材料和试剂
1.玻璃棉（HIME DIA，目录号：RM1232）
2. 50 ml猎鹰管（TARSONS，目录号：546021）
3. 1.5 ml Eppendorf管（TARSONS，目录号：500010）
4. 200 µl和1 ml移液器吸头（TARSONS，目录号：521010和521020）
5.显微镜载玻片（LABTECH，目录号：217101）和盖玻片（蓝星，22 mm 10 g）
6. 60 x 15毫米培养皿
7.秀丽隐杆线虫菌株，N2（野生型）（明尼苏达州CGC）
8.大肠杆菌OP50（明尼苏达州CGC）
9.尼罗河红（Sigma，目录号：72485-100MG）
10.甲醇（Fisher Scientific，目录号：43637G）
11. KH 2 PO 4
12. K 2 HPO 4
13.硫酸镁4
14.氯化钙2
15.胆固醇
16.乙醇
17.氯化钠
18.蛋白ept
19.琼脂
20. Na 2 HPO 4
21.胰蛋白p
22.酵母提取物
23.家用漂白液
24. KPO 4 （1 M）（请参阅食谱）
25. MgSO 4 （1 M）（请参阅食谱）
26. CaCl 2 （1 M）（请参阅食谱）
在95％乙醇中的27. 5 mg / ml胆固醇（请参阅食谱）
28. NGM板（请参阅食谱）
29. M9缓冲区（请参阅食谱）
30.尼罗河红溶液（请参阅食谱）
31. LB汤（请参阅食谱）

设备

剪刀
T20，T200和T1000移液器（TARSONS，目录号：030020; 030040; 030050）
锥形烧瓶（BOROSIL，目录号：4100029）
Marter and Pestle（Thermo Scientific，目录号：533669）
解剖立体显微镜（NIKON，型号：SMZ 1000）
20 °C线虫培养箱（SANYO，冷却培养箱，型号：MIR 554）
带振荡器的37°C细菌培养箱（SCIGENICS BIOTECH，ORBITEK，LETTD）
涡旋混合器（DLAB，MX-S，8031102000）
高压釜（EQUITRON，立式高压釜）

软件

Microsoft Excel

程序

截短线虫的截短玻璃棉原料的制备
将30 ml的M9缓冲液倒入50 ml无菌F alcon管中，并加满玻璃棉。
用剪刀将玻璃棉切成碎片，并确保玻璃棉浸入缓冲液中，以免细小的玻璃碎片在空中漂浮。
继续切割玻璃棉，直到其体积达到5毫升（如图1所示），然后将路线截断的玻璃棉块与M9缓冲液一起转移到杵和杵中。

图1.截断/研磨后，将截断的玻璃棉碎片转移到无菌的50 ml F alcon管中

研磨20分钟使其细腻，以进一步伤害小型模型秀丽隐杆线虫。
研磨后，将截短的玻璃棉片转移到新的50 ml F alcon管中，并在121处对其进行高压灭菌。 °C 20分钟。
高压灭菌后，将其保存在室温下，并确保在每次伤口处理之前对玻璃棉进行高压灭菌，以免污染并确保秀丽隐杆线虫的无菌伤口。

蠕虫的制备
通过将等重量的雌雄同体暴露于等体积的5 M KOH和家用漂白液（1：1比例）中以50 S进行漂白，并将卵转移到经过两次M9洗涤后接种有大肠杆菌OP50的线虫生长培养基（NGM）板上通过在离心3 ，500 X克1米英寸
在20°C下孵育平板，直到蠕虫到达成年阶段（约2.5天）。去之前为伤人线虫，收集在蠕虫一个1.5米升使用M9缓冲板Eppendorf管通过洗涤。

秀丽隐杆线虫的玻璃棉伤
通过使用1 ml移液管吸头和dd 5 µl尼罗红（1％）轻轻移液，将1.5 mg高压灭菌的截短的玻璃棉碎片转移到1.5 ml的Eppendorf管中，通过轻轻混合将其划伤玻璃棉伤处。
通过移液尽可能除去M9的含量，并在玻璃碎片上方添加等体积的成年幼虫。
将试管直接放在涡旋混合器上，严格涡旋1分钟。定期旋转试管以在涡旋过程中覆盖所有蠕虫。
在处理更多数量的蠕虫时，请使用另一个Eppendorf管进行伤口处理，以免增加未伤害蠕虫在繁殖种群中所占的比例。
最多使用100 µl蠕虫，每管中的蠕虫数量超过5,000，000 ，并确保使用1.5 ml Eppendorf管以成功感染秀丽隐杆线虫。

受伤后恢复蠕虫
请根据需要按照以下步骤恢复受伤后的蠕虫。
恢复受伤的蠕虫，进行显微成像
涡旋伤后，在Eppendorf管壁上加入500 µl M9，不要干扰蠕虫。
然后，通过移液（T20移液器）将搁在玻璃碎片上方的蠕虫转移到载玻片上，并用盖玻片覆盖。
可视化立体显微镜下的蠕虫和通过微分损伤的由尼罗的应用红色红色如图中spoted站点得分受伤蠕虫˚F IG URE 2 。

FIGUR ê 2 。玻璃棉伤口蠕虫不受控制。未受伤的蠕虫，皮层完整（左）；用箭头标记（右）所示的截短的玻璃棉刺穿可导致受伤的蠕虫。小号ç强麦条表示100微米。

回收受伤的蠕虫以进行高通量分析
涡旋伤后，加入1 ml M9，然后用T1000移液器轻轻移液。
让蠕虫在玻璃碎片上方沉降，并重复两次，以清除尼罗河红和插入的玻璃棉碎片。
清洗后，让蠕虫静置，并通过点胶将它们全部转移到新的Eppendorf管中。
使用带有T1000移液器的切边尖端来处理和清洗玻璃棉受伤后的蠕虫。

数据分析

伤口处理后，在显微镜下对蠕虫的受伤，未受伤和崩解进行评分。
以一式三份收集分数，以确保获得> 75％的受伤，< 20％的未受伤和< 5％的崩解蠕虫作为平均值，误差为± 5％。
使用公式（N棕土受伤蠕虫/总数量在滑动蠕虫）* 100计算受伤蠕虫％。
使用Excel计算标准的一种方式的NOVA的统计评估。

笔记

在准备和操作玻璃棉时，必须戴好手套和口罩（必修）。
确保将截短的玻璃棉片浸入缓冲液中，以免其漂浮在空气中。
在每次受伤之前，都要对高压灭菌的玻璃棉进行高压灭菌，以确保无菌。
由于该方法仅对成虫可靠，且蠕虫的大小最大（1毫米），因此请确保蠕虫的阶段为成年或成年。
对于幼虫动物的伤害，可以使用细玻璃棉粉。
研究中的尼罗河红用作有色溶液，有助于局部定位和损伤深度。另外，可以在该场所使用任何濒死剂。但是，建议使用尼罗河红以提高秀丽隐杆线虫的玻璃棉伤痕的可追溯性。在显微镜观察的情况下，最好使用尼罗红，因为对于高通量分析而言，直接征服受伤的人群可以忽略尼罗红。
确保用玻璃棉涡旋所花费的时间不超过1分钟，因为伤害深度随涡旋所用时间的增加而增加，如图3所示。

图URE 3 。蠕虫在不同的时间点都受到涡流的伤害。涡旋1，3，5，7和10分钟被表示为W 1 ，W 2 ，W 3 ，W 4和W 5分别为，在图中。

完成工作后，确保用湿棉布擦拭工作空间，以清除所有溢出的细小玻璃片。

菜谱

1. KPO 4 （1 M）
为100毫升，添加10.8克KH的2 PO 4 3.6克ķ 2 HPO 4在121向上并使其到100毫升，高压灭菌℃下20分钟

2. MgSO 4 （1 M）
对于100毫升，添加12克MgSO 4并加至100毫升，在121 °C下高压灭菌20分钟

3.氯化钙2 （1 M）
对于100毫升，添加11克CaCl 2并补足至100毫升，在121 °C下高压灭菌20分钟

4.在95％乙醇中的胆固醇含量为5 mg / ml
DIS小号olve 5毫克的胆固醇在95％乙醇

5. NGM板小号
通过在锥形瓶中加入3 g NaCl，2.5 g蛋白ept和17 g琼脂来制备板
中号AKE体积达1升，用去离子水
内容物在121 °C高压灭菌20分钟，一旦达到1毫升，则添加1毫升1 M CaCl 2，1毫升1 M MgSO 4，1毫升5 mg / ml乙醇中的胆固醇和25毫升1 M KPO 4 。容许温度
充分混合后，将NGM溶液分配到60 x 15 mm培养皿的2/3中。让板以固化，并与种子他们E.大肠杆菌OP50食物源（一个制霉菌素和链霉素ddition建议制备期间NGM的避免污染）
用于接种目的，使用200μ升的大肠杆菌OP50培养物（OD = 0.5）在LB肉汤中生长，并在37°C孵育过夜板（小号撕开板在4℃下用于以后使用）
6. M9缓冲区
˚F或1 ，000毫升，添加KH 3克2 PO 4 ，6克的Na 2 HPO 4 ，5g的氯化钠0.25g的硫酸镁的4 · 7H 2 O和补足体积至1 ，000毫升用去离子水，高压灭菌器在121 ℃下进行20分钟

7.尼罗河红溶液
将10毫克的尼罗红溶于1毫升的无水甲醇中

8. LB汤
对于100 ml，加入1 g胰蛋白,、 0.5 g酵母提取物，1 g NaCl，并用去离子水补足至100 ml，在121 °C高压灭菌20分钟。

致谢

作者感谢秀丽隐杆线虫遗传学中心，该中心由美国国立卫生研究院，国家研究资源中心提供，用于提供线虫菌株。国会议员感谢ITC-LSTC班加罗尔以ITC项目研究员的形式提供的财政援助。印度政府科学技术部（DST）通过DST PURSE [授权号SR / S9Z-415 / 2010/42（G）]，DST FIST [授权号SR / FST / LSI-639]提供的仪器设施/ 2015（C）]，UGC通过SAP-DRS1 [授权号F.5-1 / 2018 / DRS-II（SAPII）]和RUSA 2.0 [授权号F. 24-51 / 2014-U，政策（ TN Multi-Gen），美国爱丁堡州立大学]表示感谢。

利益争夺

作者宣称没有竞争利益可以披露。

参考文献

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Pooranachithra，M.，Bhaskar，JP，Murali，D.，Das，SS，JebaMercy，G.，Krishnan，V.和Balamurugan，K.（2019）。使用秀丽隐杆线虫作为潜在的预筛选伤口模型，阐明吡啶甲酰胺肟的伤口愈合能力和作用方式。生命科学235：116859。
Pujol，N.，Cypowyj，S.，Ziegler，K.，Millet，A.，Astrain，A.，Goncharov，A.，Jin，Y.，Chisholm，AD和Ewbank，JJ（2008）。对秀丽隐杆线虫表皮的感染和伤口有不同的先天免疫应答。Curr Biol 18（7）：481-489。
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