的Phoenix培养基中，每毫升1.5 x 10 6个细胞。
5）从PDL处理的板上吸出PBS，并用8 ml新鲜的Phoenix培养基代替。
6）每块板加入2 ml Phoenix细胞，最终浓度为10 ml中3 x 10 6个细胞，并轻轻摇动板进行分配。
7）将细胞放回CO 2培养箱中，培养过夜。第二天进行转染。
注意：对于每个要制作的报告细胞系，准备两块经PDL处理的Phoenix平板：一张用于8xNFAT-ZsG-hCD8转染，另一张用于CD3-AM或CD3-LO载体转染。

8）每次转染时，将1.5 ml转染培养基（配方1）添加到两个14 ml圆底管中。
9）加入5 μ克包装载体的pCL-ECO和10的μ克反转录病毒载体的一个管。通过移液混合3x。
10）添加40微升脂质体2000至另一管，并混合3通过缓慢，轻柔移液用P1000移液器X。在室温下孵育5分钟。
11）用P1000移液器将lipofectamine溶液滴加到DNA溶液中，不要让液滴接触管的侧面。通过缓慢，温和的移液混合3次。
12）在室温下孵育30分钟。
13）从每个PDL处理的Phoenix细胞平板上吸出培养基，并用4 ml预热的转染培养基洗涤。轻轻摇动板一次并吸出转染培养基。加入7 ml转染培养基，并将平板返回到CO 2培养箱中。
注意：此步骤应在30分钟的孵育过程中执行。

14）通过缓慢的逐滴移液将DNA-lipofectamine溶液直接添加到准备好的Phoenix板上。
15）将板放回CO 2培养箱中6 h。
16）向每个平板中滴加1 ml FBS。轻轻摇动板1-2次以分配FBS，然后返回培养箱过夜。
17）从每个平板上取下培养基，第二天早晨用5毫升预热的Phoenix培养基替换。返回CO 2培养箱并培养过夜。
转导。表9并不是逆转录病毒转导所用的条件。
1）解冻5KC α - β -在同一天凤凰细胞在PDL平板上的细胞。
放置一个离心管含1 X 10 6 Ç 37厄尔℃的水浴中，直到冰的最后位消失。使用大口径移液器吸头将细胞小心地转移到装有10至12 ml 5KC培养基（配方2）的15 ml离心管中。

2）在室温下以315 × rcf离心细胞3分钟。
3）除去细胞沉淀上方的培养基，轻轻重悬细胞，然后转移至含有10 ml培养基的T25烧瓶中。在CO 2培养箱中生长过夜。
4）继代5KC α - β前转导每天细胞- 。在适当大小的（T25或T75）培养瓶中以每毫升5 x 10 4个细胞的形式接种细胞。
5）预暖台式离心机至37 ℃，同时准备转导板与5KC α - β -细胞和逆转录病毒的上清液：
（ⅰ）收集5KC α - β -以1×10细胞在新鲜培养基5KC离心和重悬5每毫升细胞。
（ii）将1 ml细胞悬液添加到12孔板的一个孔中。为每个要制作的细胞系准备一个孔。
（ⅲ）添加4.8微升的5毫克/毫升鱼精蛋白硫酸盐（配方6）至每个孔中的8的终浓度μ微克/毫升在3ml。
（ⅳ）通过0.45删除5毫升从使用一次性注射器和过滤器各转染的细胞菲尼克斯平板培养基的μ米注射器过滤成一个14毫升的圆底培养管。现在将其称为逆转录病毒上清液。要在转导的第二天继续产生逆转录病毒，请将5 ml预热的Phoenix培养基加回到每个Phoenix细胞平板中，然后返回培养箱。
（ⅴ）加入1毫升8xNFAT-ZSG-hCD8和1ml CD3-AM或CD3-LO逆转录病毒上清液的成5KC α - β-细胞中的每个transdu ction以及在12孔在步骤板构成（ii）中。图13显示了一个示例板图。
6）在预热的台式离心机中，在1048 × rcf ，37 °C下，将含有细胞和逆转录病毒上清液的平板离心1.5 h。
7）从每个转导孔中移出1.5 ml培养基，尽可能避免移出细胞。用1.5毫升新鲜的5KC培养基代替，并返回孵育箱过夜。
8）重复转导第二天通过从每个孔中的转导板的除去1.5毫升介质中，加入5.6微升硫酸鱼精蛋白（对于8最终浓度μ微克/毫升于3.5ml）直接加入到每个孔中。像以前一样收集和过滤逆转录病毒上清液，并像以前一样向每个孔中分别加入1 ml 8xNFAT-ZsG-hCD8和CD3-AM或CD3-LO逆转录病毒上清液。将Phoenix转染板丢弃到生物安全性为2级的废物中。
9）按照Ste ps B2b.ii中所述离心板并更换培养基。6和B2b.ii. 7以上。

图13.用8xNFAT-ZsG-hCD8和CD3-LO或CD3-AM进行转导的板布局示意图。注意每个转导孔从两个转导板接收逆转录病毒上清液。橙色箭头表示除了来自转染菲尼克斯板，以5KC逆转录病毒上清液的α - β -对转导板的细胞。未使用的孔中充满3 ml磷酸盐缓冲盐水（PBS）。

扩增和分类转导的细胞
1）继代培养转导的5KC α - β -每天3天的细胞，保持所有细胞中并在5个接种X 10 4在适当尺寸（T25或T75）培养瓶中每毫升细胞。确保三个完整的介质交换，以便从介质中充分去除逆转录病毒颗粒。
2）收集所有细胞，并按照制造商的说明用PE标记的抗人CD8抗体染色。
3）将细胞重悬在500至1 ，000微升的Ph烯醇红的RPMI（配方5）和流分类，以收集PE + AM +或PE + LO +双阳性细胞，如示于图14。
注意：在此步骤使用严格的门控以确保纯度。

4）在室温下以315 × rcf离心分选的细胞3分钟，然后除去分选缓冲液。将细胞以每毫升1 × 10 5个细胞的量重悬于5KC培养基中，并置于适当大小的培养皿中。
5）每天传代培养细胞3天，并根据需要扩展到更大的培养容器中。
6）通过用PE标记的抗人CD8抗体染色，然后通过流式细胞术分析来评估AM或LO和hCD8的表达。大于97％的细胞应同时表达CD8蛋白和CD3荧光标记蛋白（AM或LO）。5KC α - β -与8xNFAT-ZSG-hCD8和CD3-AM或CD3-LO转导的细胞此后分别称为8xNFAT-AM和8xNFAT-LO细胞。
7）[断裂点和可选择性的冷冻]一旦细胞生长到足以以每瓶1 x 10 6个细胞的数量制备几个小瓶，就将其冷冻。
（i）收集细胞，并在室温下以315 × rcf旋转3分钟。除去培养基并轻轻敲打试管以去除细胞沉淀。
（ii）在冷冻培养基中以1x10 6细胞/ ml重悬（配方4）。
（iii）将1 ml细胞悬液分装到每个标记的冷冻管中，并立即置于Frosty细胞冷冻装置中。根据制造商的说明，让细胞在超低（-80 °C ）的冰箱中缓慢冷冻，然后再转移到永久存储位置。

图14.实施例流式分选的情节在所表示的转导。图13. 5KC α - β -与8xNFAT-ZSG-hCD8并且或者CD3-LO或CD3-AM转导的细胞用PE标记的抗hCD8抗体。使用FSC与SSC散点图选通活细胞后，对双阳性细胞（PE和AM或PE和LO）进行分类。LSSmOrange作为示例显示在图中。

加入荧光蛋白标识符8xNFAT-AM和8xNFAT-LO 5KC α - β -细胞系，以产生颜色编码TCR表达的细胞系（图12中，小号TEP 2）。
注意，CD3-AM和CD3-LO的AM和LO表达相对较弱。因此，转导细胞与编码AM或LO基因的其他载体，pMSCVII-AM（pMSCV-AM）或pMSCVII-LO（pMSCV-LO），可驱动强烈的荧光蛋白表达。共转导另一种荧光蛋白，产生八种颜色组合（图15）。
转染
为以下每个荧光蛋白载体制备一个PDL处理的Phoenix细胞板，并按照步骤B2b.i中所述的步骤进行转染。

荧光蛋白载体：pMSCV-AM，pMSCV-LO，pMSCVII-BFP（pMSCV-BFP），pMSCVII-tdTomato（pMSCV-TM），pMSCVII-E2Crimson（pMSCV-CR），pMSCVII-mChe（pMSCV-mChe）。

注意：逆转录病毒转染的试剂见表8。

转导
1）根据图15所示的板图，用荧光蛋白载体转导8xNFAT-AM和8xNFAT-LO细胞系。将8xNFAT-AM细胞系与pMSCV-BFP，pMSCV-TM，pMSCV一起转导pMSCV-AM -CR或pMSCV-mChe。同样，pMSCV-LO与其余四个荧光蛋白载体中的每一个一起转导8xNFAT-LO细胞系。请按照步骤B2b.ii中的步骤进行转导。
注意：逆转录病毒转导试剂见表9。

2）第二天重复转导。
3）展开转导5KC α - β -细胞3天，传代培养中所描述的每一天步骤的B2B .iii。
4）3天后，离心收集所有细胞，并除去沉淀上方的培养基。
5）将细胞重悬在500至1 ，000微升无酚红RPMI和流分类，以净化该对于两个荧光蛋白双阳性（细胞例如，AM + BFP +）。
注意：由于CD3载体中预先存在AM或LO表达，因此可能会有两个AM阳性或LO阳性种群。仅收集AM-High或LO-High人口。LO高电平单元的示例如图16所示。

6）传代培养细胞3天，根据需要扩展至更大的培养容器。
7）通过流式细胞仪分析评估荧光蛋白的表达。大于97％的细胞应表达AM或LO和次要颜色（BFP，TM，CR或mChe）。
8）按照上述步骤B2b.iii.7中所述的程序，以每个小瓶1 x 10 6个细胞的数量冻结每个颜色编码报告基因细胞系的12-16小瓶。

图15。用于识别荧光蛋白转导的板布局。注意，每个转导孔从两个转染板接收1 ml的每个逆转录病毒上清液。代表性箭头显示了向A1孔中添加了pMSCV-AM和pMSCV-BFP逆转录病毒上清液。孔顶部带下划线的文本表示正在转导的8xNFAT-CD3-AM和8xNFAT-CD3-LO细胞系。

图16.图15中所示的LO-High / BFP +转导的流分类示例图。LO已作为步骤1中添加的CD3-LO载体的一部分存在于细胞中。在此步骤中添加了pMSCV-LO以确保足够的色彩表现。收集LO-High / BFP +细胞，而丢弃LO-Low / BFP +细胞，因为它们未用pMSCV-LO载体转导。有关详细信息，请参见注释9和10。

加入TCR矢量生成5KC-TCR报告细胞系（图12，š TEP 3）
转染
1）按照步骤B2b.i中所述的步骤，为要添加和转染的每个TCR载体准备一块经过PDL处理的Phoenix细胞板。
注意：逆转录病毒转染的试剂见表8。

2）转导8颜色编码的报告细胞系与TCR矢量根据在S中。图17.按照步骤所示的板图TEP B2b.ii，一个dding2毫升逆转录病毒上清液，每孔。
注意：逆转录病毒转导试剂见表9。

3）第二天重复转导。
4）将转导的5KC细胞扩增3天，每天进行亚培养。
5）根据制造商的说明，使用带有MS柱的Miltenyi MACS小鼠CD3e微珠试剂盒收集细胞并富集CD3 +细胞。分离前，将一小部分预富集的细胞保留在6孔板中以进行流式细胞术分析。
注意：可以使用不含酚的RPMI代替MACS缓冲液，以改善细胞状况和生存能力。

6）根据制造商的说明书，用PE标记的抗小鼠CD3e抗体染色富集和预富集的5KC-TCR细胞，并通过流式细胞仪评估CD3的表达。
注意：成功转导了功能性TCR的细胞将在其表面表达CD3。通常，预富集的5KC细胞中有20％-40％表达CD3，但仍可低至10％。对于后富集细胞，> 97％会表达CD3。

7）在MACS分离后的第一个培养期内，在适当大小的培养皿中以每毫升1x10 5个细胞的密度接种细胞。
8）按照上面B2b.iii.7中所述的步骤扩增和冷冻分选的细胞。

图17。用于引入TCR以产生颜色编码的5KC TCR报告细胞的转导板示意图。带下划线的文本表示已经引入亲代细胞的载体。请注意，每个TCR都被转导到具有不同颜色组合的细胞中，因此可以通过流式细胞仪区分各个TCR。

K562-APC线
如上所述，通过旋转感染将用于表达MHCI或MHCII基因的MHC载体转导到人骨髓性白血病K562细胞（ATCC CCL-243）中，除了使用慢病毒包装系统代替逆转录病毒系统外（表8和9 ）。MHC载体A2_uSFFV在此协议中用作生成HLA-A * 02：01的K562细胞的例子。
转染
1）在Phoenix培养基的10厘米培养皿中培养293FT细胞（Fisher R70007）。每天根据制造商的说明进行亚培养。
2）为每个MHC表达载体准备一块用DLFT处理的293FT细胞板，并转染慢病毒系统，其试剂见表8。
注意：慢病毒系统中的转染方法遵循S中描述的步骤TEP B2b.i，不同的是使用的细胞系并且如在概述的包装载体表8中，慢病毒的条件。

3）使转染的细胞生长过夜，第二天早晨交换培养基。
转导
1）在步骤B2b.ii中所述的PDL铺板的同一天（或前一天）解冻K562细胞（ATCC CCL-243），并每天按照制造商的说明进行继代培养。
2）根据表9中给出的慢病毒转导参数，在每个孔中准备一个接种有5 x 10 5 K562细胞的6孔转导板。
3）按照逆转录病毒转导中描述的步骤制备慢病毒上清液，将2 ml慢病毒上清液添加到转导板的每个孔中，并根据表9中给出的参数进行一天的转导。
4）扩增转导的K562细胞3天，以每天每毫升1 x 10 5个细胞的速度播种细胞，并转移到适当大小的培养皿中。
5）根据制造商的说明，用PE标记的HLA-ABC抗体染色细胞，并按流评估转导效率（通常> 95％）。
注意：转导后K562细胞通常不需要分选，因为慢病毒系统通常会导致转导效率> 95％。

6）按照上面B2b.iii.7中所述的步骤，尽快冻结细胞，以2 x 10 6个细胞/小瓶的数量制备8至12个小瓶。

C.刺激测定
总览
在存在或不存在抗原或抗CD3抗体的情况下，将多达8种不同的5KC-TCR报告基因系（通过它们的荧光蛋白不同组合的表达鉴定）混合并与APC共培养。添加5KC-TCR细胞后18到32 h，流式细胞仪用于检测细胞刺激反应（以ZsGreen-1表达表示）。图18显示了刺激测定实验的时间表和板的设置示意图。

图18.刺激测定工作流程和板设置。A.刺激分析实验的时间表，从第0天解冻所有5KC-TCR报告基因细胞系及其对应的K562-APC细胞开始。刺激分析的建立时间不得早于5KC-之后的4天且不得晚于7天。TCR报告细胞被融化。添加5KC-TCR细胞后，应在18至32小时之间读取刺激分析板，以确保有足够的时间响应。B.第4天设置刺激板的工作流程。请注意，如果抗原是蛋白质而不是短肽，则在添加5KC-TCR报告细胞之前，应将K562-APC和抗原培养过夜。

对照：刺激TCR时，必须评估三个对照。
非激活细胞控制
在没有抗原或APC的5KC培养基中培养5KC-TCR细胞，以测定ZsGreen-1检测通道中非活化细胞的信号强度。之所以需要这种控制，是因为某些5KC-TCR细胞偶尔会对表达某些MHC分子而未添加抗原的APC作出反应。

无抗原控制
在没有抗原的APC存在下培养5KC-TCR细胞，并与用抗原和APC培养的细胞进行比较。

正控制
用抗CD3抗体刺激5KC-TCR细胞。抗CD3抗体刺激后，通常有80％以上的细胞表达ZsGreen-1。

在建立刺激试验前四天，解冻5KC-TCR细胞系和相应的K562-APC细胞系。如果需要，其他类型的细胞（例如自体B细胞）也可以用作APC。
注意：5KC-TCR细胞解冻后需要三到四天才能恢复功能，但是培养7天后开始失去T细胞功能。

在第0天，解冻冷冻细胞（对于5KC-TCR细胞，每个冷冻管大约1 x 10 6个细胞，对于K562-APC ，大约2 x 10 6个细胞）。
每天进行亚培养，以每毫升5 x 10 4个细胞的密度接种5KC-TCR系，以每毫升1 x 10 5个细胞的密度接种K562-APC系。
刺激5KC-TCR细胞。
通过离心收集K562-APC细胞，并以每毫升1 x 10 6个细胞的浓度重悬于5KC培养基中。添加50 μ升细胞悬浮液（的5 X 10 4个细胞）每孔到96孔圆底板中。
准备在抗原溶液5KC介质在4 X所需的最终浓度（例如，实现为100nM最终的抗原浓度，使400nm的溶液）。将50μl抗原溶液添加到含有APC的指定孔中。
在5KC介质中准备控制解决方案。
通过在5KC培养基中用PBS代替抗原来制备无抗原对照溶液。如果储备抗原包含有机溶剂（例如DMSO），请在无抗原对照溶液中包含相同浓度的溶剂。
对于非活化的细胞控制中，添加50微升的无抗原对照溶液和50微升5KC介质的至孔中。
对于无抗原对照，添加50 μ升的无抗原对照溶液和50微升的K562-APC的细胞悬浮液（5 X 10 4个细胞）到井。
在10制备阳性对照溶液μ微克/毫升功能级的抗CD3抗体（对于5 μ在5KC介质克/ ml终浓度）。向孔中加入100μl抗CD3阳性对照溶液。如果储备抗原包含有机溶剂，请在阳性对照溶液中包含相同浓度的溶剂。
将刺激板在37 °C ，5％CO 2下孵育2至4小时。
注意：如果抗原是蛋白质而不是肽，建议在添加5KC-TCR细胞之前过夜培养，以允许APC吸收并加工抗原以呈递。

准备5KC-TCR细胞混合物
在单独的试管中离心收集8个5KC-TCR细胞系（包含8种不同的荧光颜色组合）。
除去细胞沉淀上方的培养基，以1.6 x 10 6细胞/ ml重悬每行。
合并等体积的每条5KC-TCR品系（每毫升混合1.6 x 10 6个细胞，相当于每100个品系2 x 10 4个细胞 μ 1）。
加入100 μ每孔升5KC-TCR细胞混合物到刺激板。
将板过夜返回培养箱。
流式细胞仪
下述设置基于Beckman-Coulter Cytoflex激光器的405、488、638 nm激光束，但根据可用的流式细胞仪会有所不同。
添加5KC-TCR细胞后，在18到32小时之间收集刺激板的流式细胞仪数据。
为运行刺激板之前使用的所有荧光色设置补偿。
每种荧光蛋白都出现在通道中，如表10所示。

表10.荧光蛋白和相应的流式细胞仪通道

离心平板在671 × RC ˚F在室温下为3分钟。平稳地将介质从板中倾倒；沉淀的细胞应保留在孔的底部。在150重悬细胞μ升无酚红使用多道移液器RPMI。
使用配备有板载功能的流式细胞仪，每孔获取75,000个细胞的数据（足以获取至少3,000个表达每种颜色组合的5KC-TCR细胞）。
1）流动速率可以被设置100和120之间μ升上贝克曼-库尔特Cytoflex /分钟。
2）设置后150流式细胞仪停止采集μ升。

数据分析

A.将数据导入FlowJo进行分析。
B.根据图19所示的门控策略对单元进行门控。
确定每个孔中ZsGreen-1的阳性率，并将其导入Excel文件。确定FITC通道中信号强度高于未激活对照细胞中大多数信号（即> 97-99％）的信号的细胞被确定为ZsGreen-1表达阳性。

图19.用于确定混合物中每条5KC-TCR谱系响应水平的门控策略。使用FSC与SSC散点图选通活细胞后，可以将K562-APC由于缺乏颜色而从5KC-TCR细胞中排除。5KC-TCR细胞被门控在AM阳性和LO阳性细胞上。在AM和LO门控中，进一步对细胞进行次级颜色阳性（例如AM +和BFP +）门控，并基于非激活细胞对照确定的门控评估ZsGreen-1阳性。此图改编自Mann等人发表的文章。（2020）在《免疫学前沿》（doi 10.3389 / fimmu.2020.00633）中获得CC BY 4.0（https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）的许可。在该示例中，由AM + / BFP +识别的TCR细胞系对刺激呈正响应，如沿X轴的ZsGreen-1表达所示。

C.解释控件
未激活的细胞控制用于确定每个5KC-TCR线的基本ZsGreen-1信号水平，而无需刺激。
无抗原对照用于确定每个5KC-TCR品系的非抗原特异性刺激的反应水平。
没有抗原刺激的ZsGreen-1阳性细胞通常< 3％，并且不应超过10％。
混杂的TCR可能会对表达特定MHC分子的APC中存在的非目标抗原产生反应，从而导致高百分比的ZsGreen-1阳性细胞。
在没有抗原刺激的情况下，某些荧光识别剂组合与某些TCR可能导致更大的应答。如果> 10％的细胞对ZsGreen-1表达呈阳性，请考虑将TCR转导到具有不同识别荧光蛋白的报告细胞系上。
阳性对照用于确认TCR / CD3复合物已表达且具有功能。
CD3刺激细胞的正常反应是≥ 80％。
80％-60％的响应水平表明TCR不能很好地表达并且可能无法完全发挥作用。
≤60 ％的响应水平表明TCR不太可能起作用。
在确定抗原刺激孔中是否出现阳性反应之前，请确认未激活的细胞对照和没有抗原对照的反应水平足够低。

D.解释增产效果
根据以下公式计算刺激指数（SI）：

通过使用SI，减轻了非抗原特异性刺激的影响。

与SI井≥ 2重新考虑积极
SI越高表示响应越强

对于此应用程序（筛选大量反应），通常不执行进一步的统计分析。取而代之的是，在三个独立的实验中分别重新测试阳性的5KC-TCR细胞，以确认与在筛选测试中诱导ZsGreen-1表达的不同浓度抗原的反应性。使用T检验或ANOVA来比较这三个重复实验之间的ZsGreen-1阳性。

笔记

一旦收到合成的DNA片段，即可按照以下时间表在四天内完成载体的构建：
第一天：消化载体主链（对于TCR载体，使用CaP2AIII）并纯化DNA片段。[可选的断裂点：纯化的DNA片段可在-20 °C下保存数周。]进行Gibson组装反应。[可选的断裂点：吉布森装配反应可以在4 °C下保存最多5天。]
第2天：转化NEB5-α感受态大肠杆菌。[可选的断裂点：孵育过夜后，可将板包装并在4 °C下最多保存3天。]
第3天：种植小型培养物并进行PCR检查。[可选的断裂点，可以将小型培养物紧紧覆盖并在4 °C下保存2天。]开始对Qiagen Midi-prep进行大规模培养。
第4天：进行Qiagen Midi准备和载体测序。
连接亚基基因序列的猪破伤风病毒-1 2A裂解肽序列（P2A）包含一个N端Gly-Ser-Gly连接子，可提高自我裂解效率。

当使用通过QIAQuick凝胶提取试剂盒（Qiagen）纯化的DNA片段和载体时，我们建议在使用DNA片段进行Gibson组装之前，使用QIAQuick PCR纯化试剂盒（Qiagen）或Qiagen Minelute凝胶提取试剂盒（Qiagen）进行第二次纯化。第二次纯化去除了干扰Gibson组装反应的残留污染物，并且在需要时还可以进一步浓缩DNA片段。
为了获得最佳的转化效率，当将NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix（NEB）用于Gibson组装时，建议使用NEB 5-alpha感受态大肠杆菌（NEB）进行转化。
通过Sanger测序验证载体序列时，请确保载体序列与设计的框内核苷酸序列完全匹配，且无突变，这可能由于连接错误，PCR引入的突变或DNA片段合成错误而发生。如果发现突变，请选择另一个菌落进行Qiagen Midi制备和测序。确认序列正确的载体可直接用于细胞转染。
对于TCR载体的构建，骨架载体的选择由TRBJ基因决定。如果是TRBJ1-＃，则使用MBC1-null。如果是TRBJ2-＃，请使用MBC2-null。
当冷冻和解冻的细胞，我们推荐使用大口径的P1000的枪头，以尽量减少对细胞的机械应力（见Ë quipment列表）。
解冻后，保存的细胞的一小部分（<100 μ升），使1：1稀释用台盼蓝，并且计数在伯爵夫人II自动细胞计数器细胞。将活细胞数除以细胞总数即可获得细胞活力。
预期生存力≥90 ％

Phoenix-ECO细胞解冻后通常需要1-2天才能达到正常的细胞生长速度和条件。这可以通过以下方式协助：
使用较早的传代细胞数。
将解冻介质中的胎牛血清提高至20％。
解冻前用PDL处理培养皿，以帮助细胞粘附。
5KC α - β -和K562培养条件应开始之前的转染和程序进行优化。优化应包括：
手动检查和校准37 °C恒温箱的CO 2水平至5％CO 2以防止培养基酸化。
测试多（2或3）批次的FBS对细胞生长速率和状况的影响。亚特兰大生物制剂公司是推荐用于5KC细胞的FBS来源。
确定子培养条件维持健康5KC α - β -growth速率和条件。5KC α - β -细胞倾向于稀疏条件而不是致密的。通常，这需要每天拆分细胞培养物。
当细胞以5 x 10 4个细胞/ ml接种时，它们的倍增速率≤12小时。
使用倒置光学显微镜评估细胞状况。细胞应显得明亮，边缘光滑，呈圆形，偶尔有小气泡或小点。
K562生长条件应根据制造商的说明进行优化。在一般情况下，他们的成长速度低于5KC α - β -细胞，因此在更高的密度接种。当用倒置光学显微镜观察时，它们比5KC细胞看起来更大，更圆。
含CD3-载体（CD3-AM和CD3-LO）包含荧光蛋白基因，因为CD3不会被5KC表达α - β - TCR基因之前的细胞已被添加，因此荧光被用作标记物是细胞用载体转导。
而AM和LO在CD3转导的5KC表达α - β -细胞中，AM或LO基因是CD3基因盒的2.3kb的后面，从而在昏暗的荧光表达。以确保足够的荧光表达，AM和LO附加地，第二轮的转染和（的过程中引入作为FP标识符步骤B2c的，或图12，步骤2 ）。
添加荧光蛋白标识符后，在分选过程中会导致两个AM或LO阳性群体。细胞应按AM高或LO高排序，以确保它们已接收AM或LO FP向量（图16）。
在此步骤中生成的细胞应尽可能以最佳方式进行处理，并充分扩展以允许将许多（> 16）小瓶冷冻以备将来使用。在用于产生5KC-TCR细胞系或冻结其他小瓶之前，请避免长时间传代这些细胞系。
如果TCR表达不佳：
一些初级T细胞包含两条α链，通常是一条功能链和一条非功能链。当一组的两个TCR与两个α链共享相同的β链时，无功能的TCR可能不会被重建。
某些人的V- α和V- β区可能与要正确切割的小鼠信号肽区不兼容。用固有的人信号肽区序列代替小鼠信号肽区可以改善TCR表达。
我们不使用密码子优化的核苷酸来表达小鼠T-杂交瘤细胞嵌合TCR基因，5KC α - β -细胞，因为它是我们的经验是天然的核苷酸序列通常会导致更高的TCR / CD3表达比密码子优化序列。但是，密码子优化有时可能会改善某些TCR的TCR / CD3表达。
5KC和K562细胞都必须被视为好像它们在转导后脱落病毒颗粒（非复制）以进行三个完整的培养基交换。在BS 2级条件下，从转染到此刻进行所有细胞处理。
将PBS添加到培养板上的空孔中，以防止干燥气候下培养基的过度蒸发。在潮湿的气候下，这可能不是必需的。
除了K562-APC以外，各种类型的细胞都可以用作刺激试验中的APC。实例包括用爱泼斯坦-巴尔病毒转化的自体B细胞系，辐射的自体外周血单核细胞和从自体外周血细胞分离/繁殖/分化的树突状细胞。需要针对每种类型的APC优化APC浓度。
对于流量分析，FSC与SSC散点图用于门控活细胞。我们已经在我们的测定条件下测试了活/死染色，并且与使用FSC与SSC门控相比，它不会显着影响表达ZsGreen-1的细胞的百分比。如果计划分选ZsGreen-1阳性细胞用于后续实验，我们建议使用活/死染色（如Zombie NIR染料）以提高分选细胞的纯度。

菜谱

转染培养基
快速流动无菌一次性过滤器（纳尔金）

DMEM（Gibco）500毫升
HEPES缓冲液，1 M（Gibco）5 ml
丙酮酸钠100 mM（Gibco）5毫升
MEM-NEAA，100x（Gibco）5毫升
2-巯基乙醇，14.3 M（西格玛- Aldrich）的5 μ升
合并所有成分，然后过滤消毒

在4 °C下保存最多1周

5KC中
IMDM（Gibco）中1 ，000毫升
FBS（亚特兰大生物制剂）100毫升
笔/链球菌（Sigma - Aldrich）10毫升
2-巯基乙醇，14.3 M（西格玛- Aldrich）的10 μ升
在4 °C下保存最多2周

凤凰中等
DMEM（Gibco）500毫升
FBS（亚特兰大生物制剂）50毫升
笔/链球菌（Sigma - Aldrich）5毫升
HEPES缓冲液，1 M（Gibco）5 ml
丙酮酸钠100 mM（Gibco）5毫升
MEM-NEAA，100x（Gibco）5毫升
2-巯基乙醇，14.3 M（SIGM - Aldrich）的5 μ升
在4 °C下保存最多2周

5KC冷冻介质
准备好的5KC培养基70％
FBS（亚特兰大生物）20％
DMSO（Fisher Bioreagents）10％
混合足够的试剂，每个小瓶1毫升进行冷冻

通过0.2滤波器μ米针筒式过滤器，并立即使用

无酚红RPMI
RPMI 1640，无酚红（Gibco）500毫升
FBS（亚特兰大生物制剂）10毫升
笔/链球菌（Sigma - Aldrich）5毫升
丙酮酸钠100 mM（Gibco）5毫升
MEM-NEAA，100x（Gibco）5毫升
2-巯基乙醇，14.3男，（西格玛- Aldrich）的5 μ升
在4 °C下保存最多2周

硫酸鱼精蛋白5 mg / ml溶液
硫酸鱼精蛋白粉（MP Biomedicals）10 mg
分子生物学级水（HyClone）2毫升
溶解粉末并过滤通过量ħ0.2 μ米过滤接ř

分装并在-20 °C下保存长达一年

PDL，0.1毫克/毫升
PDL冻干粉（Sigma - Aldrich）5毫克
分子生物学级水（HyClone）50毫升
向PDL粉末瓶中添加无菌细胞培养级水，并摇动直至粉末溶解。转移至50 ml锥形瓶中，并在4 °C下保存最多2个月。

LB氨苄青霉素肉汤
LB肉汤（Gibco）

氨苄西林现成溶液（Sigma - Aldrich）

1 μ氨苄青霉素的L是在使用前立即每1ml LB肉汤中加入

在4 °C下存储最多2个月

LB-氨苄西林板
LB琼脂（BD Difco）20克
Milli-Q超纯水（Millipore-Sigma）500毫升
10厘米的P ETRI培养皿（费舍尔b RAND）〜25
将LB琼脂完全溶解在水中，并在121 °C下高压灭菌20分钟

一旦琼脂冷却至约55 ℃下，加入500 μ升氨苄青霉素，倒入板

在4 °C下保存最多1个月

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院（R01DK099317，R01DK032083，P30CA046934，P30DK116073），JDRF（2-SRA-2018-480-SB，1-SRA-2020-911-AN）和库尔肖家庭初级研究者奖的支持。该协议的开发和验证已在先前的出版物中进行了描述（Mann等，2020）。用于产生慢病毒载体pUS的慢病毒载体pMH0001是乔纳森·韦斯曼（Jonathan Weissman）的礼物（Addgene质粒＃85969；http：//n2t.net/addgene：85969； RRID：Addgene_85969）。逆转录病毒载体鼠CD3WTdelta-F2A-γ-T2A-ε-P2A-zetapMIA II用于产生逆转录病毒载体CD3-LO，是Dario Vignali的礼物（Addgene质粒＃52093; http：// n2t .net / addgene：52093 ; RRID：Addgene_52093）。

竞争我nterests

作者声明没有利益冲突或利益冲突。

参考文献

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