材料和试剂
50毫升的无菌ëErlenmeyer烧瓶（DWK生命科学，杜兰® ，目录号：2121617）
5毫升无菌硼硅酸盐管（IVA ® ，目录号：VID-01548）
1.5 ml无菌Eppendorf离心管（Eppendorf，目录号：022364111）
2-20微升，20-100微升，100-1,000微升卡特尔pluripet微量（卡特尔实验室器皿，产品目录号：13000，13210，13220）和1-10毫升讴歌®手册微量（SOCOREX瑞士，目录号：835分之825）
无菌的枪头1-200微升，100-1 ，000微升（康宁® ，目录号：S4860，S9032）
无菌50、100和1,000 ml硼硅酸盐量筒（VILABO ，目录号：3501114、3501115、3501118）
无菌培养皿玻璃板（直径80毫米）（品牌® ，目录号：BR455732）
细菌菌株鼠伤寒沙门氏菌（LT2），大肠杆菌K12，铜绿假单胞菌（PA O1）和金黄色葡萄球菌（ATCC 29213）
中性洗涤剂（EXTRAN ® ，默克，目录号140000）
Milli -Q水
丙酮（Merck，目录号67-64-1）
异丙醇（默克（Merck），目录号3979-51-9）
四氯化钛（Merck，目录号7550-45-0）
普朗尼克® F-127（Sigma-Aldrich公司，目录号9003-11-6）
普朗尼克® P-123（羰合成器，目录号9003-11-6）
玻璃载片（YEGREN ® ，目录号：7101）
防护眼镜（Merck，目录号C9056-1CS）
细胞培养板（Sigma公司® ，目录号SIAL0516-50EA）
塑料盒（15厘米x 20厘米x 5厘米）
纸巾（WypAll * X 60 Jumbo Roll，KCWW，Kimberly-Clark，货号：30218593）
接种环（Decon TM ，目录号：MP 19025）
甘油用于分子生物学，≥ 99.0％（S IGMA-Aldrich公司，目录号：G5516-500ML）
蒸馏水（G-BIOSCIENCES，目录号：786-1713）
浸油（莱卡，STANDAR和“F”型，CAS号：195371-10-9）
胰蛋白（（OXOID，目录号：LP0042）
酵母提取物（默克，目录号：103753）
琼脂粉（Difco ，目录号214530）
氯化钠（NaCl的）（Biopack ，目录号：1646.08）
SYTO TM 9绿色荧光核酸染料（Invitrogen，目录号S34854）
碘化丙啶（Invitrogen，货号P1304MP）
LB培养基（请参阅食谱）
LB琼脂固体培养基（请参阅食谱）
4 M NaCl溶液（请参阅配方）
盐溶液（请参见食谱）
染色SYTO 9 / PI解决方案（请参见食谱）
二氧化钛中晶结构薄膜涂料（s配方）

设备

50 ml锥形瓶
接种环
常规培养箱振荡器（New Brunswick Scientific Co.，INC，型号：G25）
紫外可见分光光度计（Biotraza ，型号：752）
高压灭菌器（平山HICLAVE TM ，型号：HVE-50）
热风烤箱消毒器（Dalvo Instrumentos ，型号：OHR / T）
涡流（Velp，型号：ZV3，201251076）
落射荧光显微镜（Olympu s ，型号：BX51）
孵化炉（Precision，Scientific Group，型号4，目录号：31483）
本生灯（Eisco TM ，目录号CH0091B）
使用Nanodrop 2000（热科学，纳米滴® ，目录号：ND-2000）
冷冻离心机（Hanil Scientific，型号：Combi 514R）
旋涂机（劳雷尔技术公司，型号：WS-650-23B）

程序

图1显示了整个实验过程的示意图。

图1.实验过程的示意图

薄膜包衣的细菌培养
鼠伤寒沙门氏菌（LT2），大肠杆菌K12，铜绿假单胞菌（PAO1）和金黄色葡萄球菌（ATCC 29213）菌株在液氮中的甘油库存中保持。通过倒置或涡旋混合130毫升无菌甘油和770毫升5毫升过夜细菌培养液（在37℃下于50毫升无菌锥形瓶中于LB培养基中生长）来制备储备液。
通过在培养皿中倒入25 ml LB琼脂培养基来准备新鲜的LB琼脂平板。固化后，将其打开并在55°C的炉中倒置至少30分钟，使其干燥。
板BA cteria与来自甘油储备无菌接种环在固体LB平板上，并在温育炉生长过夜它们在37℃下。
吸取5 ml LB到50 ml无菌锥形瓶中。然后，通过使用接种环，从LB培养基板中挑选菌落，并在液体LB培养基中摇动环。在培养箱摇床上摇动（200 rpm），在37°C下过夜生长。要在无菌条件下工作，请在整个过程中始终打开本生灯。
使用分光光度计检查OD 650 （1 OD 650 = 10 8 CFU / ml）。
取等分过夜培养物，并在新的50 ml无菌锥形瓶中的10 ml无菌盐水溶液中稀释，以达到1 x 10 6 CFU / ml。要在无菌条件下工作，请在整个过程中始终打开本生灯。
放置在细胞培养板的膜涂覆的玻璃基板，并添加300 μ细菌悬浮液的升膜的表面上，避免了膜的漏出。在整个孵育时间内，接种物应留在涂层表面。
将细胞培养板放在装有湿纸的塑料盒中，以形成一个加湿室。
在孵育箱中于37°C孵育24 h，不要摇晃。
将液体重新悬浮在薄膜表面上，以捕获可能附着在表面上的细菌，从而从培养物中回收接种物。放入1. 5 ml无菌Eppendorf管中。

可行性评估
计数菌落形成单位（CFU）

从培养液中在膜表面（2,000 rpm）涡旋振荡数秒钟，使细菌悬浮液涡旋旋转。
使悬浮液的系列稀释液（10 -1 ，10 - 2 ，10 -3 ，10 -4 ）。为此，添加50 μ的初始悬浮液的升承载450中的无菌硼硅酸盐玻璃管μ的盐水溶液中并涡旋混合它升。然后取50 μ第一稀释10的升-1并传递到一个新的管450 μ的盐溶液升，依此类推，直到10倍-4稀释液。在连续稀释之前短暂涡旋。
从每种稀释液中取20 µl，倒入无菌干燥的LB固体培养基板中。等待液滴被琼脂吸收，然后翻转板。
在37°C的孵育炉中孵育平板24小时。可以修改此孵育时间，以评估其他时间点的细菌存活率。
计数每种稀释液在LB琼脂平板上形成的凝胶数。仅应考虑每滴含约3-30个菌落的平板。
总CFU / ml的计算如下：将对应于每个液滴×稀释系数x总体积（1菌落数，000微升）/体积铺板（20微升）。统计分析至少需要三张独立的电影和三个独立的实验。
死或活染色

离心的细菌悬浮液从上薄膜表面孵育回收在8000 ×g下在室温下10分钟。从上清液中分离沉淀。
重悬沉淀用500微升在8盐溶液和离心机，000 ×g下进行10分钟。丢弃上清液。
将沉淀重悬于200 µl SYTO 9和PI染色溶液中。
在室温下于黑暗中孵育15分钟。
地点50 μ升在载玻片染色悬浮液并用盖玻片覆盖。
在带有100倍物镜和浸没油的荧光显微镜下可视化。
每个样本至少拍摄6张代表性照片。

DNA定量

在室温下以20,000 xg离心从膜表面孵育5分钟后回收的细菌悬浮液。
回收上清液并将其置于新的1.5 ml无菌Eppendorf管中。
地方1 μ在上清液的升纳米滴来测量DNA浓度。在260/280 nm处读取。统计分析至少需要三张独立的电影和三个独立的实验。

数据分析

作为所述方法的一个实例，显示了鼠伤寒沙门氏菌上的介孔结构的二氧化钛薄膜涂层的抗菌活性的结果（Scilletta et al。，2019）。为了这个目的，混合二氧化钛的普朗尼克介孔薄膜是由溶胶-凝胶法的组合合成与蒸发诱导的自组装的的普朗尼克胶束，根据在文献中描述的方案（Crepaldi等人，2003; Soler- Illia等，2011）。简而言之，通过旋涂将薄膜沉积在玻璃基板上，从具有无机前体（TiCl 4 ）和Pluronic模板的水/酒精酸性溶液开始。使用的Pluronic F127和普朗尼克P123，和的系统变化的二氧化钛：P luronic摩尔允许调制比中间相结构。实际上，Pluronic P123的分子量实际上只有Pluronic F127的一半。

注意：图2、3和4中显示的数据已在Scilletta等人的文章中报道。（2019）。

在表面孵育24小时后评估细菌生存力（图2 ）。结果表明，杂化涂料具有杀菌活性，而二氧化钛对照薄膜（不含Pluronic ）没有抗菌活性。确实，数据证明，对Pluronic F127和P123而言，模板的调节量均达到一调整量。此外，在Ti ：Pluronic比的极端情况下，表面变得略微活跃。

图2.该介孔结构表面的杀菌活性：普朗尼克F127（A）和普朗尼克P123（B）加载的薄膜具有表面活性剂的变化的浓度用10攻击6 CFU毫升-1的鼠伤寒沙门氏菌。通过将24小时时的CFU除以初始时间来计算24小时后细菌的存活分数。ND：不可检测。[转自Scilletta等。（2019 ）并得到Elsevier的许可]。

涂层对细菌膜的影响的分析表明，细菌膜的完整性被大大破坏，因此细菌在装有Pluronic F127杂化涂层的涂层上孵育后死亡。然而，他们仍然主要完好时，他们在孵育的Pluronic -free二氧化钛膜（图3 ）。

图3.细胞膜完整性：接种无F127的薄膜（A）和装有F127的薄膜（B）24小时后，鼠伤寒沙门氏菌细菌悬浮液的荧光显微镜图像。膜受损的细菌用红色标记，细胞完整的膜用绿色标记。比例尺代表10μm 。[转自Scilletta等。（2019）。

存在于所述细菌悬浮液在温育后的DNA的Pluronic -loaded膜支持在存活分数和显微术分析上观察到的结果细胞膜破坏引起的由这些介观结构的表面（图4 ）。

图4.在表面孵育后，鼠伤寒沙门氏菌细菌悬液中存在的DNA量。t检验，P <0.005，*与不含F127的涂层显着不同。[转自Scilletta等。（2019）。

菜谱

LB培养基
溶解：
10克胰蛋白p

5克酵母提取物

5克氯化钠

用蒸馏水将体积调至1,000 ml
在1atm高压灭菌20分钟
LB固体培养基
溶解：
10克胰蛋白p

5克酵母提取物

5克氯化钠

15克琼脂

用蒸馏水将体积调至1,000 ml
在1atm高压灭菌20分钟
4 M氯化钠
将46.7 g NaCl溶于200 ml蒸馏水
在1atm高压灭菌20分钟
生理盐水
将7.5 ml无菌4 M NaCl与300 ml无菌蒸馏水混合

染色SYTO 9 / PI解决方案
0.7 μ升的5毫SYTO 9（原液;储存在-20 ℃下从光保护）

26 μ升0.77毫PI（原液;储存在4 ℃下从光保护）

1 ，000毫升蒸馏水

为每个实验准备新鲜

实验过程中，溶液可以在室温下避光保存

二氧化钛介晶薄膜的玻璃涂层
洗涤显微镜载物片（26毫米×20毫米，X 1毫米），中性洗涤剂，然后漂洗依次用中号我升LIQ水，丙酮和异丙醇
从TiCl 4 /乙醇溶液（1:40）开始，添加Pluronic F127或Pluronic P123和水以达到TiCl 4 ：乙醇：H 2 O：Pluronic当量的最终组成t 1：40：10：S摩尔比。S在0.0025和0.02摩尔比之间变化
在2500 rpm，35 °C和15％的相对湿度下进行旋涂
将胶片放在相对湿度为50％的室内24小时
执行固结热处理，包括在60°C，130°C和180°C下1 h的三个连续步骤

致谢

NAS感谢CONICET授予的博士奖学金。MP是CNEA和CONICET的成员。MFD，GJAAS-I，MGB和PNC是CONICET的成员。这项工作得到了阿根廷CONICET（PIP 561）和ANPCYT（PICT-2016-0647和PICT-2016-1781）的支持。

菌落形成单位的计数过程基于Merritt，Kadouri和O'Toole的先前方案（Merritt等人，2006）。用于膜完整性评估的活/死染色方法是Smith和Hunter （2008）发表的方案的修改。细胞外DNA的定量基于Chen和Cooper （2002）先前的方案。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考文献

Chen CZ和Cooper SL（2002）。树状大分子杀生物剂和细菌膜之间的相互作用。生物材料23 （16）：3359-3368。
Crepaldi，EL，Soler-Illia，GJ，Grosso，D.，Cagnol，F.，Ribot，F.和Sanchez，C.（2003）。受控形成的高度组织化的介孔二氧化钛薄膜：从介孔结构的杂化物到介孔纳米锐钛矿TiO 2 。J Am Chem Soc 125（32）：9770-9786。
Mateescu，M.，Baixe，S.，Garnier，T.，Jierry，L.，Ball，V.，Haikel，Y.，Metz-Boutigue，MH，Nardin，M.，Schaaf，P.，Etienne，O.和Lavalle，P.（2015年）。基于抗菌肽的凝胶，可防止医疗植入设备感染。PLoS One 10（12）：e0145143。
Merritt，JH，Kadouri，DE和O'Toole，GA（2005年）。生长和分析静态生物膜。Curr Protoc Microbiol第1章：单元1B 1。
斯凯莱塔（Scilletta，NA），佩佐尼（M. 通过上层结构调整将惰性纳米聚合物转变为广谱杀菌剂。胶体表面B 178：214-221。
Smith，K.和Hunter，IS（2008）。普通医院杀菌剂对具有多重耐药性临床隔离株生物膜的功效。微生物医学杂志57（Pt 8）：966-973。
Soler-Illia，GJ，Angelome，PC，Fuertes，MC，Calvo，A.，Wolosiuk，A.，Zelcer，A.，Bellino，MG和Martínez，ED（2011年）。中孔杂化和纳米复合薄膜。溶胶-凝胶工具箱，用于创建具有局部化学性质的纳米受限系统。溶胶凝胶科学技术57（3）：299-312。
袁Z.，欧阳P.，顾K.，Rehman，T.，张T.，尹Z.，傅，H.，林J.，何C.，舒G. Liang X.，Yuan Z.，Song，X.，Li，L.，Zou，Y. and Yin，L.（2019）。冬凌草甲素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的抗菌机制。药物生物学杂志57（1）：710-716。